Summary
يتم تقديم بروتوكول باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية لتوليف مجموعه من البكتيريا البيولوجية البكتيرية لتحليل بقايا الطلقات النارية ، واختبار أداء الاجهزه لاستخدامها المقصود باستخدام الطيفية الفلورية.
Abstract
Microbocop هو هو استشعار التي تم تصميمها لتطبيق فريد من نوعه في الكيمياء الشرعية. MicRoboCop هو نظام يتكون من ثلاثه أجهزه التي ، عند استخدامها معا ، يمكن ان تشير إلى وجود بقايا الطلقات النارية (GSR) عن طريق إنتاج اشاره مضان في وجود ثلاثه التحاليل الرئيسية (الإثمد ، والرصاص ، والمكونات العضوية من GSR). ويصف البروتوكول توليف الاجهزه البيولوجية باستخدام القولونية (كولاي) ، وأساليب الكيمياء التحليلية المستخدمة لتقييم الانتقائية وحساسية المستشعرات. ويتجلى أداء النظام باستخدام GSR الذي تم جمعه من داخل غلاف خرطوشه مستهلكه. وبمجرد الاعداد ، يمكن تخزين العناصر البيولوجية حتى الحاجة ويمكن استخدامها كاختبار لهذه التحاليل الرئيسية. وتوفر الاستجابة الايجابيه من جميع التحاليل الثلاثة اختبارا إيجابيا افتراضيا لهذه الاداه ، في حين ان كل جهاز علي حده لديه تطبيقات للكشف عن التحاليل في عينات أخرى (مثل كاشف للتلوث بالرصاص في مياه الشرب). والقيد الرئيسي لهذا النظام هو الوقت اللازم للاشاره الايجابيه ؛ قد يتضمن العمل المستقبلي دراسة الكائنات الحية المختلفة لتحسين وقت الاستجابة.
Introduction
الجهاز الحيوي هو اي أداه تحليليه تستخدم المكونات البيولوجية (مثل البروتينات أو الأحماض النووية أو الكائنات الحية الكاملة) التي تنتج الاستجابة التي يمكن استخدامها للكشف عن ماده كيميائية أو تحليليه. وكمثال علي ذلك ، استخدمت صناعه تعدين الفحم البيولوجي لفتره طويلة من القرن العشرين للكشف عن وجود غازات ألغام السامة: الكناري في منجم الفحم1. وقد لاحظ عمال المناجم استجابه الكائن البيولوجي (الوفاة أو الكرب) لماده كيميائية (أول أكسيد الكربون) من أجل حماية العمال. في مثال أكثر حداثة وتطورا ، يمكن تغيير البكتيريا باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية للرد علي وجود تحلل كيميائي معين من خلال إظهار استجابه محدده ، مثل التعبير عن بروتين فلوري.
البيولوجيا التركيبية عبارة واسعه النطاق تشير إلى بناء الاجهزه والنظم البيولوجية التي لا توجد بشكل طبيعي ، أو أعاده تصميم النظم البيولوجية القائمة لغرض محدد2. وتتميز البيولوجيا التركيبية بالهندسة الوراثية بمنهجيه قياسيه وبوجود أجزاء موحده (عناصر وراثيه لعلم الاحياء التركيبية القياسية) يمكن استخدامها لتوليف الاجهزه والنظم. يتم إدخال جزء في جينوم الجهاز ، كائن حي مثل البكتيريا ، للتعبير عن سمه معينه من شانها ان تكون بمثابه مؤشر علي وظيفة. علي سبيل المثال ، في العديد من الاجهزه الاصطناعية ، يتم إدخال التعبير عن البروتين الفلوري في كائن واحد الخلية كبروتين مراسل. يمكن دمج أجهزه متعددة في نظام. الجينوم من الكائنات المجهرية مثل البكتيريا من السهل التلاعب بها بهذه الطريقة. وقد ابلغ عن العديد من الامثله علي المواد البيولوجية المحددة لمجموعه واسعه من التحاليل الكيميائية في الأدبيات علي مدي العقد الماضي3,4.
وفي هذا العمل ، يقدم نظام MicRoboCop كمثال علي الاستشعار البيولوجي أو المصمم باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية مع تطبيقات جديده في الكيمياء الشرعية والبيئية. MicRoboCop هو نظام من ثلاثه أجهزه منفصلة ، عندما مجتمعه ، وسوف تسمح القولونية للتعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (العطاء) في وجود بقايا طلقات ناريه (GSR) التي تم جمعها من ايدي الشخص أو سطح. كل من الاجهزه الثلاثة يستجيب للتحليل الكيميائي المحدد الذي يعرف بأنه مكون من GSR5. التحاليل الثلاثة التي يستجيب لها النظام هي I. 2 ، 4 ، 6-ترينيتروولويني (TNT) والمركبات ذات الصلة ، ثانيا. الرصاص (في شكل أيونات الرصاص) ، وثالثا. الإثمد (أيضا في شكل أيونات).
GSR يتكون من العديد من المواد الكيميائية المختلفة ، ولكن الثلاثة عاده ما تستخدم لتحديد بقايا كما GSR هي الباريوم ، الرصاص ، والإثمد5. اختبار الادله القياسية لتحديد GSR هو استخدام المجهر الكترون المسح الضوئي (SEM) مع التشتت الطاقة الاشعه السينية فلوري (EDX)5. تسمح SEM-EDX للمحللين بتحديد الشكل الفريد والمكونات العنصرية لل GSR. في الحاضر ، هناك عدد قليل من الاختبارات الافتراضية الثنائية المستخدمة علي نطاق واسع المتاحة. ويستخدم أحد الاختبارات الافتراضية التي نشرت مؤخرا التحليل الطيفي للتنقل الأيوني (IMS) ، وهو معدات متخصصة قد لا تكون متاحه في العديد من المختبرات6. وهناك أيضا عدد قليل من ألوان "بقعه" الاختبارات التي يمكن استخدامها ، علي الرغم من انها تستخدم عاده لتحديد المسافة أو لتحديد GSR علي ثقوب الرصاصة والجروح5. بالاضافه إلى ذلك ، كان هناك بعض الاهتمام المحدود في الأدب إلى الاختبارات الكهروكيميائية ل GSR التي توظف تحليل فولتاممتري ، والتي لديها ميزه احتمال كونها الميدانية المحمولة ، أو انوديك تجريد voltammetric ، وهو غاية طريقه حساسة للعناصر المعدنية7. وهناك القليل جدا من الاشاره في أدبيات الاستشعار البيولوجي المصممة خصيصا لغرض الكشف عن GSR ، علي الرغم من نشر بعض المواد البيولوجية لتطبيقات الطب الشرعي الأخرى8.
وترد في الشكل 1العناصر البيولوجية لكل جهاز في نظام microbocop ، وبناء البلازميد. السهم المنحني في الشكل 1b يمثل المنطقة المروج التي يتم تنشيطها في وجود التحليلية ، والبيضاوي هو موقع ربط ريبوسومال الذي يسمح ترجمه البروتين المراسل ، المربع الرمادي المسمي عروض العروض هو الجين الذي يعبر عن الأحمر البروتين الفلوري ، والمثمن الأحمر هو موقع إنهاء النسخ. سيتم استخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا كنظام للكشف عن GSR. سيتم احتضان كل جهاز مع مروج محدد (SbRFP ، PbRFP ، و TNT-عروض العروض) مع العينة التي يتم اختبارها سيتم قياس الفلورية لعروض العروض. ولن يتم التعبير عن تقديم العروض الا إذا كان التحلل الكيميائي المناسب موجودا وينشط منطقه المروج. وقد تم تصميم ثلاثه أجهزه تستجيب لبعض المواد الكيميائية الموجودة في GSR ويتم عرضها في هذا العمل.
المروجين المستخدمة في الاجهزه microbocop الثلاثة هي الزرنيخ والداعم إثمد الحساسة, sbrfp9,10, المروج الحساسة الرصاص, pbrfp11,12 والمروج الحساسة TNT, TNT- عروض العروض 13. لان البحث في الأدبيات كشفت عن اي مروج مصممه للرد علي الباريوم ، تم اختيار المروج TNT بدلا من ذلك لان هذا المروج حساس لعدد من المركبات ذات الصلة هيكليا (علي وجه الخصوص ، 2 ، 4-dinitrotoluene و dinitrobenzene) التي من المعروف انها جزء من المركبات العضوية تركت وراءها في GSR. وقد استخدم هذا المروج بنجاح للكشف علي وجه التحديد كميات دقيقه من TNT و 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) في ألغام الارضيه المدفونة13. باستخدام الاجهزه الثلاثة معا كنظام ، سينتج اختبار إيجابي ل GSR مضان في جميع الاجهزه الثلاثة. اشاره مضان في جهاز واحد أو اثنين فقط سوف تشير إلى مصدر بيئي آخر للتحليل (ق) أو في حاله المروج TNT ، التنشيط من قبل مركب ليس مركب عضوي تركت وراءها في GSR. وباستخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا ، يتم التقليل إلى ادني حد من امكانيه حدوث نتائج ايجابيه زائفه بسبب المصادر البيئية. ولا تزال الذخيرة الخالية من الرصاص ، التي تكتسب شعبيه ، لا تمثل سوي 5 في المائة من مبيعات الذخيرة في الولايات المتحدة ؛ التالي ، قد تكون النتائج السلبية كاذبه بسبب عدم وجود الرصاص احتمال ولكن لا يزال هناك فائده في جهاز استشعار يستخدم الرصاص كعلامة ل GSR14. الاضافه إلى هذا التطبيق المحدد للطب الشرعي ، يمكن استخدام كل جهاز بشكل منفصل لأغراض الكشف عن الملوثات البيئية.
وتشمل البروتوكولات المقدمة تقنيات البيولوجيا التركيبية المستخدمة لإنشاء الاجهزه (بكتيريا المستشعر) والتقنيات التحليلية للتحقق من وظيفة الاجهزه وتحليل الإشارات الفلورية التي تم الحصول عليها. ويشمل البروتوكول أيضا جمع أدله الطب الشرعي في شكل مسح اليد لجمع GSR من يد المشتبه به أو مسحه لجمع GSR من السطح. يتم عرض النتائج من جهاز استشعار الرصاص علي سبيل المثال النتائج ، إلى جانب إظهار اختبار إيجابي ل GSR باستخدام غلاف خرطوشه المستهلكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: يتم تقديم التوليف من e. كولاي التعبير عن العروض.
1. اعداد الحمض النووي البلازميد من e. كولاي
- ذوبان e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع جين عروض العروض وجين المقاومة الامبيسلين وتنمو e. كولاي علي المرق لوريا (LB) أجار لوحات تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين في 37 درجه مئوية ل 24 ساعة. علي سبيل المثال ، استخدم J10060 البلازميد من تسجيل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد). يتضمن J10060 البلازميد جين لعروض العروض (البروتين الفلوري الأحمر) تحت سيطرة منطقه المروج pbad وجين مقاومه الامبيسلين. بدلا من ذلك ، تحويل e. القولونية (الرجوع إلى الخطوة 3.2) مع البلازميد قبل النمو علي لوحات أجار LB.
- اتبع بروتوكول miniprep القياسية (انظر جدول المواد) لعزل الحمض النووي من 1 مل من الثقافة e. القولونية التي تحتوي علي plasmid J10060. الغرض من البروتوكول التالي هو أزاله المروج pBad واستبداله بالمروج المطلوب للجهاز.
- بعد مينيميد البلازما ، تخزين الحمض النووي في الفريزر حتى جاهزه للهضم.
2. تقييد انزيم الهضم
- اعداد رد الفعل التالي في أنبوب الطرد المركزي ل ecori و nhei الهضم: 10 μl من الحمض النووي J10060 البلازميد (معزولة في الخطوة 1) ، 8 μl من الماء ، و 1 μl كل من ecori و nhei الانزيمات قبل مختلطة مع 1 μl من العازلة (انظر جدول المواد).
- للحمض النووي المروج ، واعداد رد الفعل التالي في أنبوب الطرد المركزي ل EcoRI و NheI الهضم: 10 μL من متواليات الحمض النووي المروج صلب (8 μL من الماء ، و 1 μL كل من EcoRI و NheI الانزيمات قبل مختلطة مع 1 μL من العازلة.
- ل Sb-، الرصاص-، أو TNT-عرض العروض (انظر جدول المواد) ، حل القلة الكريات في العازلة (30 مم Hepes ، pH 7.5 ؛ 100 mm خلات البوتاسيوم) ، احتضان في تركيزات مولي متساوية ، والحرارة إلى 94 درجه مئوية لمده 2 دقيقه ، وتبرد تدريجيا في درجه حرارة الغرفة).
- اخلط العينات عن طريق التنضيد برفق لاعلي ولأسفل مع تعيين الماصة إلى 10 μL.
- احتضان لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية.
- الحرارة إلغاء تنشيط الانزيمات في 80 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- يخزن الحمض النووي المهضوم في الفريزر حتى يصبح جاهزا للخطوة التالية.
3-الربط والتحويل
-
الربط
- باستخدام البلازميد والمروج الحمض النووي التي تم هضمها مرتين مع ecori و nhei في الخطوة 2 ، اعداد خليط رد الفعل المبين في الجدول 1 في أنبوب الطرد المركزي علي الجليد. أضافه الحمض النووي T4 Ligase الماضي.
ملاحظه: يبين الجدول 1 ربطا باستخدام نسبه موليه من 1:3 متجه إلى الادراج لاحجام الحمض النووي المشار اليها. - خلط بلطف رد فعل عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا والميكروطارد لفتره وجيزة.
- احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
- الحرارة إلغاء تنشيط في 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
- باستخدام البلازميد والمروج الحمض النووي التي تم هضمها مرتين مع ecori و nhei في الخطوة 2 ، اعداد خليط رد الفعل المبين في الجدول 1 في أنبوب الطرد المركزي علي الجليد. أضافه الحمض النووي T4 Ligase الماضي.
-
التحول
- ذوبان أنبوب مع 20 μL من DH5 المختصة e. القولونية الخلايا علي الجليد حتى تختفي بلورات الجليد الماضي.
- أضافه 5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد إلى خليط الخلية. نفض الغبار بعناية أنبوب 4-5 مرات لخلط الخلايا والحمض النووي.
- وضع الخليط علي الجليد لمده 2 دقيقه.
- حرارة صدمه في تماما 42 [ك] ل تماما 30 [س.]. لا تخلط.
- مكان علي الجليد لمده 2 دقيقه. لا تخلط.
- ماصه 380 μL من درجه حرارة الغرفة SOC في الخليط. انتشر علي الفور علي لوحه أجار LB تحتوي علي الامبيسلين (100 ميكروغرام/مل) وحضنت بين عشيه وضحيها عند 37 درجه مئوية.
- تحقق من لوحات في غضون 24 ساعة للنمو.
- ختم لوحات مع ختم الفيلم وتخزينها في الثلاجة حتى تصبح جاهزه للخطوة التالية.
4. مستعمره PCR
- أضافه إلى أنبوب PCR (اعداد 4 أنابيب رد فعل) مخاليط التفاعل المبينة في الجدول 2.
- خلط بلطف ردود الفعل عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا.
- باستخدام طرف ماصه اصفر ، كشط مستعمره (أو منطقه صغيره جدا) من القولونية المتحولة. نقل انتقاد من هذا كولاي علي لوحه LB/ampicillin/أجار الجديدة التي تم تقسيمها ، ومن ثم ادراج طرف ماصه في أنبوب PCR. يهز طرف الماصة لخلط كولاي مع مزيج PCR. كرر ثلاث مرات أخرى لمستعمرات اضافيه. نقل أنابيب PCR إلى اله PCR والبدء في ثيرموسيكلينج باستخدام البرنامج المبين في الجدول 3.
- تشغيل هلام الكهربائي باستخدام 2 ٪ هلام اجبرز في تاي لتحديد المستعمرات التي لديها أفضل ربط في البلازميد وتنمو تلك المستعمرات علي لوحه جديده.
- خزن الصفائح في الثلاجة حتى تصبح جاهزه للاختبار. اعداد الثقافة السائلة في مرق لوريا مع 100 ميكروغرام/مل الامبيسيلين المضافة للاختبار الكيميائي.
5. تسلسل الحمض النووي
- لكل عينه ، أضافه 5 μL من plasmid ، 4 μL من التمهيدي التسلسل ، و 3 μL من الماء منزوع الأيونات.
- وضع هذا الخليط في أنبوب وإرساله لتسلسل الحمض النووي (انظر جدول المواد).
- تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي للمقارنة بين متواليات الحمض النووي المتوقعة والملاحظة باستخدام برنامج تحليل تسلسل الحمض النووي لضمان عدم وجود طفرة وإدخال الجينات بشكل صحيح.
ملاحظه: استخدام e. كولاي كجهاز استشعار الكيميائية ويرد أدناه.
6. اعداد الثقافات e. كولاي
- اعداد LB مع 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين للثقافات السائلة.
- اعداد الثقافات السائلة للبكتيريا الاستشعار ، والسيطرة الايجابيه * البكتيريا والسيطرة السلبية * * البكتيريا.
ملاحظه: * البكتيريا السيطرة الايجابيه: e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع الجينات لعروض العروض تحت سيطرة المروج التاسيسيه ؛ تم استخدام البلازميد E1010 من سجل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد) في هذا العمل.
* * بكتيريا السيطرة السلبية: e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع الجينات لعرض العروض تحت السيطرة من مروج مختلفه ، مثل المروج pbad (بلازميد J10060 من السجل من الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد)) أو البلازميد التي ليس لديها الجينات لعروض العروض. - وضع الثقافات في حاضنه الاهتزاز في 37 درجه مئوية و 220 دوره في الدقيقة لمده لا تقل عن 8 ساعة ، كحد اقصي 18 ح. مرق غائم يشير إلى نمو البكتيريا.
7. معايره e. القولونية للتحقق من وظيفة الجهاز
ملاحظه: مره واحده وقد تم معايره أجهزه الاستشعار للتحقق من وظيفة ، وهذه الخطوة لا تحتاج إلى ان تتكرر. السيطرة الايجابيه في شكل أضافه الرصاص ، الإثمد ، و 2 ، 4-DNT أو 1 ، 3-dinitrobenzene (1 ، 3-DNT) يمكن التحقق من وظيفة الاجهزه لكل استخدام دون الحاجة إلى المعايرة الكاملة.
- اعداد حل الأسهم من التحاليل (ق) من الفائدة بتركيز 10 جزء في المليون في الماء. إذا كان الذوبان مشكله ، استخدم خليط الماء/الميثانول 50/50.
- باستخدام الجدول 4 كدليل ، تسميه العدد المناسب من أنابيب الثقافة العقيمة ووضع 2 مل من مرق مثقف (من الخطوة بروتوكول 6) في كل أنبوب.
ملاحظه: من أجل تحديد نطاق التحليلية العامة ، القيام علي الأقل ثلاثه مستويات مختلفه من التحليل مع البكتيريا الاستشعار ، مستوي واحد مع السيطرة السلبية ، ومستوي واحد مع السيطرة الايجابيه. يجب ان يكون هناك أيضا أنبوب واحد من كل من البكتيريا التي ليس لديها المعادن المضافة (نوع آخر من السيطرة السلبية). لتحديد النطاق التحليلي وحدود الكشف بشكل أدق ، استخدم نطاقا أكبر من تركيزات التحليل. - أضافه حل الأسهم التحليلية إلى الأنابيب التي تحتوي علي 2 مل من مرق كما لوحظ في الجدول 4، وضع قبعات المفاجئة علي أنبوب الثقافة بحيث تكون فضفاضة (للسماح تدفق الهواء في الأنبوب) ، ودوامه أنبوب الثقافة.
- ترك قبعات المفاجئة فضفاضة علي أنابيب الثقافة ، ووضع في حاضنه الاهتزاز في 220 لفه في الدقيقة و 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة علي الأقل.
- أزاله الأنابيب من الحاضنة ، والمفاجئة قبعات علي الأنابيب باحكام ، وتخزين الأنابيب في الثلاجة حتى تكون جاهزه للتحليل مضان.
8. استخدام كولاي كجهاز استشعار الكيميائية ل gsr
- باستخدام المسح القائم علي الايثانول المصمم لأزاله الرصاص (انظر جدول المواد) ، امسح جميع أسطح اليدين ، بما في ذلك بين الأصابع. استخدم مسحه منفصلة لكل يد. خزن المناديل في الحقيبة القابلة للإغلاق بشكل مناسب حتى التحليل.
- بالنسبة للأسطح التي سيتم اختبارها: استخدم مسحا قائما علي الكحول للأسطح الكبيرة أو مسحه قطنية مبلله بالايثانول للأسطح الصغيرة.
ملاحظه: لإظهار استجابه أجهزه الاستشعار إلى GSR ، داخل التي تم انفاقها. تم مسح غلاف خرطوشه العيار 40 بمسحه من القطن المبلل من الايثانول. - ارتداء قفازات نظيفه واستخدام المقص التي تم تنظيفها بالكحول ، وقطع ما يقرب من 1 سم2 القسم من وسط المسح.
- ضع قطعه قطع من مسح اليد أو مسحه القطن مباشره إلى أنبوب الثقافة الذي يحتوي علي 2 مل من البكتيريا الاستشعار ، وضمان ان يتم غمرها في مرق.
- المضي قدما كما هو موضح أعلاه في الخطوات 7.4 – 7.5.
9. تحليل مضان باستخدام مطياف المحمولة (انظر جدول المواد)
- استخدام خلاط دوامه لهز الأنابيب.
- اعداد مطياف لجمع الانبعاثات فلوري في الطول الموجي المناسب للخيار الخاص بك لعروض العروض مع الطول الموجي الاثاره من 500 نانومتر.
- استخدم مرق لوريا لتسجيل طيف فارغ.
- نقل بعناية كل ماده طافي إلى حجم منخفض كوفيت وجمع كثافة الانبعاثات.
10. تحليل مضان باستخدام 96 القارئ لوحه جيدا (انظر جدول المواد)
- استخدام خلاط دوامه لهز الأنابيب.
- نقل 200 mL من مرق إلى بئر في لوحه جيدا. سجل العينات التي ذهبت إلى كل بئر من لوحه.
- اعداد مقياس الفلور لجمع كثافة الانبعاثات عند الطول الموجي المناسب لمتغير عروض العروض.
11-تحليل البيانات
- باستخدام الاشاره التي تم الحصول عليها من جميع الضوابط السلبية (البكتيريا السلبية لعروض العروض أو البكتيريا الاستشعار مع عدم أضافه التحليلية) ، وحساب متوسط اشاره فلوري للخلفية.
- طرح متوسط اشاره الخلفية من كل اشاره الفلورية التي تم الحصول عليها للبكتيريا الاستشعار للحصول علي خلفيه تصحيح كثافة مضان.
- تقدير نسبه الاشاره إلى الضوضاء (S/N) عن طريق قسمه الخلفية علي كثافة الفلورية المصححة بواسطة اشاره الخلفية المتوسطة. إذا كانت نسبه S/N أكبر من 3 ، يكون الاختبار موجبا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 2الأطياف الفلورية للخيار الخاص بعروض العروض المستخدمة في هذا العمل. هذه البيانات هي من جهاز PbRFP كما انه يستجيب للرصاص والجهاز TNT-العطاء كما انه يستجيب لاثنين من التحاليل ، 2 ، 4-DNT و 1 ، 3-DNT. يظهر هذا الرقم طيف السيطرة السلبية (لم تتم أضافه التحاليل) ، والأطياف في مستويين مختلفين من التحاليل المضافة. لوحظ الحد الأقصى للاشاره الفلورية لمتغير عروض العروض المستخدمة في 575 نانومتر (الاثاره الطول الموجي 500 nm). وتمثل البيانات الواردة في الشكل 3 تجربه واحده للمعايرة بالمعايرة (التالي لا يتم تضمين أشرطه الخطا) من جهاز PbRFP ، والمعايرة كما في الخطوة 7 من البروتوكول. يظهر الشكل 3a البيانات التي تم جمعها من مطياف المحمولة ، في حين يظهر الشكل 3a البيانات التي تم جمعها من مقياس الفلور (من نفس مجموعه من الحلول). هناك اتجاه عام لزيادة الفلوري وتركيز المعادن الزيادات. ومن الجدير بالذكر انه في تركيزات عاليه ، أكبر من حوالي 800 ppb ، تنخفض الاستجابة بسبب سميه المعدن في مثل هذا التركيز العالي. قد يختلف مستوي الاستجابة الأقصى هذا تبعا للتحليل المستخدم. واظهر عملنا السابق مع SbRFP ان البكتيريا يمكن ان تتسامح مع مستويات اعلي (علي الأقل ما يصل إلى 1,000 ppb) من الزرنيخ والإثمد10. الأدب علي مستويات هذه التحاليل التي تم جمعها من مسحات اليد تشير إلى ان هذه المستويات من الرصاص والإثمد تتسق مع ما يمكن جمعها من مسحه اليد15. بالاضافه إلى ذلك ، فان النتائج المعروضة في الشكل 4 تثبت ان البكتيريا يمكن ان تتسامح مع كميات التحاليل الموجودة في مسحه حاله الخرطوشة دون موت الخلية ، والتي ستكون اعلي بكثير من ما يتم جمعه من مسحه اليد.
باستخدام قيم S/N المحسوبة لهذه البيانات ، كان المستوي الأدنى القابل للكشف من الرصاص هو 12 ppb (قابل للاكتشاف كما هو معرف بواسطة S/N أكبر من 3). وعلي النقيض من ذلك ، فان S/N لبيانات مطياف المحمولة هي 2 فقط علي اعلي مستوي اختبار. ومع ذلك ، فان اتجاه زيادة الفلوري مع زيادة تركيز التحاليل لا يزال يلاحظ بوضوح.
يظهر الشكل 4a اختبارا إيجابيا ل gsr. وللحصول علي هذه النتيجة ، تم جمع مسحات الايثانول من داخل الغلاف الذي تم انفاقه. 40 خرطوشه العيار وأضافها إلى بكتيريا الاستشعار الثلاثة ، كما في الخطوة 8 من البروتوكول. ويظهر هذا الرقم أيضا سيطرة ايجابيه (البكتيريا التي تعبر عن طلب العروض الدستورية) والسيطرة السلبية في شكل جهاز SbRFP مع عدم أضافه التحليلية. واستخدمت مسحات حاله الخرطوشة كنتائج إثبات للمبدا. في العمل المستقبلي ، سيتم جمع مسحات يدوية من الأشخاص الذين يعرف انهم أطلقوا النار لإظهار ان أجهزه الاستشعار تستجيب لمسحات اليد أيضا.
| مكون | 20 التفاعل μL |
| 10X T4 الحمض النووي Ligase العازلة | 2 μL |
| الحمض النووي بلازميد (3 كيلوبايت) | 3 μL |
| الحمض النووي المروج (0.7 kb) | 10 μL |
| المياه الخالية من النيوداز | 4 μL |
| T4 الحمض النووي Ligase | 1 μL |
الجدول 1 تفاعل خليط لربط, بروتوكول خطوه 3-1-1.
| مكون | 25 μL رد فعل |
| 10 μM التمهيدي إلى الامام | 0.5 μL |
| 10 μM التمهيدي العكسي | 0.5 μL |
| واحدهتاق 2X ماستر ميكس | 12.5 μL |
| المياه الخالية من النيوداز | 11 μL |
الجدول 2 تفاعل خلطاء لمستعمره [بكر], بروتوكول خطوه 4.1.
| خطوه | Temp | الوقت |
| التشبع الاولي | 94 درجه مئوية | 30 ثانيه |
| 30 دورات | 94 درجه مئوية | 30 ثانيه |
| 55 درجه مئوية | 45 s | |
| 68 درجه مئوية | 60 s | |
| التمديد النهائي | 68 درجه مئوية | 5 دقائق |
| عقد | 4 درجه مئوية |
الجدول 3 PCR ثيرموسيكلينج المعلمات لبروتوكول الخطوة 4.3.
| معرف أنبوب | البكتيريا | وأضاف تركيز المحلول التحليلي (جزء في المليون) | المعادن المضافة | حجم المحلول التحليلي أضافه إلى 2,000 μL مرق | [التحاليل], ppb |
| 1 | PbRFP | 10 | Pb | 2.5 | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP | 0 | اي | 0 | 0 |
| 5 | عروض المناقصات | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | نقاط البيع | 10 | Pb | 10 | 50 |
الجدول 4 التجربة العامة التي وضعت للمعايرة المعايرة البيولوجية ، بروتوكول الخطوة 7.2.
الشكل 1 العناصر البيولوجية للاجهزه MicRoboCop. (ا) رسم تخطيطي للجهاز العام ل microbocop في البلازميد مع جين مقاومه الامبيسلين. (ب) رسم تخطيطي لكل جهاز يتم دمجه لإنشاء نظام MicRoboCop. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 الأطياف الفلورية من PbRFP والبكتيريا TNT-تقديم العروض في وجود وغياب التحاليل. البيانات المجمعة علي مقاييس الفلور. (ا) الأطياف الفلورية لبكتيريا PbRFP في وجود وغياب التحاليل (Pb). (ب) الأطياف الفلورية من البكتيريا TNT-تقديم العروض في وجود وغياب اثنين من التحاليل (2 ، 4-dnt و 1 ، 3-dnt). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 مقارنه بين نظام مطياف المحمولة ومقياس الفلور للكشف عن أطياف البكتيريا PbRFP في وجود وغياب التحاليل (الرصاص). (ا) البيانات الرئيسية بالمعايرة بالنسبة لبكتيريا المستشعر PbRFP التي تجمع علي نظام مطياف محمول. (ب) بيانات المعايرة بالنسبة للرصاص (نفس العينات) لبكتيريا مستشعر PbRFP التي تجمع علي مقاييس الفلور. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 أخذت مسحات الايثانول ماخوذه من الداخل من عيار. 40 خرطوشه المسدس المستهلكة لإظهار استجابه الاجهزه الثلاثة إلى GSR. S/N لجميع الإشارات كان أكبر من 3 ، مما يدل علي اختبار إيجابي ل GSR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
ويمكن تعديل التجربة الموصوفة في الجدول 4 بأي شكل من الاشكال بما يتناسب مع أجهزه الاستشعار التي تم تصميمها. الجانب الأكثر اهميه في المستشعر الكيميائي هو تقييم حساسيته وخصوصيته. ومن المفيد ضمان تحليل مجموعه واسعه من تركيزات التحليل لتحديد النطاق التحليلي المفيد لجهاز الاستشعار. ومن الجدير أيضا تحديد مستوي الحد الأقصى من التحاليل للخلايا. لان التحليلات المستخدمة في هذه الدراسة هي المعادن السامة (الرصاص و Sb) أو المركبات العضوية في محلول الميثانول (لمشتقات TNT) ، هناك المستوي الأعلى الذي وفاه الخلية بسبب سميه التحليلية أو حل سيحدث (عموما اعلي من 500-1 ، 0 00 [ب] للتجارب ب قام [س فر]).
قيود التقنية
النتائج المقدمة في هذا العمل هي النوعية في الطبيعة ولكن المقصود منها لإثبات القدرات الكمية لتقديم العروض المعدلة e. كولاي. حساسية جهاز الاستشعار يمكن ان تختلف اختلافا كبيرا بين دفعات مثقف اعتمادا علي كثافة الخلايا في المرق. وإذا كانت النتائج الكمية مطلوبه ، ينبغي تقدير تركيز الخلية بقياس الكثافة البصرية للثقافات السائلة قبل التحليل. ان الكثافة بصريه من الثقافات يكون حددت, بعد ذلك الخلايا يستطيع كنت خففت بشكل مناسب ان يقلل تغير بين تجارب. غير انه ، كاختبار افتراضي للتحليلات المطلوبة ، يكون الرد النوعي "الحاضر/غير الحاضر" مقبولا بالنسبة للطلبات التي تناقش هنا. وينبغي أيضا ان يلاحظ العمر الافتراضي للخلايا علي لوحه أجار – العمل السابق قد أشار إلى ان لوحات يمكن تخزينها في الثلاجة لمده تصل إلى 2 أسابيع, ولكن الاجهزه لا تعمل بشكل جيد للغاية نحو نهاية هذا الإطار الزمني وخارجها.
ومن الاعتبارات الأخرى اختيار المعدات المستخدمة لتحليل الاشاره الفلورية. باستخدام مقياس الطيف البحوث الطيفية مع قارئ لوحه 96 البئر يسمح اختيار الاثاره الدقيق والانبعاثات الموجية ، والتي يمكن ان تزيد من الحساسية. باستخدام هذا النظام ، يمكن جمع نتائج ما يصل إلى 96 التجارب في وقت واحد. ويمكن أيضا تحليل العروض الفلورية باستخدام نظام مطياف محمول. الاداات المحمولة تسمح عاده عصابات الاثاره المختارة ، والتي قد أو قد لا تتطابق مع الحد الأقصى الاثاره من البديل لعروض العروض المستخدمة. ومع ذلك ، طالما ان الطول الموجي الاثاره هو ضمن نطاق معقول من الاثاره ماكسيما ، فان الصك المحمولة تكون عموما للخدمة (علي الرغم من فقدان في الحساسية). وتكلفه النظم المحمولة اقل بكثير من المقياس الطيفي لدرجه البحث ، وقد تكون قابليه النقل بالتاكيد ميزه. استنادا إلى التطبيق المحتمل للبكتيريا ، يمكن للمحلل ان يقرر ما إذا كانت التكلفة الاضافيه وفقدان القدرة علي الحمل مع نظام الطيف الطيفي مبرره.
الاهميه فيما يتعلق بالأساليب القائمة
والغرض من نظام MicRoboCop الثلاثي الأجزاء الموصوف في هذا العمل هو استخدامه كاختبار افتراضي نوعي لوجود البرنامج المذكور. حاليا ، يتطلب اختبار الادله "المعيار الذهبي" ل GSR تحليل الخبراء من قبل SEM-EDX. SEM-EDX المعدات مكلفه وتدار عاده من قبل المحللين عاليه التخصص. بالاضافه إلى ذلك ، الادله GSR متغيرة للغاية في قضايا الطب الشرعي والعديد من المتغيرات تسهم في ترسب GSR علي اليدين والأسطح16. وقد يكون الاختبار الافتراضي لهذه العملية مفيدا للمحققين لأنه يوفر سببا محتملا للبحث عن شخص أو ممتلكات. المقارنة مع الاختبارات الكهروكيميائية أو الاختبارات مثل التحليل الطيفي للتنقل الأيوني ، توفر هذه الطريقة أجهزه بسيطه ومتاحه بسهوله يمكن لمعظم المختبرات التحليلية الوصول اليها.
تطبيقات أخرى
تم تصميم الاجهزه الموصوفة في هذه المخطوطة ليتم دمجها في نظام من ثلاثه أجزاء للتعرف الافتراضي علي GSR. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام كل جهاز في نظام MicRoboCop (SbRFP ، PbRFP ، و TNT-عروض العروض) بشكل فردي للكشف عن التلوث الكيميائي في الاغذيه أو المياه أو العينات البيئية. وقد أظهرت الاعمال السابقة انه يمكن استخدام جهاز عرض العروض الخاص ب TNT كمستشعر موضعي للألغام الارضيه13و17. أظهرت النتائج المعروضة هنا وفي عملنا السابق10 ان أجهزه Sbrfp و pbrfp يمكنها الكشف عن تركيزات منخفضه بما يكفي لمنافسه المعدات الأكثر تكلفه والمتطورة مثل البلازما الطيفية الناتجة عن الانبعاثات الذرية ( البرنامج الدولي للبرنامج والمقياس الطيفي للامتصاص الذري (AAS). مستشعر SbRFP حساس للزرنيخ وكذلك الإثمد. وقد توفر هذه الاجهزه خيارا منخفض التكلفة لتحليل تلوث المعادن الثقيلة السامة.
بروتوكول البيولوجيا التركيبية لاعداد القولونية المقدمة هنا ينطبق علي اي نظام يستخدم الأجزاء الوراثية البيولوجيا التركيبية القياسية لتوليف e. كولاي التي تعبر عن تقديم العروض. الطريقة التحليلية قابله للتطبيق علي اي نظام يعبر عن عروض العروض ، التالي يمكن استخدامه لتحليل اي نظام بيولوجي جرثومي تم إنشاؤه باستخدام أساليب البيولوجيا التركيبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدي أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو تضاربات أخرى في المصالح للكشف عنها.
Acknowledgments
ويرغب المؤلفون في الاعتراف بالطلاب في جامعه لونغوود في 324 BIOL (علم الوراثة) والطلاب في تشيم 403 (المختبر الكيميائي المتقدم لحل المشكلات) الذين شاركوا في الاعداد الاولي واختبار الإثمد والرصاص الحيوي. وقد تم تصور فكره MicRoboCop في ورشه عمل GCAT SynBIO (الصيف 2014) ، والتي يتم تمويلها من قبل NSF ومعهد هوارد هيوز الطبي والتي تستضيفها جامعه ميريلاند مقاطعه بالتيمور. ويعترف المؤلفون أيضا بالتمويل الوارد من كليه كوك-كول للفنون والعلوم بجامعه لونغوود ومنحه خريجي GCAT SynBio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
