Summary
En protokol er præsenteret ved hjælp af syntetisk biologi teknikker til at syntetisere et sæt af bakterielle biosensorer til analyse af skudsår rester, og til at teste funktionen af anordningerne til deres tilsigtede anvendelse ved fluorescens spektroskopi.
Abstract
MicRoboCop er en biosensor, der er designet til en unik anvendelse i retsmedicinsk kemi. MicRoboCop er et system, der består af tre enheder, der, når de anvendes sammen, kan indikere tilstedeværelsen af skud rester (GSR) ved at fremstille et fluorescens signal ved tilstedeværelse af tre vigtige analysander (antimon, bly og organiske komponenter i GSR). Protokollen beskriver syntesen af de biosensorer, der anvender Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kemi metoder, der anvendes til at vurdere Sensorernes selektivitet og følsomhed. Systemets funktion påvises ved hjælp af GSR, der er indsamlet fra indersiden af et brugt patronhylster. Når Biosensorerne er forberedt, kan de opbevares, indtil de er nødvendige, og kan bruges som test for disse vigtige analyter. En positiv respons fra alle tre analysander giver en formodet positiv test for GSR, mens hver enkelt anordning har applikationer til påvisning af analysander i andre prøver (f. eks. en detektor til blyforurening i drikkevand). Den vigtigste begrænsning af systemet er den tid, der kræves for et positivt signal; fremtidige arbejde kan indebære at studere forskellige organismer for at optimere responstid.
Introduction
En biosensor er enhver analytisk anordning, der anvender biologiske komponenter (såsom proteiner, nukleinsyrer eller hele organismer), der producerer et respons, der kan anvendes til påvisning af et kemisk stof eller analysand. F. eks. brugte kulmineindustrien en biosensor i meget af det 20. århundrede til at påvise tilstedeværelsen af giftige minegasser: Kanarieøerne i kulminen1. Den biologiske organismes (kanarieøens) respons (død eller angst) over for en kemisk analysand (carbonmonoxid) blev observeret af minearbejderne for at beskytte arbejderne. I et mere moderne og sofistikeret eksempel kan bakterier ændres ved hjælp af syntetisk biologi teknikker til at reagere på tilstedeværelsen af en bestemt kemisk analysand ved at udstille en specifik respons, såsom ekspression af et fluorescerende protein.
Syntetisk biologi er et bredt begreb, der refererer til konstruktionen af biologiske enheder og systemer, der ikke eksisterer naturligt, eller re-design af eksisterende biologiske systemer til et bestemt formål2. Syntetisk biologi skelnes fra genteknologi ved en standardmetode og eksistensen af standardiserede dele (standard syntetiske biologi genetiske elementer), der kan bruges til at syntetisere enheder og systemer. En del indføres i genomet af en anordning, en organisme som en bakterie, at udtrykke en bestemt egenskab, der vil tjene som en indikation af funktion. For eksempel, i mange syntetiske enheder, er udtrykket af et fluorescerende protein indført i en enkelt encellede organisme som en reporter protein. Flere enheder kan kombineres til et system. Genomer af mikroorganismer som bakterier er nemme at manipulere på denne måde. Talrige eksempler på biosensorer, der er specifikke for en lang række kemiske analyter, er blevet rapporteret i litteraturen i løbet af det sidste årti,3,4.
I dette arbejde, er MicRoboCop systemet præsenteret som et eksempel på en biosensor designet ved hjælp af syntetisk biologi teknikker med nye anvendelser i retsmedicinsk og miljømæssig kemi. MicRoboCop er et system af tre separate enheder, der, når de kombineres, vil gøre det muligt for Escherichia coli at udtrykke rødt fluorescerende protein (RFP) i tilstedeværelse af skud rester (GSR), der er blevet indsamlet fra en persons hænder eller en overflade. Hver af de tre enheder reagerer på en specifik kemisk analysand, der vides at være en bestanddel af GSR5. De tre analysander, som systemet reagerer på, er I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) og beslægtede stoffer, II. bly (i form af bly ioner) og III. antimon (også i form af ioner).
GSR består af mange forskellige kemiske stoffer, men de tre bruges sædvanligvis til at identificere en rest, da GSR er barium, bly og antimon5. Den standard bevismæssige test til identifikation af GSR er at bruge scanning elektronmikroskopi (SEM) med energi udbredt røntgen fluorescens (EDX)5. SEM-EDX gør det muligt for analytikere at identificere de unikke morfologi og elementært komponenter i GSR. I øjeblikket er der kun få udbredte binære formodede tests til rådighed. En nylig offentliggjort formodede test bruger ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er specialiseret udstyr, der måske ikke er tilgængelige i mange laboratorier6. Der er også et par farve "spot" tests, der kan anvendes, selv om de typisk anvendes til distance bestemmelse eller til GSR identifikation på kuglehuller og sår5. Derudover har der været en vis begrænset opmærksomhed i litteraturen til elektrokemiske tests for GSR, der anvender voltammetrisk analyse, som har den fordel, at de potentielt er felt bærbare, eller anodisk stripping voltammetry, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer7. Der er meget lidt omtale i litteraturen af biosensorer designet specielt med henblik på at afsløre GSR, selv om nogle biosensorer til andre retsmedicinske applikationer er blevet offentliggjort8.
De biologiske elementer for hver anordning i MicRoboCop-systemet og plasmid-konstruktionen er illustreret i figur 1. Den buede pil i figur 1b repræsenterer den promotor region, der er aktiveret i nærværelse af analysand, den ovale er den ribosomale bindingssted, der tillader oversættelse af reporter protein, den grå boks mærket RFP er det gen, der udtrykker rødt fluorescerende protein, og den røde Oktagon er transkription termineringstedet. Alle tre enheder vil blive brugt sammen som et system til at detektere GSR. Hver enhed med en bestemt promotor (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil blive inkueret med den prøve, der testes, og fluorescens af RFP vil blive målt. RFP udtrykkes kun, hvis den relevante kemiske analysand er til stede og aktiverer initiativtageren. Tre enheder, der reagerer på nogle af de kemiske stoffer til stede i GSR er designet og præsenteres i dette arbejde.
De projektledere, der anvendes i de tre mikrobocop-enheder, er en arsen-og antimon følsom promotor, sbrfp9,10, en ledende følsom promotor, pbrfp11,12 og en TNT-følsom promotor. TNT-RFP 13. da en søgning i litteraturen afslørede, at der ikke var nogen promotor til at reagere på barium, blev TNT-promotoren valgt i stedet, da denne promotor er følsom over for en række strukturelt beslægtede forbindelser (især 2,4-dinitrotoluen og dinitrobenzen), som vides at være en del af de organiske forbindelser, der efterlades i GSR. Denne promotor er blevet brugt til specifikt at detektere minut mængderne af TNT og 2,4-dinitrotoluen (2,4-DNT) i begravede landminer13. Ved hjælp af de tre enheder sammen som et system, vil en positiv test for GSR producere fluorescens i alle tre enheder. Et fluorescens signal i kun én eller to enheder vil indikere en anden miljø kilde for analysand eller for TNT-promotoren, aktivering af en forbindelse, der ikke er en organisk forbindelse efterladt i GSR. Ved at bruge alle tre enheder sammen minimeres muligheden for falsk positive resultater på grund af miljømæssige kilder. Blyfri ammunition, der vinder i popularitet, udgør stadig kun ca. 5% af ammunitions salget i USA. Derfor kan falsk negative resultater på grund af fravær af bly være en mulighed, men der er stadig nytte i en sensor, der bruger bly som markør for GSR14. Ud over denne specifikke retsmedicinske anvendelse, kan hver anordning anvendes separat med henblik på påvisning af miljøforurenende stoffer.
De præsenterede protokoller omfatter syntetiske biologi teknikker, der anvendes til at skabe de anordninger (sensor bakterier) og de analytiske teknikker til at kontrollere funktionen af enhederne og analysere fluorescens signaler opnået. Protokollen omfatter også indsamling af retsmedicinske beviser i form af hånd aftørring at indsamle GSR fra hænderne på en mistænkt eller svaber prøven omfatter at indsamle GSR fra en overflade. Resultater fra bly Sensorenheden præsenteres som eksempelresultater, sammen med en demonstration af en positiv test for GSR ved hjælp af en brugt patron kabinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: syntesen af E. coli , der udtrykker RFP, præsenteres.
1. fremstilling af plasmid-DNA fra E. coli
- Tø e. coli indeholder et plasmid med et RFP-gen-og ampicillin-resistens-gen og dyrker e. coli på Luria Broth (lb) agar-plader, der indeholder 100 μg/ml ampicillin ved 37 °c i 24 timer. For eksempel skal du bruge J10060 plasmid fra registret over standard biologiske dele, der anvendes til syntetisk biologi (Se tabel over materialer). J10060 plasmid indeholder et gen til RFP (rødt fluorescerende protein) under kontrol af et pBad-promoområde og et ampicillin resistens-gen. Alternativt kan omdanne E. coli (se trin 3,2) med plasmid før vækst på lb agar plader.
- Følg en standard miniprep-protokol (Se tabel over materialer) for at isolere DNA fra 1 ml af en E. coli -kultur, der indeholder J10060 plasmid. Formålet med følgende protokol er at fjerne pBad-promotoren og erstatte den med den ønskede promotor til enheden.
- Efter plasmid miniprep skal du opbevare DNA i fryseren, indtil den er klar til fordøjelse.
2. begrænsning af enzym fordøjelse
- Indstil følgende reaktion i et mikrocentrifuge glas til EcoRI-og NheI-fordøjelse: 10 μL J10060 plasmid-DNA (isoleret i trin 1), 8 μL vand og 1 μL hver af EcoRI-og NheI-enzymer præ-blandet med 1 μL buffer (Se tabel over materialer).
- For promotoren skal du oprette følgende reaktion i et mikrocentrifuge glas til EcoRI-og NheI-fordøjelse: 10 μL udglødede promotor-DNA-sekvenser (8 μL vand og 1 μL hver af EcoRI-og NheI-enzymer præ-blandet med 1 μL buffer.
- For SB-, Pb-, eller TNT-RFP (Se tabel over materialer), opløses oligonukleotider i buffer (30 mm Hepes, pH 7,5; 100 mm kaliumacetat), inkube i lige molære koncentrationer, varme til 94 °c i 2 min., og efterhånden afkøles ved stuetemperatur).
- Bland prøverne ved at pipettere forsigtigt op og ned med pipetten indstillet til 10 μL.
- Inkubeter i 30 min ved 37 °C.
- Varme inaktivere enzymerne ved 80 °C i 5 min.
- Opbevar det fordøjet DNA i fryseren, indtil det er klar til næste trin.
3. ligation og transformation
-
Ligatur
- Ved hjælp af plasmid-og promotoren-DNA, der blev dobbelt fordøjet med EcoRI og NheI i trin 2, blev reaktionsblandingen vist i tabel 1 i et mikrocentrifuge glas på is. Tilsæt T4 DNA Ligase sidste.
Bemærk: tabel 1 viser en ligation med et molært forhold på 1:3 vektor, der skal indsættes for de angivne DNA-størrelser. - Bland forsigtigt reaktionen ved at pipette op og ned og mikrocentrifuge kortvarigt.
- Der inkupereres ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Varme inaktivering ved 65 °C i 10 min.
- Ved hjælp af plasmid-og promotoren-DNA, der blev dobbelt fordøjet med EcoRI og NheI i trin 2, blev reaktionsblandingen vist i tabel 1 i et mikrocentrifuge glas på is. Tilsæt T4 DNA Ligase sidste.
-
Transformation
- Tø et rør med 20 μL DH5-alfa kompetente E. coli -celler på is, indtil de sidste iskrystaller forsvinder.
- Der tilsættes 5 μL plasmid-DNA til celle blandingen. Knips forsigtigt røret 4-5 gange for at blande cellerne og DNA.
- Blandingen anbringes på is i 2 minutter.
- Varmechok ved præcis 42 °C i nøjagtig 30 s. Bland ikke.
- Læg på is i 2 min. Bland ikke.
- Der afpipetteres 380 μL rumtemperatur-SOC i blandingen. Spredes straks på en LB-agar-plade, der indeholder ampicillin (100 μg/mL), og inkube natten ved 37 °C.
- Kontroller pladerne inden for 24 timer for vækst.
- Forsegl pladerne med tætnings folie, og opbevar dem i køleskabet, indtil de er klar til næste trin.
4. koloni PCR
- Der tilsættes et PCR-rør (der er oprettet 4 reagensglas), reaktions blandingerne vist i tabel 2.
- Bland forsigtigt Reaktionerne ved at pipette op og ned.
- Ved hjælp af en gul pipettespids, skrabe en koloni (eller meget lille region) af den transformerede E. coli. Overfør et Swipe af denne E. coli til en ny lb/ampicillin/agar-plade, der er blevet skåret af, og indsæt derefter pipettespidsen i PCR-røret. Ryst pipettespidsen for at blande E. coli med PCR-blandingen. Gentag tre gange mere for yderligere kolonier. Overfør PCR-rørene til en PCR-maskine, og start termo cykling med det program, der er vist i tabel 3.
- Kør gel elektroforese ved hjælp af en 2% agopstået gel i TAE for at afgøre, hvilke kolonier der har den bedste ligation i plasmid og dyrke disse kolonier på en ny plade.
- Opbevar pladerne i køleskabet, indtil de er klar til afprøvning. Forbered en flydende kultur i Luria bouillon med 100 μg/mL ampicillin tilsat til kemisk testning.
5. DNA-sekvensering
- For hver prøve tilsættes 5 μl plasmid, 4 μl af sekvensering primer og 3 μl afioniseret vand.
- Anbring denne blanding i et rør og Send den til DNA-sekventering (Se tabel over materialer).
- Analyser DNA-sekvensdata for at sammenligne de forventede og observerede DNA-sekvenser ved hjælp af DNA-Sekvensanalyse software for at sikre, at der ikke er nogen mutation, og at generne blev korrekt indsat.
Bemærk: brug af E. coli som kemisk sensor er præsenteret nedenfor.
6. forberedelse af E. coli -kulturer
- Forbered LB med 100 μg/mL ampicillin til flydende kulturer.
- Forbered flydende kulturer af sensor bakterier, den positive kontrol * bakterier og den negative kontrol * * bakterier.
Bemærk: * positive kontrol bakterier: E. coli , der indeholder et plasmid med RFP-genet under kontrol af en konstitutiv promotor; plasmid E1010 fra registret over standard biologiske dele, der anvendes til syntetisk biologi (Se tabel over materialer) blev anvendt i dette arbejde.
* * Negative kontrol bakterier: E. coli , der indeholder et plasmid med RFP-genet under kontrol af en anden promotor, såsom pbad-promotoren (plasmid J10060 fra registret over standard biologiske dele, der anvendes til syntetisk biologi (Se tabel over Materialer)) eller en plasmid, der ikke har RFP-genet. - Kulturerne anbringes i en ryste inkubator ved 37 °C og 220 rpm i mindst 8 timer, maksimum 18 timer. uklar bouillon indikerer bakterievækst.
7. titrering af E. coli for at kontrollere enhedens funktion
Bemærk: når sensorerne er blevet titreret for at kontrollere funktionen, behøver du ikke at gentage dette trin. En positiv kontrol i form af tilsætning af bly, antimon og 2,4-DNT eller 1-3-dinitrobenzen (1, 3-DNB) kan kontrollere funktionen af enhederne for hver brug uden behov for fuld titrering.
- Der tilberedes en stamopløsning af analysene (e) af interesse i en koncentration på 10 ppm i vand. Hvis opløselighed er et problem, skal du bruge en 50/50 vand/methanol blanding.
- Ved hjælp af tabel 4 som vejledning skal du mærke det relevante antal sterile dyrknings slanger og anbringe 2 ml af den kultiverede bouillon (fra protokol trin 6) i hvert rør.
Bemærk: for at bestemme et generelt analytisk område skal der være mindst tre forskellige niveauer af en analysand med sensor bakterier, et niveau med negativ kontrol og et niveau med den positive kontrol. Der bør også være en tube af hver af de bakterier, der ikke har tilsat metal (en anden type af negativ kontrol). Brug et større udvalg af analysand koncentrationer til mere præcist at bestemme analyseområdet og detektionsgrænserne. - Der tilsættes analysand stamopløsning til rørene, der indeholder 2 mL bouillon som anført i tabel 4, anbringes snap hætter på dyrknings røret, så de er løse (for at tillade luftgennemstrømning i røret), og hvirvler kultur røret.
- Efterlader snap caps løst på dyrknings rørene, anbringes i en ryste inkubator ved 220 rpm og 37 °C i mindst 24 timer.
- Fjern rørene fra inkubatoren, fastgør hætter på rørene stramt, og opbevar rørene i køleskabet, indtil de er klar til fluorescens analyse.
8. brug af E. coli som kemisk sensor til GSR
- Ved hjælp af en ethanol-baseret tørre designet til at fjerne bly (Se tabel over materialer), tørre alle overflader af hænderne, herunder mellem fingrene. Brug en separat serviet til hver hånd. Opbevar vådservietter i en passende mærket forseglbar baggie indtil analyse.
- For overflader, der skal testes: Brug en sprit baseret aftørring til store overflader eller en vatpind, der er fugtet med ethanol til små flader.
Bemærk: for at demonstrere Sensorernes respons på GSR, blev indersiden af en brugt. 40 kaliber patron kabinet svabret med en ethanol fugtet vatpind. - Iført rene handsker og ved hjælp af en saks, der er blevet renset med alkohol, skære en ca 1 cm2 sektion ud af midten af tørre.
- Anbring skære stykket på hånd sletten eller vatpinden direkte i et kulturrør, der indeholder 2 mL sensor bakterier, og som sikrer, at den er nedsænket i bouillon.
- Fortsæt som beskrevet ovenfor i trin 7,4 – 7,5.
9. fluorescens analyse ved hjælp af bærbart spektrometer (Se tabel over materialer)
- Brug en vortex mixer til at ryste rørene.
- Spektrometer forberedes til opsamling af fluorescens emission ved den passende bølgelængde for din RFP-variant med en excitations bølgelængde på 500 nm.
- Brug Luria bouillon til at optage et blankt spektrum.
- Overfør forsigtigt hver supernatanten til en lav volumen kuvette og saml emissions intensiteten.
10. fluorescens analyse ved hjælp af 96-brønd plade læser (Se tabel over materialer)
- Brug en vortex mixer til at ryste rørene.
- Overfør 200 mL af bouillon til en brønd i brønd pladen. Optag hvilke prøver der gik ind i hver brønd af pladen.
- Indstil fluorimeteret for at indsamle emissions intensiteten ved den relevante bølgelængde for RFP-varianten.
11. data analyse
- Ved hjælp af signalet fra alle negative kontroller (RFP negative bakterier eller sensor bakterier uden analysand tilsat) beregnes et gennemsnitligt fluorescens signal for baggrunden.
- Træk det gennemsnitlige baggrunds signal fra hvert fluorescens signal, der er opnået for sensor bakterierne, for at få en baggrunds korrigeret fluorescens intensitet.
- Anslå forholdet mellem signal og støj (S/N) ved at dividere baggrunden korrigeret fluorescens intensitet med det gennemsnitlige baggrunds signal. Hvis S/N-forholdet er større end 3, er testen positiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens spektre for den RFP-variant, der anvendes i dette arbejde, er vist i figur 2. Disse data er fra PbRFP-enheden, da den reagerer på bly og TNT-RFP-enheden, da den reagerer på to analyter, 2,4-DNT og 1, 3-DNB. Dette tal viser spektret af en negativ kontrol (ingen analysand tilsat), og spektrene på to forskellige niveauer af analysand tilsættes. Det maksimale fluorescens signal for den anvendte RFP-variant blev observeret ved 575 nm (excitations bølgelængde 500 nm). Dataene i figur 3 er repræsentative for et enkelt titrerings eksperiment (der medfølger derfor ingen fejllinjer) af PbRFP-anordningen, titreres som i trin 7 i protokollen. Figur 3a viser data indsamlet fra det bærbare spektrometer, mens figur 3b viser data indsamlet fra fluorimeteret (fra det samme sæt af opløsninger). Der er en generel tendens til stigende fluorescens som koncentrationen af metal stiger. Det er værd at bemærke, at ved høje koncentrationer, større end omkring 800 PPB, den respons dråber ud på grund af toksiciteten af metallet ved en sådan høj koncentration. Dette maksimale responsniveau kan variere afhængigt af den anvendte analysand. Vores tidligere arbejde med SbRFP viste, at bakterierne kunne tåle højere niveauer (i det mindste op til 1.000 PPB) af arsen og antimon10. Litteratur om niveauer af disse analysander indsamlet fra hånd servietter indikerer, at disse niveauer af bly og antimon er i overensstemmelse med, hvad der kan indsamles fra en hånd vatpind15. Desuden viser resultaterne i figur 4 , at bakterierne kan tåle de mængder af analysander, der findes i en patron taske uden celledød, hvilket vil være betydeligt højere end det, der opsamles fra en hånd serviet.
Ved hjælp af de beregnede S/N-værdier for disse data var det laveste detekterbare niveau af bly 12 PPB (detekterbart som defineret ved et S/N større end 3). I modsætning hertil er S/N for de bærbare spektrometer data kun 2 på højeste testede niveau. Tendensen til øget fluorescens med stigende analysand koncentration er dog stadig tydeligt noteret.
Figur 4a viser en positiv test for GSR. For at opnå dette resultat blev der indsamlet ethanol-svaberprøver fra indersiden af en brugt. 40 kaliber patron kabinet og føjet til de tre sensor bakterier, som i trin 8 i protokollen. Dette tal viser også en positiv kontrol (bakterier, der konstitutivt udtrykker RFP) og en negativ kontrol i form af SbRFP-enheden uden analysand tilføjet. Patron etuiet blev brugt som proof-of-princip-resultater. I fremtiden arbejde, hånd svaberprøver vil blive indsamlet fra personer, der er kendt for at have fyret en pistol for at vise, at sensorerne er lydhør over for hånd svaberprøver så godt.
| Komponent | 20 μL reaktion |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | 2 μL |
| Plasmid DNA (3 KB) | 3 μL |
| Promotor-DNA (0,7 KB) | 10 μL |
| Nuklease-frit vand | 4 μL af |
| T4 DNA Ligase | 1 μL af |
Tabel 1. Reaktionsblanding til ligation, protokol trin 3.1.1.
| Komponent | 25 μL reaktion |
| 10 μM fremad primer | 0,5 μL |
| 10 μM omvendt primer | 0,5 μL |
| EnTaq 2X Master Mix | 12,5 μL |
| Nuklease-frit vand | 11 μL |
Tabel 2. Reaktionsblandinger til koloni PCR, protokol trin 4,1.
| Trin | Temp | Tid |
| Indledende denaturering | 94 °C i | kun 30 s |
| 30 cyklusser | 94 °C i | kun 30 s |
| 55 °C i | 45 s | |
| 68 °C i | 60 s | |
| Endelig udvidelse | 68 °C i | 5 min. |
| Holde | 4 °C i |
Tabel 3. PCR-termo cyklisme parametre for protokol trin 4,3.
| Tube-ID | Bakterier | Koncentration af analysand opløsning tilsat (ppm) | Metal tilsat | Volumen af analysand opløsning tilsat til 2.000 μL bouillon | [analyt], PPB |
| 1 | Af PbRFP | 10 | Pb | 2,5 af | 12 |
| 2 | Af PbRFP | 10 | Pb | 75 af | 361 af |
| 3 | Af PbRFP | 10 | Pb | 150 af | 698 af |
| 4 | Af PbRFP | 0 | Ingen | 0 | 0 |
| 5 | RFP-neg | 10 | Pb | 10 | 50 af |
| 6 | RFP-pos | 10 | Pb | 10 | 50 af |
Tabel 4. Generelt eksperiment, der er oprettet til titrering af biosensorer, protokol trin 7,2.
Figur 1. Biologiske elementer af MicRoboCop-enhederne. (a) diagram over den generelle anordning til MicRoboCop i et plasmid med et ampicillin resistens-gen. (b) diagram over hver enhed, der er kombineret for at oprette MicRoboCop-systemet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fluorescens spektre af PbRFP-og TNT-RFP-bakterier ved tilstedeværelse og fravær af analysand. Data indsamlet på fluorimeter. a) Fluorescens spektre af PbRFP-bakterier ved tilstedeværelse og fravær af analysand (PB). b) Fluorescens SPEKTRE af TNT-RFP-bakterier ved tilstedeværelse og fravær af to analysander (2,4-DNT og 1, 3-DnB). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af det transportable spektrometer system og fluorimeter til påvisning af fluorescens spektre af PbRFP-bakterier ved tilstedeværelse og fravær af analysand (bly). a) blytitrerings data for PbRFP-sensor bakterier indsamlet på bærbart spektrometer system. b) blytitrerings data (samme prøver) for PbRFP-sensor bakterier indsamlet på fluorimeter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ethanol svaberprøver taget indefra af en. 40 kaliber brugte pistol patron til at vise respons af de tre enheder til GSR. S/N for alle signaler var større end 3, hvilket indikerer en positiv test for GSR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ændringer og fejlfinding
Det i tabel 4 beskrevne eksperiment kan på enhver måde ændres, så det passer til de sensorer, der er konstrueret. Det vigtigste aspekt af en kemisk sensor er at vurdere dens følsomhed og specificitet. Det er gavnligt at sikre, at en lang række koncentrationer af analytten analyseres for at bestemme sensorens nyttige analytiske område. Det er også værd at fastsætte et maksimum niveau af analysand for cellerne. Da de analysander, der anvendes i dette studie, er giftige metaller (PB og SB) eller organiske forbindelser i en methanol-opløsning (for TNT-derivater), er der et øvre niveau, hvor celledød som følge af analyteens eller opløsningens toksicitet vil forekomme (generelt højere end 500 – 1,0 00 PPB for de hidtil udførte eksperimenter).
Begrænsninger af teknikken
De resultater, der præsenteres i dette arbejde, er kvalitative i naturen, men har til formål at demonstrere de kvantitative kapaciteter af RFP modificeret E. coli. Følsomheden af sensoren kan variere betydeligt mellem dyrkede partier afhængigt af tætheden af cellerne i bouillon. Hvis der kræves kvantitative resultater, bør celle koncentrationen anslås ved at måle den optiske tæthed af de flydende kulturer før analyse. Hvis kulturernes optiske tæthed bestemmes, kan cellerne fortyndes hensigtsmæssigt for at reducere variabilitet mellem eksperimenter. Som en formodet test for de ønskede analyter, men den kvalitative "nuværende/ikke til stede" svar er acceptabelt for de ansøgninger, der diskuteres her. Levetiden for cellerne på agar pladen skal også bemærkes-tidligere arbejde har vist, at pladerne kan opbevares i køleskabet i op til 2 uger, men enhederne fungerer ikke særlig godt mod slutningen af denne tidsramme og videre.
En anden overvejelse er valget af udstyr, der anvendes til at analysere fluorescens signalet. Ved hjælp af en forskning grade Spektrofotometer med en 96-brønd plade læser giver mulighed for udvælgelse af eksakt excitation og emission bølgelængder, som kan øge følsomheden. Ved hjælp af dette system, kan resultaterne af op til 96 eksperimenter indsamles samtidigt. RFP-fluorescens kan også analyseres ved hjælp af et bærbart spektrometer system. Trans Portable instrumenter tillader typisk udvalgte excitations bånd, som måske eller måske ikke falder sammen med de maksimale excitation for den RFP-variant, der anvendes. Men så længe excitation bølgelængde er inden for en rimelig række af excitation Maxima, vil det bærbare instrument generelt være brugbar (dog med et tab i følsomhed). Omkostningerne ved de bærbare systemer er betydeligt mindre end den forskning grade Spektrofotometer, og bærbarhed kan helt sikkert være en fordel. Baseret på potentiel anvendelse af bakterierne, kan analytikeren beslutte, om de ekstra omkostninger og tab af bærbarhed med Spektrofotometer systemet er berettiget.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Det tredel MicRoboCop-system, der er beskrevet i dette arbejde, er beregnet til at blive anvendt som en kvalitativ, formodet test for tilstedeværelsen af GSR. I øjeblikket kræver "Gold standard" bevis test for GSR ekspertanalyse af SEM-EDX. SEM-EDX udstyr er dyrt og typisk drives af højt specialiserede analytikere. Derudover er GSR-evidens meget varierende i kriminalteknisk sagsbehandling, og mange variabler bidrager til aflejring af GSR på hænder og overflader16. En formodet mptive test for GSR kan være nyttigt for efterforskerne som giver sandsynlige årsag til en søgning af person eller ejendom. Sammenlignet med elektrokemiske tests eller tests såsom ionmobilitets spektroskopi tilbyder denne metode enkel, let tilgængelig instrumentering, som de fleste analytiske laboratorier bør have adgang til.
Andre applikationer
De anordninger, der er beskrevet i dette manuskript, er konstrueret til at blive kombineret i et tretrins system til den formodede identifikation af GSR. Men hver enhed i MicRoboCop-systemet (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) kan også bruges individuelt til at detektere kemisk kontaminering i fødevarer, vand eller miljøprøver. Tidligere arbejde har vist, at TNT-RFP-anordningen kan anvendes som en in situ -sensor til landminer13,17. Resultater præsenteret her og i vores tidligere arbejde10 har vist, at sbrfp og pbrfp-enheder kan detektere koncentrationer, der er lave nok til at konkurrere med dyrere og mere sofistikeret udstyr som Induktivt koblet plasma atomemissionsspektroskopi ( ICP-AES) og atomabsorptionsspektroskopi (AAS). SbRFP-sensoren er følsom over for arsen og antimon. Disse enheder kan give en billig mulighed for analyse af giftige tungmetaller forurening.
Den syntetiske biologi protokol til forberedelse af e. coli præsenteret her er gældende for ethvert system, der bruger standard syntetisk biologi genetiske dele til syntetisere e. coli , der udtrykke RFP. Den analytiske metode er anvendelig på ethvert system, der udtrykker RFP, og så kan bruges til at analysere enhver bakteriel biosensor system, der er blevet skabt ved hjælp af syntetiske biologi metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende de studerende på Longwood University i BIOL 324 (genetik) og de studerende i CHEM 403 (avanceret kemisk laboratorium problem løsning), der var involveret i den indledende forberedelse og afprøvning af antimon og bly biosensorer. Ideen til MicRoboCop blev udtænkt på GCAT SynBIO workshop (sommer 2014), som er finansieret af NSF og Howard Hughes Medical Institute og hostet af University of Maryland Baltimore County. Forfatterne anerkender også støtte modtaget fra Longwood universitetets Cook-Cole College of Arts and Sciences og GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
