Summary
Bir protokol, silah kalıntıları analizi için bir dizi bakteriyel biyosensör sentezlemek ve floresan spektroskopisi kullanılarak amaçlanan kullanım için cihazların çalışmasını sınamak için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak sunulmuştur.
Abstract
Microbocop adli Kimya benzersiz bir uygulama için tasarlanmış bir biyosensör olduğunu. MicRoboCop, birlikte kullanıldığında, üç anahtar analitinin (antimon, Lead ve organik bileşenleri) varlığında floresan sinyali üreterek silah kalıntılarının (GSR) varlığını belirtebilmekte olan üç cihazdan oluşan bir sistemdir. Protokol, Escherichia coli (E. coli) kullanarak biyosensörlerin sentezini ve sensörlerin seçicilik ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılan analitik kimya yöntemlerini açıklar. Sistemin işleyişi, harcanan bir kartuş muhafazanın içinden toplanan GSR kullanılarak gösterilmiştir. Hazırlanmış bir kez, biyosensörler gerekli kadar depolanabilir ve bu anahtar analitler için bir test olarak kullanılabilir. Üç analitlerden olumlu bir yanıt, GSR için bir tahmin pozitif test sağlar, her bir cihaz diğer örneklerde analitler (örneğin, içme suyunda kurşun kontaminasyonu için bir dedektör) tespit etmek için uygulamalar vardır. Sistemin ana sınırlaması pozitif bir sinyal için gereken zamandır; gelecekteki çalışmalar, yanıt süresini optimize etmek için farklı organizmaların incelenmesi gerektirebilir.
Introduction
Bir biyosensör, bir kimyasal maddenin veya analitin tespiti için kullanılabilecek bir yanıt üreten biyolojik bileşenleri (proteinler, nüklemik asitler veya bütün organizmalar gibi) kullanan herhangi bir analitik cihazdır. Örnek olarak, kömür madencilik endüstrisi, zehirli maden gazlarının varlığını algılamak için 20. yüzyılın çoğunu bir biyosensör kullandı: kömür madeninde kanarya1. Biyoloji organizmanın (Kanarya 's) bir kimyasal analizine (karbon monoksit) yanıt (ölüm veya sıkıntı) işçiler korumak için madenciler tarafından gözlendi. Daha modern ve sofistike bir örnekte, bakterilerin bir floresan proteinin ifadesi gibi belirli bir yanıtı sergileme yoluyla belirli bir kimyasal analitin varlığına yanıt vermek için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak değiştirilebilir.
Sentetik biyoloji, doğal olarak mevcut olmayan biyolojik cihazların ve sistemlerin inşası veya belirli bir amaç için mevcut biyolojik sistemlerin yeniden tasarımı anlamına gelen geniş bir terimdir2. Sentetik biyoloji, standart bir metodoloji ve cihazlar ve sistemlersentezlemek için kullanılabilecek standartlaştırılmış parçaların (Standart Sentetik Biyoloji Genetik elemanları) varlığı ile genetik mühendisliğinden ayrılır. Bir cihazıngenomuna, bir bakteri gibi bir organizmaya, fonksiyonun bir göstergesi olarak hizmet edecek belirli bir özelliği ifade etmek için bir parça tanıtılmaktadır. Örneğin, birçok sentetik cihazlarda, bir floresan proteinin ifadesi bir muhabir protein olarak tek bir hücreli organizmaya tanıtıldı. Birden çok aygıt bir sistemebirleştirilebilir. Bakteriler gibi mikroorganizmaların genomlar bu şekilde manipüle etmek kolaydır. Literatürde son on yıl içinde çok çeşitli kimyasal analitlere özgü biyosensörlerin çok sayıda örneği bildirilmiştir3,4.
Bu çalışmayla microbocop sistemi, adli ve çevresel kimyanın yeni uygulamaları ile sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak tasarlanan bir biyosensör örneği olarak sunulmuştur. MicRoboCop üç ayrı cihazların bir sistemdir, kombine, Escherichia coli kırmızı floresan protein (RFP) bir kişinin elleriyle veya bir yüzey toplanan silah kalıntı (GSR) varlığında ifade izin verecektir. Üç cihazın her biri, GSR5' in bir bileşeni olarak bilinen belirli bir kimyasal analit yanıt verir. Sistemin yanıt verdiği üç analitik, I. 2, 4, 6-Trinitrotoluen (TNT) ve ilgili bileşikler, II. (kurşun iyonlarının şeklinde) ve III. antimon (Ayrıca iyonlarının şeklinde).
GSR birçok farklı kimyasal madde içerir, ancak üç genellikle GSR olarak bir kalıntı tanımlamak için kullanılan Baryum, kurşun, ve antimon5. GSR tanımlaması için standart kanıt testi, enerji Dispersif X-ışını floresans (EDX)5ile Tarama elektron MIKROSKOBU (SEM) kullanmaktır. SEM-EDX, analistlerin benzersiz morfolojisi ve GSR 'nin Elemental bileşenlerini tanımlamasına olanak tanır. Şu anda, mevcut birkaç yaygın kullanılan ikili varsayımsal testler vardır. Son zamanlarda yayımlanan bir varsayım testi birçok Labs6mevcut olmayabilir özel ekipman iyon-mobilite spektroskopisi (IMS) kullanır. Genellikle mesafe belirlenmesi için veya mermi delikleri ve yaralar5GSR kimlik için kullanılan olsa da, kullanılabilecek bir kaç renk "Spot" testler vardır. Ayrıca, bu potansiyel alan taşınabilir olma avantajı vardır voltammetrik analiz, istihdam GSR için elektrokimyasal testler için literatürde bazı sınırlı dikkat olmuştur, ya da anodik sıyırma voltammetry, hangi bir son derece Metalik elemanlar için hassas Yöntem7. Diğer adli uygulamalar için bazı biyosensörler8yayınlandı olsa da, GSR tespit amacıyla özel olarak tasarlanmış biyosensörler literatürde çok az söz vardır.
MicRoboCop sistemindeki her cihaz için biyolojik unsurlar ve Plasmid inşaatı Şekil 1' de gösterilmiştir. Şekil 1B 'deki kavisli ok, analitin varlığını etkinleştiren Organizatör bölgesini temsil eder, oval, muhabir proteininin çevirisine izin veren ribozomal bağlayıcı sitedir, RFP etiketli gri kutu kırmızı ifade eden geni Floresan protein ve kırmızı sekizgen transkripsiyon sonlandırma sitesidir. Her üç cihaz, GSR algılamak için bir sistem olarak birlikte kullanılacaktır. Belirli bir promotör (SbRFP, PbRFP ve TNT-RFP) olan her cihaz, test edilen örnek ile inkübe edilecektir ve RFP floresans ölçülecektir. RFP sadece uygun kimyasal analitik mevcutsa ve organizatör bölgeyi aktive ederse ifade edilecektir. GSR 'de bulunan bazı kimyasal maddelere yanıt veren üç cihaz tasarlanmıştır ve bu çalışmanın içinde sunulmaktadır.
Üç mikrobocop cihazlarda kullanılan organizatör bir arsenik ve antimon duyarlı promotör, sbrfp9,10, bir kurşun duyarlı promotör, pbrfp11,12 ve bir TNT duyarlı promotör, TNT-RFP 13. çünkü literatürde bir arama Barium yanıt için tasarlanmış hiçbir Organizatör ortaya, TNT Organizatör bunun yerine seçildi bu Organizatör yapısal olarak ilgili bileşiklerin bir dizi duyarlı olduğundan (özellikle, 2, 4-dinitrotoluene ve dinitrobenzen), GSR 'de geride kalan organik bileşiklerin bir parçası olduğu bilinmektedir. Bu Organizatör, gömülü arazi madenlerinde13dakıka miktarları TNT ve 2, 4-Dinitrotoluen (2, 4-DNT) özellikle algılamak için başarıyla kullanılmıştır. Üç cihazı bir sistem olarak birlikte kullanarak, GSR için olumlu bir test, üç cihazda da floresan üretecek. Sadece bir veya iki cihazda floresans sinyali, analitin (s) başka bir çevresel kaynağını veya TNT promotör durumunda, GSR 'de kalan organik bir bileşik olmayan bir bileşik tarafından aktivasyonunu gösterecektir. Her üç cihazı birlikte kullanarak, çevresel kaynaklar nedeniyle yanlış olumlu sonuçlar olasılığı minimize edilir. Popülerlik kazanıyor kurşun-ücretsiz mühimmat, hala ABD 'de mühimmat satışları sadece yaklaşık% 5 temsil eder; Bu nedenle, kurşun yokluğunda nedeniyle yanlış olumsuz sonuçlar bir olasılık olabilir ama GSR14için bir marker olarak kurşun kullanan bir sensör hala yarar vardır. Bu özel adli uygulamaya ek olarak, her cihaz çevresel kontaminantların tespit edilmesi amacıyla ayrı olarak kullanılabilir.
Sunulan protokoller, cihazların fonksiyonunu kontrol etmek ve elde edilen floresan sinyalleri analiz etmek için cihazları (sensör bakterileri) ve analitik teknikleri oluşturmak için kullanılan sentetik biyoloji tekniklerini içerir. Protokol Ayrıca, bir şüphelinin elinden GSR toplamak veya bir yüzeyden GSR toplamak için sürüntü el silme şeklinde adli kanıtlar koleksiyonunu içerir. Kurşun sensör cihazının sonuçları, harcanan kartuş muhafazasını kullanarak GSR için olumlu bir testin gösterilmesi ile birlikte örnek sonuçlar olarak sunulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: RFP 'yi ifade eden E. coli sentezi sunulmuştur.
1. E. coli 'den PLASMID DNA 'sı hazırlanması
- Bir RFP geni ve ampisilin direnç geni ile bir Plasmid içeren ve e. coli 'yi, 37 °c ' de 24 saat boyunca 100 μg/ml ampisilin Içeren Luria broth (lb) agar tabakaları ile çözülür. Örneğin, sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden J10060 Plasmid kullanın (bkz. malzeme tablosu). J10060 Plasmid, pbad Organizatör bölgesinin ve ampikilin direnç geni kontrolü altında RFP (kırmızı floresan protein) için bir gen içerir. Alternatif olarak, E. coli Dönüştür (adım 3,2 BAKıN) lb agar plakaları üzerinde büyüme önce Plasmid ile.
- J10060 Plasmid içeren bir E. coli kültürünün 1 ml 'den DNA 'yı izole etmek için standart bir Sage protokolünü izleyin ( malzeme tablosunabakın). Aşağıdaki protokol amacı pbad Organizatör kaldırmak ve cihaz için istenen organizatör ile değiştirin etmektir.
- Plasmid Miniprep takipte, sindirim için hazır olana kadar dondurucuda DNA saklayın.
2. kısıtlama enzim sindirim
- EcoRI ve NheI sindirim için bir mikrosantrifüj tüpte aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL J10060 plazmid DNA (1. adımda izole), 8 μL su ve 1 μL her bir EcoRI ve NheI enzimleri 1 μL tampon ile önceden karıştırılır (bkz. malzeme tablosu).
- Organizör DNA 'sı için, ecori ve nhei sindirim için bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL tavlanmış Organizatör DNA dizileri (8 μL su ve 1 μL her bir ecori ve nhei enzimleri 1 μL tampon ile önceden karıştırılır.
- SB-, PB-, veya TNT-RFP için (bkz. malzeme tablosu), arabellekte oligonükleotidler çözülür (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm potasyum asetat), eşit molar konsantrasyonlarda inküye, ısı Için 94 °c 2 dakika, ve yavaş rahat oda sıcaklığında serin).
- Numuneleri, 10 μL 'ye ayarlanmış pipet ile yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
- 37 °C ' de 30 dak.
- Isı 80 °C ' de enzimleri 5 dakika boyunca inaktive ederler.
- Bir sonraki adıma hazır olana kadar dondurucuda sindirilmiş DNA 'Yı saklayın.
3. ligasyon ve dönüşüm
-
Ligasyon
- 2. adımda ecori ve nhei ile iki kez sindirilmiş olan Plasmid ve organizatör DNA 'yı kullanarak, buz üzerinde bir mikrosantrifüjlü tüpte Tablo 1 ' de gösterilen reaksiyon karışımı ayarlayın; T4 DNA ligaz son ekleyin.
Not: Tablo 1 belirtilen DNA boyutları için eklemek için 1:3 vektörü bir molar oranı kullanarak bir ligasyon gösterir. - Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ve mikrosantrifüjden kısaca reaksiyonu karıştırın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe.
- 65 ° c 'de ısı devre dışı 10 dk.
- 2. adımda ecori ve nhei ile iki kez sindirilmiş olan Plasmid ve organizatör DNA 'yı kullanarak, buz üzerinde bir mikrosantrifüjlü tüpte Tablo 1 ' de gösterilen reaksiyon karışımı ayarlayın; T4 DNA ligaz son ekleyin.
-
Dönüştürme
- Son buz kristalleri ortadan kalkıncaya kadar bir tüpü 20 μL DH5-Alpha yetkili E. coli hücresi ile çözün.
- Hücre karışımına 5 μL plazmid DNA 'Sı ekleyin. Dikkatle hücreleri ve DNA karıştırmak için tüp 4-5 kez fiske.
- 2 dakika boyunca buzun üzerine karışımı yerleştirin.
- Tam olarak 30 s için tam 42 °C Isı şok. Karıştırma.
- 2 dakika buz üzerine yerleştirin. Karıştırma.
- Pipet 380 μL oda sıcaklığında SOC karışımı içine. Hemen ampisilin (100 μg/mL) içeren LB agar plakasına yayılmış ve gece 37 °C ' de inküytir.
- Büyüme için 24 saat içinde plakaları kontrol edin.
- Conta filmi ile plakaları mühürleyin ve bir sonraki adıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.
4. koloni PCR
- Tablo 2' de gösterilen reaksiyon karışımlarının (4 reaksiyon tüpü kurmak) BIR PCR tüpüne ekleyin.
- Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile reaksiyonları karıştırın.
- Sarı bir pipet ucu kullanarak, dönüştürülmüş e. coli'nin bir kolonisini (veya çok küçük bir bölgeyi) kazımak. Bu E. coli 'nin bir kaydırmayı, kesilmiş olan yenı bir lb/ampicillin/agar plakasına aktarın ve Pipet ucunu PCR tüpüne takın. E. coli 'yi PCR karışımı ile karıştırmak için Pipet ucunu sallayın. Ek koloniler için üç kez daha tekrarlayın. PCR tüplerini bir PCR makinesine aktarın ve Tablo 3' te gösterilen programı kullanarak termobisiklet başlayın.
- Hangi kolonilerin Plasmid içine en iyi ligasyon olduğunu ve yeni bir plaka üzerinde bu kolonileri büyümek belirlemek için Tae% 2 agaroz jel kullanarak jel elektroforezi çalıştırın.
- Test için hazır olana kadar tabakları buzdolabında saklayın. Kimyasal testler için eklenen 100 μg/mL ampisilin ile Luria suyu içinde sıvı kültürü hazırlayın.
5. DNA sıralaması
- Her örnek için, 5 μL plazmid, 4 μL sıralı astar ve 3 μL deiyonize su ekleyin.
- Bu karışımı bir tüp içine yerleştirin ve DNA sıralaması için gönderin (bkz. malzeme tablosu).
- DNA dizisi verilerini analiz ederek, mutasyon olmadığından ve genlerin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için DNA dizisi analiz yazılımını kullanarak beklenen ve gözlenen DNA dizisini karşılaştırın.
Not: bir kimyasal sensör olarak E. coli kullanımı aşağıda sunulmuştur.
6. E. coli kültürlerinin hazırlanması
- Sıvı kültürler için 100 μg/mL ampisilin ile LB hazırlayın.
- Sensör bakterilerinin sıvı kültürlerini, pozitif kontrol * bakterileri ve negatif kontrolü * * bakterileri hazırlayın.
Not: * pozitif kontrol bakterileri: bir kurucu Organizatör kontrol altında RFP geni ile bir Plasmid içeren E. coli ; Plasmid E1010 sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden (bkz. malzeme tablosu) Bu çalışma kullanılmıştır.
* * Negatif kontrol bakterileri: pBad promotör (sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden Plasmid J10060) gibi farklı bir promotör kontrolü altında RFP geni ile bir Plasmid içeren E. coli (bkz. tablo Malzeme)) veya RFP geni olmayan bir Plasmid. - Kültürlerin 37 °C ' de bir sallayarak kuluçk içine yerleştirin ve 220 RPM en az 8 saat, en fazla 18 h. bulutlu suyu bakteriyel büyüme gösterir.
7. titreyme E. coli cihazın fonksiyonunu kontrol etmek
Not: sensörler fonksiyonu kontrol etmek için titoy edildikten sonra, bu adımın tekrarlanabilmesi gerekmez. Kurşun, antimon ve 2, 4-DNT veya 1, 3-dinitrobenzen (1, 3-DNB) ilavesi şeklinde olumlu bir kontrol, tam titrasyon gerek kalmadan her kullanım için cihazların fonksiyonunu kontrol edebilirsiniz.
- Su içinde 10 ppm konsantrasyonuyla ilgilendiğiniz analitin (s) hisse senedi çözümünü hazırlayın. Çözünürlük bir sorundur, bir 50/50 su/metanol karışımı kullanın.
- Bir kılavuz olarak Tablo 4 kullanarak, steril Kültür tüpleri uygun sayıda etiket ve yer 2 kültür suyu ml (protokol adım 6) her tüp içine.
Not: genel bir analitik aralığı belirlemek için, sensör bakterileri ile en az üç farklı seviyede bir analit, negatif kontrol ile bir seviye ve pozitif kontrol ile bir seviye yapın. Ayrıca hiçbir eklenen metal (negatif kontrol başka bir tür) olan bakterilerin her biri bir tüp olmalıdır. Analitik aralığı ve algılama sınırlarını daha doğru şekilde belirlemek için daha geniş bir analitik konsantrasyonları yelpazesi kullanın. - Tablo 4' te belirtildiği gibi 2 ml suyu içeren tüplere analit stok çözümü ekleyin, böylece gevşek (tüpün içine hava akışına izin vermek) ve kültür tüpünü yerleştirmek için kültür tüpüne ek kapakları yerleştirin.
- En az 24 saat boyunca 220 rpm ve 37 °C ' de sallama kuluçkasında yer alan, Kültür tüpleri üzerinde gevşek kapaklar bırakarak.
- Tüplerini kuluçta çıkarın, kapakları sıkı bir şekilde tüplere çekin ve flüoresan analizine hazır olana kadar tüpleri buzdolabında saklayın.
8. GSR için E. coli 'yi kimyasal sensör olarak kullanma
- Kurşun kaldırmak için tasarlanmış bir etanol tabanlı silme kullanarak ( malzeme tablosunabakın), parmakların arasında da dahil olmak üzere, ellerin tüm yüzeyleri silin. Her el için ayrı bir temizleme kullanın. Mendilleri, analizine kadar uygun şekilde etiketli mühürlenebilir bir poşet içinde saklayın.
- Test edilecek yüzeyler için: büyük yüzeyler için alkol bazlı bir silme veya küçük yüzeyler için etanol ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın.
Not: sensörlerin GSR 'e yanıtını göstermek Için, harcanmış bir. 40 kalibreli kartuş Kasası, etanol nemlendirilmiş pamuklu bir çubukla temizlenmiş. - Temiz eldiven giyen ve alkol ile temizlenmiş makas kullanarak, silme merkezinin yaklaşık 1 cm2 bölümünü kesti.
- El silme veya pamuk çubukunun kesme parçasını, 2 mL sensör bakterisi içeren bir kültür tüpüne doğrudan yerleştirin, bu da suyunda batmasını sağlar.
- 7,4 – 7,5 adımda yukarıda açıklandığı gibi devam edin.
9. Portatif Spektrometre kullanılarak floresans Analizi (bkz. malzeme tablosu)
- Tüpleri sallamak için bir Vortex karıştırıcı kullanın.
- Spektrometre, 500 Nm 'lik bir uyarma dalga boyu ile RFP varyantınız için uygun dalga boyunda floresan emisyonunu toplamak için hazırlayın.
- Boş bir spektrum kaydetmek için Luria suyu kullanın.
- Dikkatle her süpernatant düşük hacimli küvet için transfer ve emisyon yoğunluğu toplamak.
10.96-Well plaka okuyucu kullanarak floresan Analizi (bkz. malzeme tablosu)
- Tüpleri sallamak için bir Vortex karıştırıcı kullanın.
- Transfer 200 mL suyu iyi tabak içinde bir kuyu için. Hangi numunelerin plakanın her bir kuyusu içine girmiş olduğunu kaydedin.
- RFP varyantı için uygun dalga boyunda emisyon yoğunluğunu toplamak için fluorimetreyi ayarlayın.
11. veri analizi
- Tüm negatif kontrollerden elde edilen sinyalin kullanılması (RFP negatif bakteri veya analiz eklenmeden sensör bakterileri), arka plan için Ortalama bir floresan sinyali hesaplayın.
- Sensör bakterileri için elde edilen her floresan sinyalinden, arka planda düzeltilmiş floresan yoğunluğu elde etmek için Ortalama arka plan sinyalini çıkarın.
- Arka planda düzeltilmiş floresan yoğunluğunu ortalama arka plan sinyaliyle bölerek sinyal-gürültü (S/N) oranını tahmin edin. S/N oranı 3 ' ten büyükse, test pozitif olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışta kullanılan RFP varyantı için floresan spektrumları Şekil 2' de gösterilir. Bu veriler, iki analitik, 2, 4-DNT ve 1, 3-DNB yanıt olarak kurşun ve TNT-RFP cihaza yanıt olarak PbRFP cihazdan. Bu rakam bir negatif kontrol spektrumunu gösterir (hiçbir analit eklendi), ve analitik iki farklı düzeylerde spektrum ekledi. Kullanılan RFP varyantı için maksimum floresan sinyali 575 Nm (uyarma dalga boyu 500 Nm) olarak gözlenmiştir. Şekil 3 ' teki veriler, protokolün 7. adımda olduğu gibi, PbRFP cihazının tek bir titrasyon denemenin (dolayısıyla hiçbir hata çubuğu dahil) temsilcisidir. Şekil 3A , taşınabilir spektrometreden toplanan verileri gösterir, Şekil 3B ise fluorimetreden toplanan verileri gösterir (aynı çözüm setinden). Metal artışı konsantrasyonu olarak floresans artan genel bir eğilim vardır. Bu yüksek konsantrasyonlarda, yaklaşık 800 PPB daha büyük, yanıt böyle bir yüksek konsantrasyonda metal toksisitesi nedeniyle kapalı düşer dikkati çekiyor. Bu maksimum yanıt düzeyi, kullanılan Analize bağlı olarak değişebilir. SbRFP ile önceki çalışmalarımız, bakterilerin arsenik veantimon 10' a kadar (en az 1.000 PPB 'ye kadar) daha yüksek seviyelere tahammül ettiğini göstermiştir. El bezlerinden toplanan bu analitlerin seviyeleri hakkında literatür, bu kurşun ve antimon düzeylerinin bir el çubukla15' ten toplanan olabilir ile tutarlı olduğunu gösterir. Ayrıca, Şekil 4 ' te sunulan sonuçlar, bakterilerin, bir el çubuklarından toplanan olandan önemli ölçüde daha yüksek olacak hücre ölümü olmadan bir kartuş durumda bulunan analitlerin miktarlarını tolere edebilir olduğunu göstermektedir.
Bu veriler için hesaplanan S/N değerlerini kullanarak, en düşük algılanabilir düzey müşteri adayı 12 PPB 'dir (3 ' ten büyük bir S/N tarafından tanımlandığı şekilde algılanabilir). Buna karşılık, taşınabilir Spektrometre verileri için S/N, test edilen en üst düzeyde sadece 2 ' dir. Ancak, artan analit konsantrasyonu ile floresans artan eğilim hala açıkça belirtilmiştir.
Şekil 4A , GSR için pozitif bir test gösterir. Bu sonucu elde etmek için, bir harcanan. 40 kalibreli kartuş muhafazanın içinden etanol bezlerden toplandı ve protokolün 8. adımda olduğu gibi üç sensör bakteriye eklenmiştir. Bu rakam aynı zamanda pozitif bir kontrol (kurucu RFP ifade bakteri) ve hiçbir analit eklenen SbRFP cihaz şeklinde negatif bir kontrol gösterir. Kartuş kılıf bezlerden, ilke kanıtı sonuçları olarak kullanıldı. Gelecekteki çalışmalar, el bezlerden sensörler el bezlerden de yanıt olduğunu göstermek için bir silah ateş var bilinen kişilerden toplanır.
| Bileşen | 20 μL REAkSIyON |
| 10X T4 DNA ligaz tampon | 2 μL |
| Plasmid DNA 'Sı (3 KB) | 3 μL |
| Organizör DNA (0.7 KB) | 10 μL |
| Nuclease-ücretsiz su | 4 μL |
| T4 DNA ligaz | 1 μL |
Tablo 1. Ligasyon için reaksiyon karışımı, protokol adım 3.1.1.
| Bileşen | 25 μL reaksiyon |
| 10 μM Ileri astar | 0,5 (μL) |
| 10 μM ters astar | 0,5 (μL) |
| BirTaq 2x Master Mix | 12,5 (μL) |
| Nuclease-ücretsiz su | 11 μL |
Tablo 2 ' ye. Koloni PCR için reaksiyon karışımları, protokol adım 4,1.
| Adım | Temp | Zaman |
| İlk denaturation | 94 °C derece | 30 sn |
| 30 döngü | 94 °C derece | 30 sn |
| 55 °C derece | 45 s | |
| 68 °C derece | 60 s | |
| Final uzatma | 68 °C derece | 5 dk. |
| Tutun | 4 °C ' ye kadar |
Tablo 3. Protokol adım 4,3 için PCR termobisiklet parametreleri.
| Tüp KIMLIĞI | Bakteri | Analitik çözümün konsantrasyonu eklendi (ppm) | Metal eklendi | 2.000 μL suyu 'a eklenen analit çözeltisi hacmi | [analit], PPB |
| 1 | PbRFP profili | 10 | Pb | 2,5 | 12 |
| 2 | PbRFP profili | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP profili | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP profili | 0 | Hiçbiri | 0 | 0 |
| 5 | RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | RFP POS | 10 | Pb | 10 | 50 |
Tablo 4. Genel deney biyosensörler titrasyon için ayarlanmış, protokol adım 7,2.
Şekil 1. MicRoboCop cihazların biyolojik unsurları. (a) Mikrobocop için genel cihazın bir ampisilin direnç geni ile Plasmid içinde diyagramı. (b) MicRoboCop sistemi oluşturmak için birleştirilmiş her aygıtın diyagramı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. PbRFP ve TNT-RFP bakterilerinin floresans spektrumunda analitin varlığı ve yokluğunda. Fluorimetre üzerinde toplanan veriler. (a) analitin varlığı ve yokluğunda PbRFP bakterilerinin floresan spektrumları (Pb). (b) TNT-RFP bakterilerinin floresans spektrumları iki Analin varlığı ve yokluğunda (2, 4-DNT ve 1, 3-dnb). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Analitik (kurşun) varlığı ve yokluğunda PbRFP bakterilerin floresan spektrumları tespiti için taşınabilir Spektrometre sistemi ve Fluorimetre karşılaştırılması. (a) taşınabilir Spektrometre sisteminde toplanan PbRFP sensör bakteriler için kurşun titrasyon verisi. (b) fluorimetre üzerinde toplanan PbRFP sensör bakterileri için kurşun titrasyon verisi (aynı numune). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. A. 40 kalibreli içinden alınan etanol bezlerden, üç cihazın GSR 'ye tepkisi için tabanca kartuşunu geçirdi. Tüm sinyaller için S/N, GSR için olumlu bir test gösteren 3 ' ten büyükse. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme
Tablo 4 ' te açıklanan deney, tasarlanmış sensörlere uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kimyasal sensörün en önemli yönü, duyarlılık ve özgüllüğü değerlendirmektir. Sensörün kullanışlı analitik aralığını belirlemek için çok çeşitli analitik konsantrasyonlarının analiz edildiğinden emin olmak yararlıdır. Aynı zamanda hücreler için en yüksek düzeyde analit belirlemekte değer. Bu çalışmada kullanılan analitler toksik metaller (PB ve SB) veya bir metanol çözeltisi (TNT türevleri için) organik bileşikler olduğu için, hangi hücre ölümü analit veya çözelti toksisitesi nedeniyle meydana gelecek bir üst seviye vardır (genellikle daha yüksek 500 – 1, 0 Şu ana kadar gerçekleştirilen deneyler için 00 PPB).
Tekniğin sınırlamaları
Bu çalışmalarda sunulan sonuçlar doğada niteliksel ancak RFP değiştirilmiş E. colinicel yeteneklerini göstermek için tasarlanmıştır. Sensörün hassasiyeti, suyundaki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak kültürlü gruplar arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Nicel sonuçlar gerekiyorsa, analiz öncesinde sıvı kültürlerin optik yoğunluğunu ölçerek hücre konsantrasyonu tahmin edilmelidir. Kültürlerin optik yoğunluğu belirleniyorsa, bu hücreler, deneyler arasındaki değişkenliği azaltmak için uygun şekilde seyreltilebilir. İstenilen analitler için bir varsayımsal test olarak, ancak, niteliksel "mevcut/mevcut değil" Yanıt burada tartışılan uygulamalar için kabul edilebilir. Agar plaka üzerindeki hücrelerin yaşam süresi de unutulmamalıdır-önceki çalışma plakaları kadar için buzdolabında depolanabilir göstermiştir 2 hafta, ama cihazlar çok iyi bu zaman çerçevesi ve ötesinde sonuna doğru çalışmaz.
Başka bir göz floresans sinyali analiz etmek için kullanılan ekipman seçimdir. 96-Well plaka okuyucu ile bir araştırma Grade spektrofotometre kullanarak hassasiyet artırabilir tam uyarılma ve emisyon dalga boyları, seçimi sağlar. Bu sistemi kullanarak 96 ' e kadar deneylerin sonuçları aynı anda toplanabilir. RFP flüoresan, taşınabilir Spektrometre sistemi kullanılarak da analiz edilebilir. Taşınabilir aletler genellikle kullanılan RFP varyantı uyarma Maxima ile çakışabilir veya olmayabilir seçilen uyarma bantları, izin verir. Ancak, uyarılma dalga boyu uyarılma Maxima makul bir aralığı içinde olduğu sürece, taşınabilir enstrüman genellikle (hassasiyet kaybı olsa) servis edilebilir olacaktır. Taşınabilir sistemlerin maliyeti araştırma derecesi spektrofotometresinin önemli ölçüde küçüktür ve taşınabilirlik kesinlikle bir avantaj olabilir. Bakterilerin potansiyel uygulamaya dayanarak, analist spektrofotometre sistemi ile ek maliyet ve taşınabilirlik kaybı haklı olup olmadığına karar verebilirsiniz.
Mevcut yöntemlerle ilgili önem
Bu çalışmanın anlatıldığı üç parçalı MicRoboCop sistemi, GSR varlığı için niteliksel, varsayımsal bir test olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Şu anda, GSR için "altın standart" kanıt testi SEM-EDX tarafından uzman analizi gerektirir. SEM-EDX ekipmanları pahalıdır ve genellikle son derece uzmanlaşmış analistler tarafından işletilmektedir. Ayrıca, GSR kanıtı adli kasework 'te son derece değişkendir ve birçok değişken el ve yüzey16' da GSR 'nin birikmesine katkıda bulunur. GSR için bir varsayımsal test, kişi veya mülkiyet arama için olası neden sağlayan olarak müfettişlere yararlı olabilir. Elektrokimyasal testler veya iyon hareketlilik spektroskopisi gibi testler ile karşılaştırıldığında, bu yöntem en analitik laboratuvarların erişimi olması gereken basit, kolayca kullanılabilir enstrümantasyon sunar.
Diğer uygulamalar
Bu yazıda anlatılan cihazlar, GSR 'nin varsayımsal tanımlaması için üç parçalı bir sisteme birleştirilmek üzere tasarlanmıştır. Ancak, MicRoboCop sistemindeki her cihaz (SbRFP, PbRFP ve TNT-RFP) Ayrıca gıda, su veya çevresel örneklerde kimyasal kontaminasyonu algılamak için bireysel olarak da kullanılabilir. Önceki çalışma TNT-RFP cihazın Arsa mayın için bir in situ sensör olarak kullanılabilir göstermiştir13,17. Sonuçları burada sunulan ve önceki çalışma10 Sbrfp ve pbrfp cihazların indüktif olarak bağlı plazma atomik emisyon spektroskopisi gibi daha pahalı ve sofistike ekipman rakip için yeterli düşük konsantrasyonları algılayabilir göstermiştir ( ICP-AES) ve atomik emilim spektroskopisi (AAS). SbRFP sensörü, arsenik ve antimon hassasiyetine sahiptir. Bu cihazlar toksik ağır metal kirliliğini analiz etmek için düşük maliyetli bir seçenek sağlayabilir.
Burada sunulan e. coli hazırlamak için sentetik biyoloji Protokolü RFP ekspres e. coli sentezlemek için standart Sentetik Biyoloji Genetik parçaları kullanan herhangi bir sistem için geçerlidir. Analitik yöntem RFP ifade eden herhangi bir sistem için geçerlidir ve bu nedenle sentetik biyoloji yöntemleri kullanılarak oluşturulan herhangi bir bakteriyel biyosensör sistemi analiz etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rekabet mali çıkarları veya ifşa ilgi diğer çatışmalar var.
Acknowledgments
Yazarlar, Longwood Üniversitesi 'nde BıOL 324 (genetik) ve CHEM 403 (gelişmiş kimyasal laboratuar problemi çözme) öğrencileri, antimon ve kurşun biyosensörlerin ilk hazırlığı ve testinde yer alan öğrencileri kabul etmek ister. MicRoboCop için fikir GCAT SynBIO atölye (Yaz 2014), hangi NSF ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından finanse edilir ve Maryland Üniversitesi Baltimore County tarafından barındırılan tasarlandı. Yazarlar ayrıca Longwood Üniversitesi Cook-Cole College of Arts and Sciences ve GCAT SynBio mezunlar hibe alınan fon kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
