Summary
Un protocolo se presenta utilizando técnicas de biología sintética para sintetizar un conjunto de biosensores bacterianos para el análisis de residuos de disparos, y para probar el funcionamiento de los dispositivos para su uso previsto utilizando espectroscopía de fluorescencia.
Abstract
MicRoboCop es un biosensor que ha sido diseñado para una aplicación única en la química forense. MicRoboCop es un sistema formado por tres dispositivos que, cuando se usan juntos, pueden indicar la presencia de residuos de disparos (GSR) produciendo una señal de fluorescencia en presencia de tres analitos clave (antimonio, plomo y componentes orgánicos de GSR). El protocolo describe la síntesis de los biosensores utilizando Escherichia coli (e. coli), y los métodos de química analítica utilizados para evaluar la selectividad y sensibilidad de los sensores. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante el uso de GSR recogido desde el interior de una carcasa de cartucho gastado. Una vez preparados, los biosensores se pueden almacenar hasta que se necesiten y se pueden utilizar como prueba para estos analitos clave. Una respuesta positiva de los tres analitos proporciona una prueba positiva presuntiva para la GSR, mientras que cada dispositivo individual tiene aplicaciones para detectar los analitos en otras muestras (p. ej., un detector de contaminación por plomo en el agua potable). La principal limitación del sistema es el tiempo necesario para una señal positiva; trabajo futuro puede implicar el estudio de diferentes organismos para optimizar el tiempo de respuesta.
Introduction
Un biosensor es cualquier dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (como proteínas, ácidos nucleicos o organismos enteros) que producen una respuesta que se puede utilizar para la detección de una sustancia química o un analito. Como ejemplo, la industria minera de carbón utilizó un biosensor durante gran parte del siglo 20 para detectar la presencia de gases tóxicos de la mina: el canario en la mina de carbón1. Los mineros observaron la respuesta del organismo biológico (muerte o angustia) a un analito químico (monóxido de carbono) con el fin de proteger a los trabajadores. En un ejemplo más moderno y sofisticado, las bacterias se pueden alterar utilizando técnicas de biología sintética para responder a la presencia de un determinado analito químico mediante la exposición de una respuesta específica, como la expresión de una proteína fluorescente.
La biología sintética es un término amplio que se refiere a la construcción de dispositivos biológicos y sistemas que no existen de forma natural, o el re-diseño de los sistemas biológicos existentes para un propósito específico2. La biología sintética se distingue de la ingeniería genética por una metodología estándar y la existencia de piezas estandarizadas (elementos genéticos de biología sintética estándar) que se pueden utilizar para sintetizar dispositivos y sistemas. Una parte se introduce en el genoma de un dispositivo, un organismo como una bacteria, para expresar un cierto rasgo que servirá como una indicación de la función. Por ejemplo, en muchos dispositivos sintéticos, la expresión de una proteína fluorescente se introduce en un organismo unicelado como una proteína reportera. Se pueden combinar varios dispositivos en un sistema. Los genomas de microorganismos como las bacterias son fáciles de manipular de esta manera. Se han notificado numerosos ejemplos de biosensores específicos de una amplia gama de analitos químicos en la bibliografía de la última década3,4.
En este trabajo, el sistema MicRoboCop se presenta como un ejemplo de un biosensor diseñado utilizando técnicas de biología sintética con nuevas aplicaciones en la química forense y ambiental. MicRoboCop es un sistema de tres dispositivos separados que, cuando se combinan, permitirán a Escherichia coli expresar proteína fluorescente roja (RFP) en presencia de residuos de disparos (GSR) que se han recogido de las manos o de la superficie de una persona. Cada uno de los tres dispositivos responde a un analito químico específico que se sabe que es un componente de GSR5. Los tres analitos a los que responde el sistema son I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) y compuestos relacionados, II. plomo (en forma de iones de plomo), y III. Antimonio (también en forma de iones).
GSR consiste en muchas sustancias químicas diferentes, pero los tres generalmente utilizados para identificar un residuo como GSR son bario, plomo, y antimonio5. La prueba probatoria estándar para la identificación de GSR es utilizar microscopía electrónica de barrido (SEM) con fluorescencia de rayos X de dispersión de energía (EDX)5. SEM-EDX permite a los analistas identificar la morfología única y los componentes elementales de GSR. En la actualidad, hay pocas pruebas presuntivas binarias ampliamente utilizadas disponibles. Una prueba presuntiva recientemente publicada utiliza espectroscopía de movilidad iónica (IMS), que es un equipo especializado que podría no estar disponible en muchos laboratorios6. También hay algunas pruebas de color "spot" que se pueden utilizar, aunque se utilizan típicamente para la determinación de la distancia o para la identificación GSR en los agujeros de la bala y las heridas5. Adicionalmente, ha habido cierta atención limitada en la literatura a las pruebas electroquímicas para GSR que emplean el análisis voltamométrico, que tiene la ventaja de ser potencialmente portable en el campo, o voltametría de desmonte anódico, que es un extremadamente método sensible para los elementos metálicos7. Hay muy poca mención en la literatura de biosensores diseñados específicamente con el propósito de detectar GSR, aunque algunos biosensores para otras aplicaciones forenses han sido publicados8.
Los elementos biológicos para cada dispositivo en el sistema MicRoboCop, y la construcción del plásmido, se ilustran en la figura 1. La flecha curvada en la figura 1B representa la región promotora que se activa en presencia del analito, el óvalo es el sitio de Unión ribosomal que permite la traducción de la proteína reportera, la caja gris ETIQUETADA como RFP es el gen que expresa el rojo proteína fluorescente, y el octágono rojo es el sitio de terminación de la transcripción. Los tres dispositivos se utilizarán juntos como un sistema para detectar GSR. Cada dispositivo con un promotor específico (SbRFP, PbRFP y TNT-RFP) será incubado con la muestra que se está probando y se medirá la fluorescencia de RFP. La RFP solo se expresará si el analito químico adecuado está presente y activa la región promotora. Tres dispositivos que responden a algunas de las sustancias químicas presentes en GSR han sido diseñados y se presentan en este trabajo.
Los promotores utilizados en los tres dispositivos de microbocop son un promotor sensible al arsénico y antimonio, sbrfp9,10, un promotor sensible al plomo, pbrfp11,12 y un promotor sensible de TNT, TNT-RFP 13. debido a que una búsqueda en la literatura no reveló ningún promotor diseñado para responder a Barium, el promotor de TNT fue seleccionado en su lugar ya que este promotor es sensible a una serie de compuestos estructuralmente relacionados (en particular, 2, 4-dinitrotolueno y dinitrobenceno) que son conocidos por ser una parte de los compuestos orgánicos dejados atrás en GSR. Este promotor se ha utilizado con éxito para detectar específicamente cantidades minutas de TNT y 2, 4-dinitrotolueno (2, 4-DNT) en las minas terrestres enterradas13. Utilizando los tres dispositivos juntos como un sistema, una prueba positiva para GSR producirá fluorescencia en los tres dispositivos. Una señal de fluorescencia en sólo uno o dos dispositivos indicará otra fuente ambiental del analito (s) o en el caso del promotor de TNT, activación por un compuesto que no es un compuesto orgánico dejado atrás en GSR. Mediante el uso de los tres dispositivos juntos, se minimiza la posibilidad de resultados falsos positivos debido a las fuentes ambientales. La munición sin plomo, que está ganando popularidad, todavía representa sólo el 5% de las ventas de municiones en los Estados Unidos; por lo tanto, los resultados falsos negativos debido a la ausencia de plomo pueden ser una posibilidad, pero todavía hay utilidad en un sensor que utiliza plomo como marcador para GSR14. Además de esta aplicación forense específica, cada dispositivo se puede utilizar por separado con el fin de detectar contaminantes ambientales.
Los protocolos presentados incluyen las técnicas de biología sintética utilizadas para crear los dispositivos (bacterias del sensor) y las técnicas analíticas para comprobar la función de los dispositivos y analizar las señales de fluorescencia obtenidas. El protocolo también incluye la recolección de evidencia forense en forma de limpieza de manos para recoger GSR de las agujas de un sospechoso o hisopado para recoger GSR de una superficie. Los resultados del dispositivo del sensor de plomo se presentan como resultados de ejemplo, junto con una demostración de una prueba positiva para GSR utilizando una carcasa de cartucho gastado.
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Protocol
Nota: se presenta la síntesis de E. coli expresando RFP.
1. preparación del ADN plásmido de E. coli
- Descongelar e. coli conteniendo un plásmido con un gen RFP y un gen de resistencia a la ampicilina y cultivar las placas de agar e. coli en el caldo Luria (LB) que contienen 100 μg/ml de ampicilina a 37 ° c durante 24 h. Por ejemplo, utilice el plásmido J10060 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales). El plásmido J10060 incluye un gen para RFP (proteína fluorescente roja) bajo el control de una región promotora de pBad y un gen de resistencia a la ampicilina. Alternativamente, transforme E. coli (consulte el paso 3,2) con el plásmido antes del crecimiento en las placas de agar lb.
- Siga un protocolo estándar de qiagenminiprep (consulte la tabla de materiales) para aislar el ADN de 1 ml de una cultura de E. coli que contenga el plásmido J10060. El propósito del siguiente protocolo es quitar el promotor pBad y reemplazarlo con el promotor deseado para el dispositivo.
- Después del plásmido Miniprep, almacene el ADN en el congelador hasta que esté listo para la digestión.
2. digestión de enzimas de restricción
- Establecer la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de ADN plásmido J10060 (aislado en el paso 1), 8 μL de agua y 1 μL de enzimas EcoRI y NheI premezcladas con 1 μL de tampón (ver tabla de materiales).
- Para el ADN promotor, establecer la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de secuencias de ADN promotor recocido (8 μL de agua, y 1 μL cada una de las enzimas EcoRI y NheI pre-mezclado con 1 μL de tampón.
- Para SB-, PB-, o TNT-RFP (ver tabla de materiales), disolver los oligonucleótidos en buffer (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm acetato de potasio), incubar en concentraciones molar iguales, calentar a 94 ° c durante 2 min, y enfriar gradualmente a temperatura ambiente).
- Mezcle las muestras pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con el conjunto de pipetas a 10 μL.
- Incubar durante 30 min a 37 ° c.
- El calor inactiva las enzimas a 80 ° c durante 5 min.
- Almacene el ADN digerido en el congelador hasta que esté listo para el siguiente paso.
3. ligadura y transformación
-
Ligadura
- Utilizando el plásmido y el ADN promotor que fueron digeridos doble con EcoRI y NheI en el paso 2, configurar la mezcla de reacción mostrada en la tabla 1 en un tubo de microcentrífuga sobre hielo; Agregue la ligasa de ADN T4 por última vez.
Nota: la tabla 1 muestra una ligadura utilizando una relación molar de vector 1:3 para insertar para los tamaños de ADN indicados. - Mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y microcentrífuga brevemente.
- Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Inactivar el calor a 65 ° c durante 10 min.
- Utilizando el plásmido y el ADN promotor que fueron digeridos doble con EcoRI y NheI en el paso 2, configurar la mezcla de reacción mostrada en la tabla 1 en un tubo de microcentrífuga sobre hielo; Agregue la ligasa de ADN T4 por última vez.
-
Transformación
- Descongelar un tubo con 20 μL de células de E. coli competentes de Dh5-Alpha en hielo hasta que desaparezcan los últimos cristales de hielo.
- Añadir 5 μL de ADN plásmido a la mezcla celular. Deslice cuidadosamente el tubo 4-5 veces para mezclar las células y el ADN.
- Coloque la mezcla sobre hielo durante 2 min.
- Choque térmico a exactamente 42 ° c por exactamente 30 s. No mezclar.
- Colocar sobre hielo durante 2 min. No mezclar.
- Pipetear 380 μL de temperatura ambiente SOC en la mezcla. Inmediatamente se extendió sobre una placa de agar LB que contiene ampicilina (100 μg/mL) e incubar durante la noche a 37 ° c.
- Compruebe las placas dentro de las 24 h para el crecimiento.
- Selle las placas con una película de sellado y guárdela en el refrigerador hasta que esté lista para el siguiente paso.
4. PCR de colonias
- Añadir a un tubo PCR (configurar 4 tubos de reacción) las mezclas de reacción que se muestran en la tabla 2.
- Mezcle suavemente las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Utilizando una punta de pipetas amarilla, raspe una colonia (o región muy pequeña) de la E. colitransformada. Transfiera un barrido de este E. coli a una nueva placa lb/ampicilina/agar que se haya seccionado y, a continuación, inserte la punta de la Piera en el tubo de PCR. Agitar la punta de la Piera para mezclar la E. coli con la mezcla de PCR. Repita tres veces más para las colonias adicionales. Transfiera los tubos de PCR a una máquina de PCR y comience a termociclando utilizando el programa que se muestra en la tabla 3.
- Ejecutar electroforesis en gel utilizando un gel de agarosa al 2% en TAE para determinar qué colonias tienen la mejor ligadura en el plásmido y cultivar esas colonias en una placa nueva.
- Almacene las placas en el refrigerador hasta que estén listas para la prueba. Prepare un cultivo líquido en el caldo Luria con 100 μg/mL de ampicilina añadido para las pruebas químicas.
5. secuenciación de ADN
- Para cada muestra, añadir 5 μL de plásmido, 4 μL de la imprimación de secuenciación y 3 μL de agua desionizada.
- Coloque esta mezcla en un tubo y envíelo para la secuenciación de ADN (ver tabla de materiales).
- Analice los datos de la secuencia de ADN para comparar las secuencias de ADN esperadas y observadas utilizando el software de análisis de secuencias de ADN para asegurar que no haya mutación y que los genes se insertaron correctamente.
Nota: a continuación se presenta el uso de E. coli como sensor químico.
6. preparación de cultivos de E. coli
- Preparar LB con 100 μg/mL de ampicilina para cultivos líquidos.
- Preparar cultivos líquidos de las bacterias del sensor, el control positivo * bacterias y el control negativo * * bacterias.
Nota: * bacterias de control positivo: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo el control de un promotor constitutivo; en este trabajo se utilizó plásmido E1010 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales).
* * Bacterias de control negativas: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo el control de un promotor diferente, como el promotor de pbad (plásmido J10060 del registro de piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de Materiales)) o un plásmido que no tenga el gen RFP. - Colocar las culturas en una incubadora de agitación a 37 ° c y 220 rpm por un mínimo de 8 h, máximo de 18 h. el caldo nublado indica crecimiento bacteriano.
7. valorando E. coli para comprobar la función del dispositivo
Nota: una vez que los sensores se han ajustado para comprobar la función, no es necesario repetir este paso. Un control positivo en forma de adición de plomo, antimonio, y 2, 4-DNT o 1,3-dinitrobenceno (1,3-DNB) puede comprobar la función de los dispositivos para cada uso sin la necesidad de la valoración completa.
- Prepare una solución de stock del analito (s) de interés a una concentración de 10 ppm en agua. Si la solubilidad es un problema, utilice una mezcla de 50/50 agua/metanol.
- Usando la tabla 4 como guía, etiquete el número apropiado de tubos de cultivo estéril y Coloque 2 ml del caldo cultivado (del paso del Protocolo 6) en cada tubo.
Nota: con el fin de determinar un rango analítico general, hacer al menos tres niveles diferentes de un analito con las bacterias del sensor, un nivel con el control negativo, y un nivel con el control positivo. También debe haber un tubo de cada una de las bacterias que no tiene ningún metal añadido (otro tipo de control negativo). Para determinar con mayor precisión el rango analítico y los límites de detección, utilice una mayor gama de concentraciones de analito. - Añada una solución de analito a los tubos que contengan 2 mL de caldo como se indica en la tabla 4, coloque los tapones de ajuste en el tubo de cultivo para que estén sueltos (para permitir el flujo de aire en el tubo), y vórtice el tubo de cultivo.
- Dejando las tapas de encaje vagamente sobre los tubos de cultivo, colóquelo en una incubadora de agitación a 220 rpm y 37 ° c durante al menos 24 h.
- Retire los tubos de la incubadora, encaje firmemente las tapas en los tubos y almacene los tubos en el refrigerador hasta que estén listos para el análisis de fluorescencia.
8. utilizando E. coli como sensor químico para GSR
- Utilizando una toallita a base de etanol diseñada para eliminar el plomo (ver tabla de materiales), limpie todas las superficies de las manos, incluso entre los dedos. Utilice una toallita separada para cada mano. Almacene las toallitas en una bolsita sellable apropiadamente etiquetada hasta el análisis.
- Para las superficies a probar: utilice una toallita a base de alcohol para superficies grandes o un bastoncillo de algodón humedecido con etanol para superficies pequeñas.
Nota: para demostrar la respuesta de los sensores a GSR, el interior de una carcasa de cartucho de calibre 40 gastada fue subastado con un hisopo de algodón humedecido en etanol. - Usando guantes limpios y utilizando tijeras que se han limpiado con alcohol, cortar una sección de aproximadamente 1 cm2 fuera del centro de la toallita.
- Coloque la pieza cortada de la toallita de mano o el bastoncillo de algodón directamente en un tubo de cultivo que contenga 2 mL de las bacterias del sensor, asegurando que esté sumergida en el caldo.
- Proceda como se describió anteriormente en los pasos 7,4 – 7,5.
9. Análisis de fluorescencia utilizando espectrómetro portátil (ver tabla de materiales)
- Utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos.
- Prepare el espectrómetro para recolectar la emisión de fluorescencia en la longitud de onda apropiada para su variante RFP con una longitud de onda de excitación de 500 nm.
- Utilice el caldo Luria para grabar un espectro en blanco.
- Transfiera cuidadosamente cada sobrenadante a una cubeta de volumen bajo y recoja la intensidad de la emisión.
10. Análisis de fluorescencia utilizando 96-lector de placas de pozo (ver tabla de materiales)
- Utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos.
- Transferir 200 mL del caldo a un pozo en la placa de pozo. Registre qué muestras entraron en cada pozo de la placa.
- Configure el fluorómetro para recoger la intensidad de emisión en la longitud de onda adecuada para la variante RFP.
11. Análisis de datos
- Utilizando la señal obtenida de todos los controles negativos (bacterias negativas de RFP o bacterias de sensor sin analito añadido), calcule una señal de fluorescencia promedio para el fondo.
- Reste la señal de fondo promedio de cada señal de fluorescencia obtenida para que las bacterias del sensor obtengan una intensidad de fluorescencia corregida en el fondo.
- Calcule la relación señal-ruido (S/N) dividiendo la intensidad de fluorescencia corregida en el fondo por la señal de fondo media. Si la relación S/N es mayor que 3, la prueba es positiva.
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Representative Results
Los espectros de fluorescencia para la variante RFP utilizada en este trabajo se muestran en la figura 2. Estos datos provienen del dispositivo PbRFP, ya que responde al plomo y al dispositivo TNT-RFP, ya que responde a dos analitos, 2, 4-DNT y 1, 3-DNB. Esta figura muestra el espectro de un control negativo (sin analito añadido) y los espectros en dos niveles diferentes de analito añadidos. La señal de fluorescencia máxima para la variante de RFP utilizada se observó en 575 nm (longitud de onda de excitación de 500 nm). Los datos de la figura 3 son representativos de un único experimento de valoración (por lo tanto, no se incluyen barras de error) del dispositivo PbRFP, titulados como en el paso 7 del protocolo. La figura 3a muestra los datos recogidos del espectrómetro portátil, mientras que la figura 3B muestra los datos recogidos del fluorómetro (del mismo conjunto de soluciones). Existe una tendencia general de aumentar la fluorescencia a medida que aumenta la concentración de metal. Vale la pena señalar que a altas concentraciones, mayor que aproximadamente 800 ppb, la respuesta disminuye debido a la toxicidad del metal en una concentración tan alta. Este nivel de respuesta máximo puede variar dependiendo del analito utilizado. Nuestro trabajo anterior con el SbRFP demostró que la bacteria podría tolerar niveles más altos (al menos hasta 1.000 ppb) de arsénico y antimonio10. La literatura sobre los niveles de estos analitos recogidos de los hisopos manuales indica que estos niveles de plomo y antimonio son consistentes con lo que podría recogerse de un hisopo de mano15. Además, los resultados presentados en la figura 4 demuestran que las bacterias pueden tolerar las cantidades de analitos presentes en un hisopo de caja de cartucho sin muerte celular, que será significativamente mayor que lo que se recoge de un hisopo de mano.
Utilizando los valores S/N calculados para estos datos, el nivel de plomo detectable más bajo fue de 12 ppb (detectable según lo definido por un S/N mayor que 3). Por el contrario, el S/N para los datos del espectrómetro portátil es sólo 2 en el nivel más alto probado. Sin embargo, la tendencia de aumentar la fluorescencia con la concentración creciente del analito todavía se observa claramente.
La figura 4a muestra una prueba positiva para GSR. Para obtener este resultado, los hisopos de etanol se recolectan desde el interior de una carcasa de cartucho de calibre. 40 y se añaden a las tres bacterias del sensor, como en el paso 8 del protocolo. Esta figura también muestra un control positivo (bacteria que expresa constitutivamente RFP) y un control negativo en forma de dispositivo SbRFP sin analito añadido. Los hisopos de la caja del cartucho se utilizaron como resultados de prueba de principio. En el trabajo futuro, los hisopos de mano se recogeran de las personas que se sabe que han disparado una pistola para mostrar que los sensores son sensibles a las hisopos de la mano, así.
| Componente | 20 μL de reacción |
| Tampón de ligasa de ADN de 10X T4 | 2 μL |
| ADN plásmido (3 KB) | 3 μL |
| ADN promotor (0,7 KB) | 10 μL |
| El agua sin nucleasa | 4 μL |
| Ligasa de ADN T4 | 1 μL |
Tabla 1. Mezcla de reacción para ligadura, paso de protocolo 3.1.1.
| Componente | reacción de 25 μL |
| 10 μM Forward primer | 0,5 μL |
| Imprimación inversa de 10 μM | 0,5 μL |
| UnTaq 2x Master Mix | 12,5 μL |
| El agua sin nucleasa | 11 μL |
Tabla 2. Mezclas de reacción para PCR de Colonia, paso de protocolo 4,1.
| Paso | Temp | hora |
| La desnaturalización inicial | 94 ° c | 30 s |
| 30 ciclos | 94 ° c | 30 s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 68 ° c | 60 s | |
| Extensión final | 68 ° c | 5 min |
| Mantener | 4 ° c |
El cuadro 3. Parámetros de termociclismo PCR para el paso de protocolo 4,3.
| ID de tubo | gérmenes | Concentración de la solución de analito añadida (ppm) | Metal añadió | Volumen de solución de analito añadido a 2.000 μL de caldo | [analito], ppb |
| 1 | PbRFP | 10 | Pb | 2,5 | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP | 0 | Ninguno | 0 | 0 |
| 5 | RFP NEG | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | RFP pos | 10 | Pb | 10 | 50 |
Tabla 4. Experimento general establecido para la titulación de biosensores, paso de protocolo 7,2.
Figura 1. Elementos biológicos de los dispositivos MicRoboCop. (a) diagrama del dispositivo general para MicRoboCop en plásmido con un gen de resistencia a la ampicilina. (b) diagrama de cada dispositivo que se combina para crear el sistema MicRoboCop. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Espectros de fluorescencia de bacterias PbRFP y TNT-RFP en presencia y ausencia de analito. Datos recogidos en el fluorómetro. (a) espectros de fluorescencia de bacterias PbRFP en presencia y ausencia de analito (PB). (b) espectros de fluorescencia de las bacterias TNT-RFP en presencia y ausencia de dos analitos (2, 4-DNT y 1, 3-DNB). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación del sistema de espectrómetro portátil y fluorómetro para la detección de los espectros de fluorescencia de las bacterias PbRFP en presencia y ausencia de analito (plomo). (a) datos de valoración de plomo para las bacterias del sensor PbRFP recogidas en el sistema de espectrómetro portátil. (b) datos de valoración de plomo (mismas muestras) para las bacterias del sensor PbRFP recogidas en el fluorómetro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Hisopos de etanol tomados del interior de un cartucho de calibre. 40 gastado para mostrar la respuesta de los tres dispositivos a GSR. S/N para todas las señales era mayor que 3, indicando una prueba positiva para GSR. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las modificaciones y la solución de problemas
El experimento descrito en el cuadro 4 se puede modificar de cualquier manera adecuado a los sensores que se han diseñado. El aspecto más importante de un sensor químico es evaluar su sensibilidad y especificidad. Es beneficioso asegurarse de que se analice una amplia gama de concentraciones del analito para determinar el rango analítico útil del sensor. También vale la pena determinar un nivel máximo de analito para las células. Debido a que los analitos utilizados en este estudio son metales tóxicos (PB y SB) o compuestos orgánicos en una solución de metanol (para los derivados de TNT), hay un nivel superior en el que se producirá la muerte celular debido a la toxicidad del analito o solución (generalmente superior a 500 – 1, 0 00 ppb para los experimentos realizados hasta el momento).
Las limitaciones de la técnica
Los resultados presentados en este trabajo son de naturaleza cualitativa, pero pretenden demostrar las capacidades cuantitativas de E. colimodificada por RFP. La sensibilidad del sensor puede variar significativamente entre lotes cultivados dependiendo de la densidad de las células en el caldo. Si se requieren resultados cuantitativos, la concentración celular se debe estimar midiendo la densidad óptica de los cultivos líquidos antes del análisis. Si se determina la densidad óptica de los cultivos, las células se pueden diluir apropiadamente para reducir la variabilidad entre los experimentos. Como una prueba presuntiva para los analitos deseados, sin embargo, la respuesta cualitativa "presente/no presente" es aceptable para las aplicaciones discutidas aquí. La vida útil de las células en la placa de agar también debe tenerse en cuenta – trabajo anterior ha indicado que las placas se pueden almacenar en el refrigerador para hasta 2 semanas, pero los dispositivos no funcionan muy bien hacia el final de ese período de tiempo y más allá.
Otra consideración es la elección del equipo utilizado para analizar la señal de fluorescencia. El uso de un espectrofotómetro de grado de investigación con un lector de placas 96-Well permite la selección de longitudes de onda exactas de excitación y emisión, lo que puede aumentar la sensibilidad. Utilizando este sistema, los resultados de hasta 96 experimentos pueden ser recogidos simultáneamente. La fluorescencia de RFP también se puede analizar utilizando un sistema de espectrómetro portátil. Los instrumentos portátiles suelen permitir bandas de excitación seleccionadas, que pueden o no coincidir con la excitación maxima de la variante RFP que se está utilizando. Sin embargo, mientras la longitud de onda de excitación esté dentro de un rango razonable de la excitación maxima, el instrumento portátil generalmente será útil (aunque con una pérdida de sensibilidad). El costo de los sistemas portátiles es significativamente menor que el espectrofotómetro de grado de investigación, y la portabilidad puede ser ciertamente una ventaja. En función de la posible aplicación de las bacterias, el analista puede decidir si el coste adicional y la pérdida de portabilidad con el sistema espectrofotómetro están justificados.
Importancia con respecto a los métodos existentes
El sistema MicRoboCop de tres partes descrito en este trabajo está destinado a ser utilizado como una prueba cualitativa, presuntiva para la presencia de GSR. Actualmente, la prueba probatoria "Gold Standard" para GSR requiere un análisis experto de SEM-EDX. El equipo SEM-EDX es costoso y típicamente operado por analistas altamente especializados. Además, la evidencia GSR es altamente variable en el trabajo de caso forense y muchas variables contribuyen a la deposición de GSR en las manos y las superficies16. Una prueba presuntiva para GSR puede ser útil para los investigadores como proporcionar causa probable para una búsqueda de persona o propiedad. En comparación con pruebas electroquímicas o pruebas como la espectroscopía de movilidad de iones, este método ofrece una instrumentación sencilla y fácilmente disponible a la que la mayoría de los laboratorios analíticos deben tener acceso.
Otras aplicaciones
Los dispositivos descritos en este manuscrito están diseñados para combinarse en un sistema de tres partes para la identificación presuntiva de GSR. Sin embargo, cada dispositivo del sistema MicRoboCop (SbRFP, PbRFP y TNT-RFP) también se puede utilizar individualmente para detectar la contaminación química en alimentos, agua o muestras medioambientales. Los trabajos anteriores han demostrado que el dispositivo TNT-RFP se puede utilizar como un sensor in situ para las minas terrestres13,17. Los resultados presentados aquí y en nuestro trabajo anterior10 han demostrado que los dispositivos Sbrfp y pbrfp pueden detectar concentraciones lo suficientemente bajas como para rivalizar con equipos más caros y sofisticados como la espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente ( ICP-AES) y espectroscopía de absorción atómica (AAS). El sensor SbRFP es sensible al arsénico, así como antimonio. Estos dispositivos pueden proporcionar una opción de bajo costo para el análisis de la contaminación de metales pesados tóxicos.
El protocolo de biología sintética para la preparación de la e. coli que se presenta aquí es aplicable a cualquier sistema que utilice piezas genéticas de biología sintética estándar para sintetizar E. coli que expresan RFP. El método analítico es aplicable a cualquier sistema que exprese RFP, por lo que se puede utilizar para analizar cualquier sistema de biosensores bacterianos que haya sido creado utilizando métodos de biología sintética.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros competidores u otros conflictos de interés para revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer a los estudiantes de la Universidad de Longwood en BIOL 324 (genética) y los estudiantes en CHEM 403 (solución avanzada de problemas de laboratorio químico) que estuvieron involucrados en la preparación inicial y pruebas de los biosensores de antimonio y plomo. La idea para MicRoboCop fue concebida en el taller GCAT SynBIO (verano 2014), financiado por NSF y el Howard Hughes Medical Institute y organizado por la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore. Los autores también reconocen la financiación recibida de la escuela de Artes y Ciencias Cook-Cole de la Universidad de Longwood y la beca GCAT SynBio Alumni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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