Summary
Un protocollo è presentato utilizzando tecniche di biologia sintetica per sintetizzare una serie di biosensori batterici per l'analisi dei residui di arma da fuoco, e per testare il funzionamento dei dispositivi per il loro uso previsto utilizzando la spettroscopia a fluorescenza.
Abstract
MicRoboCop è un biosensore che è stato progettato per un'applicazione unica nella chimica forense. MicRoboCop è un sistema costituito da tre dispositivi che, se utilizzati insieme, possono indicare la presenza di residui di arma da fuoco (GSR) producendo un segnale di fluorescenza in presenza di tre analiti chiave (antimonio, piombo e componenti organici di GSR). Il protocollo descrive la sintesi dei biosensori che utilizzano Escherichia coli (e. coli) e i metodi di chimica analitica utilizzati per valutare la selettività e la sensibilità dei sensori. Il funzionamento del sistema è dimostrato utilizzando GSR raccolti dall'interno di un involucro cartuccia esaurito. Una volta preparati, i biosensori possono essere conservati fino a quando necessario e possono essere utilizzati come test per questi analiti chiave. Una risposta positiva da tutti e tre gli analiti fornisce un test positivo presuntivo per GSR, mentre ogni singolo dispositivo ha applicazioni per rilevare gli analiti in altri campioni (ad esempio, un rivelatore per la contaminazione del piombo nell'acqua potabile). La limitazione principale del sistema è il tempo necessario per un segnale positivo; lavoro futuro può comportare lo studio di diversi organismi per ottimizzare il tempo di risposta.
Introduction
Un biosensore è qualsiasi dispositivo analitico che utilizza componenti biologici (come proteine, acidi nucleici o interi organismi) che producono una risposta che può essere utilizzata per il rilevamento di una sostanza chimica o di un analita. Ad esempio, l'industria mineraria del carbone ha utilizzato un biosensore per gran parte del 20° secolo per rilevare la presenza di gas minerari tossici: il canarino nella miniera di carbone1. La risposta dell'organismo biologico (canarino) (morte o angoscia) ad un analita chimico (monossido di carbonio) è stata osservata dai minatori al fine di proteggere i lavoratori. In un esempio più moderno e sofisticato, i batteri possono essere alterati utilizzando tecniche di biologia sintetica per rispondere alla presenza di un determinato analita chimico esibendo una risposta specifica, come l'espressione di una proteina fluorescente.
La biologia sintetica è un termine generico che si riferisce alla costruzione di dispositivi biologici e sistemi che non esistono naturalmente, o la riprogettazione di sistemi biologici esistenti per uno scopo specifico2. La biologia sintetica si distingue dall'ingegneria genetica da una metodologia standard e dall'esistenza di parti standardizzate (elementi genetici di biologia sintetica standard) che possono essere utilizzati per sintetizzare dispositivi e sistemi. Una parte viene introdotta nel genoma di un dispositivo, un organismo come un batterio, per esprimere un certo tratto che servirà come indicazione di funzione. Ad esempio, in molti dispositivi sintetici, l'espressione di una proteina fluorescente viene introdotta in un singolo organismo cellato come proteina reporter. È possibile combinare più dispositivi in un sistema. I Geniti di microrganismi come i batteri sono facili da manipolare in questo modo. Numerosi esempi di biosensori specifici per una vasta gamma di analiti chimici sono stati riportati in letteratura negli ultimi dieci anni,3,4.
In questo lavoro, il sistema MicRoboCop è presentato come un esempio di un biosensore progettato utilizzando tecniche di biologia sintetica con nuove applicazioni in chimica forense e ambientale. MicRoboCop è un sistema di tre dispositivi separati che, quando combinati, permetteranno a Escherichia coli di esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP) in presenza di residui di arma da fuoco (GSR) che sono stati raccolti dalle mani di una persona o da una superficie. Ciascuno dei tre dispositivi risponde a uno specifico analita chimico che è noto per essere un componente di GSR5. I tre analiti a cui il sistema risponde sono I. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) e i relativi composti, II. piombo (sotto forma di ioni di piombo), e III. antimonio (anche sotto forma di ioni).
GSR è costituito da molte sostanze chimiche diverse, ma i tre di solito utilizzati per identificare un residuo come GSR sono bario, piombo, e antimonio5. Il test probatorio standard per l'identificazione di GSR consiste nell'utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) con fluorescenza a raggi X a dispersione di energia (EDX)5. SEM-EDX consente agli analisti di identificare la morfologia unica e i componenti elementali di GSR. Attualmente, ci sono pochi ampiamente utilizzati test presuntivi binari disponibili. Un test presuntivo recentemente pubblicato utilizza la spettroscopia di mobilità ionica (IMS), che è un'apparecchiatura specializzata che potrebbe non essere disponibile in molti laboratori6. Ci sono anche alcuni test di colore "spot" che possono essere utilizzati, anche se sono tipicamente utilizzati per la determinazione della distanza o per l'identificazione GSR su fori di proiettile e ferite5. Inoltre, c'è stata una certa attenzione limitata nella letteratura per i test elettrochimici per GSR che impiegano l'analisi voltammetrica, che ha il vantaggio di essere potenzialmente in campo portatile, o anodico stripping voltammetria, che è un estremamente Metodo sensibile per gli elementi metallici7. Nella letteratura dei biosensori progettati specificamente allo scopo di rilevare la GSR è molto poca menzione, anche se alcuni biosensori per altre applicazioni forensi sono stati pubblicati8.
Gli elementi biologici per ogni dispositivo nel sistema MicRoboCop, e la costruzione del plasmide, sono illustrati in Figura 1. La freccia curva in Figura 1B rappresenta la regione promotrice che viene attivata in presenza dell'analita, l'ovale è il sito di legame ribosomiale che permette la traduzione della proteina reporter, la scatola grigia etichettata RFP è il gene che esprime il rosso proteina fluorescente, e l'ottagione rosso è il sito di terminazione della trascrizione. Tutti e tre i dispositivi saranno utilizzati insieme come un sistema per rilevare GSR. Ogni dispositivo con un promotore specifico (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) sarà incubato con il campione che viene testato e la fluorescenza di RFP sarà misurata. La RFP sarà espressa solo se l'analita chimico appropriato è presente e attiva la regione promotrice. Tre dispositivi che rispondono ad alcune delle sostanze chimiche presenti in GSR sono stati progettati e sono presentati in questo lavoro.
I promotori utilizzati nei tre dispositivi microbocop sono un promotore sensibile all'arsenico e all'antimonio , sbrfp9,10, un promotore sensibile al piombo, pbrfp11,12 e un promotore sensibile al TNT, TNT-RFP 13. poiché una ricerca in letteratura non ha rivelato alcun promotore progettato per rispondere al bario, il promotore di TNT è stato selezionato invece poiché questo promotore è sensibile a una serie di composti strutturalmente correlati (in particolare, 2, 4-dinitrotoluene e dinitrobenzene) che sono noti per essere una parte dei composti organici lasciati alle spalle in GSR. Questo promotore è stato utilizzato con successo per rilevare in modo specifico quantità minute di TNT e di 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) nelle miniere di terra sepolte13. Utilizzando i tre dispositivi insieme come un sistema, un test positivo per GSR produrrà fluorescenza in tutti e tre i dispositivi. Un segnale di fluorescenza in uno o due dispositivi indicherà un'altra fonte ambientale dell'analita (s) o nel caso del promotore di TNT, l'attivazione da parte di un composto che non è un composto organico lasciato alle spalle in GSR. Utilizzando tutti e tre i dispositivi insieme, la possibilità di un risultato falso positivo a causa di fonti ambientali è minimizzata. Le munizioni prive di piombo, che stanno guadagnando popolarità, rappresentano ancora solo il 5% delle vendite di munizioni negli Stati Uniti; quindi, risultati falsi negativi a causa dell'assenza di piombo può essere una possibilità, ma c'è ancora utilità in un sensore che utilizza il piombo come un marcatore per GSR14. Oltre a questa specifica applicazione forense, ogni dispositivo può essere utilizzato separatamente per individuare i contaminanti ambientali.
I protocolli presentati includono le tecniche di biologia sintetica utilizzate per creare i dispositivi (batteri del sensore) e le tecniche analitiche per controllare la funzione dei dispositivi e analizzare i segnali di fluorescenza ottenuti. Il protocollo include anche la raccolta di prove forensi sotto forma di pulizia a mano per raccogliere GSR dalle mani di un sospetto o di un tampone per raccogliere GSR da una superficie. I risultati del dispositivo con sensore di piombo sono presentati come risultati di esempio, insieme a una dimostrazione di un test positivo per GSR utilizzando un involucro cartuccia esaurito.
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Protocol
Nota: viene presentata la sintesi di E. coli che esprime RFP.
1. preparazione del DNA plasmide da E. coli
- Scongelare e . coli contenente un plasmide con un gene RFP e un gene di resistenza all'ampicillina e far crescere le piastre di agar e . coli on Luria brodo (lb) contenenti 100 μg/ml di ampicillina a 37 ° c per 24 ore. Ad esempio, utilizzare il plasmide J10060 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedere tabella dei materiali). Il plasmide J10060 include un gene per la RFP (proteina rossa fluorescente) sotto il controllo di una regione promotrice di pBad e un gene di resistenza all'ampicillina. In alternativa, trasformare E. coli (fare riferimento al passo 3,2) con il plasmide prima della crescita sulle piastre di agar lb.
- Seguire un protocollo di plasmidico standard (vedere la tabella dei materiali) per isolare il DNA da 1 ml di una coltura di E. coli che contiene il plasmide J10060. Lo scopo del seguente protocollo è quello di rimuovere il promotore di pBad e sostituirlo con il promotore desiderato per il dispositivo.
- Dopo la Miniprep del plasmide, conservare il DNA nel congelatore fino a quando è pronto per la digestione.
2. digestione dell'enzima di restrizione
- Impostare la seguente reazione in un tubo per microcentrifuga per la digestione EcoRI e NheI: 10 μL di DNA plasmide J10060 (isolato nel passaggio 1), 8 μL di acqua e 1 μL ciascuno degli enzimi EcoRI e NheI pre-miscelati con 1 μL di tampone (vedere tabella dei materiali).
- Per il DNA del promotore, impostare la seguente reazione in un tubo per microcentrifuga per la digestione EcoRI e NheI: 10 μL di sequenze di DNA del promotore ricotto (8 μL di acqua e 1 μL di ciascuno degli enzimi EcoRI e NheI pre-miscelati con 1 μL di tampone.
- Per SB-, PB-, o TNT-RFP (vedere tabella dei materiali), sciogliere gli oligonucleotidi in tampone (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm acetato di potassio), Incubare in concentrazioni molari uguali, riscaldare a 94 ° c per 2 min, e gradualmente raffreddare a temperatura ambiente).
- Miscelare i campioni pipettando delicatamente su e giù con la pipetta impostata su 10 μL.
- Incubare per 30 min a 37 ° c.
- Il calore inattiva gli enzimi a 80 ° c per 5 min.
- Conservare il DNA digerito nel congelatore fino a quando non è pronto per il passo successivo.
3. legazione e trasformazione
-
Legatura
- Utilizzando il DNA plasmide e promotore che è stato doppio digerito con EcoRI e NheI nel passaggio 2, impostare la miscela di reazione mostrata nella tabella 1 in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio; aggiungere l'ultimo DNA ligase T4.
Nota: la tabella 1 Mostra una legazione utilizzando un rapporto molare di 1:3 vettore da inserire per le dimensioni del DNA indicate. - Mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù e microcentrifuga brevemente.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Inattivazione del calore a 65 ° c per 10 min.
- Utilizzando il DNA plasmide e promotore che è stato doppio digerito con EcoRI e NheI nel passaggio 2, impostare la miscela di reazione mostrata nella tabella 1 in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio; aggiungere l'ultimo DNA ligase T4.
-
trasformazione f
- Scongelare un tubo con 20 μL di DH5-Alpha cellule E. coli competenti sul ghiaccio fino a quando gli ultimi cristalli di ghiaccio scompaiono.
- Aggiungere 5 μL di DNA plasmide alla miscela cellulare. Scorrere con cautela il tubo 4-5 volte per mescolare le cellule e il DNA.
- Posizionare il composto su ghiaccio per 2 min.
- Shock termico a esattamente 42 ° c per esattamente 30 s. Non mescolare.
- Posto sul ghiaccio per 2 min. Non mescolare.
- Pipettare 380 μL di temperatura ambiente SOC nella miscela. Si diffonde immediatamente su una piastra di agar LB contenente ampicillina (100 μg/mL) e incubare durante la notte a 37 ° c.
- Controllare le piastre entro 24 h per la crescita.
- Sigillare le piastre con pellicola sigillante e conservare in frigorifero fino a quando non è pronto per il passo successivo.
4. PCR della Colonia
- Aggiungere a un tubo PCR (impostare 4 tubi di reazione) le miscele di reazione mostrate nella tabella 2.
- Mescolare delicatamente le reazioni pipettando su e giù.
- Utilizzando una punta di pipetta gialla, rasare una Colonia (o regione molto piccola) dell' E. colitrasformato. Trasferire un colpo di questo E. coli su una nuova piastra lb/ampicillina/agar che è stata sezionata, quindi inserire la punta della pipetta nel tubo PCR. Agitare la punta della pipetta per miscelare l' E. coli con la miscela PCR. Ripeti altre tre volte per ulteriori colonie. Trasferire i tubi PCR in una macchina PCR e iniziare il cicli termici alternati utilizzando il programma mostrato nella tabella 3.
- Eseguire elettroforesi gel utilizzando un gel di agarosio del 2% in TAE per determinare quali colonie hanno la migliore legazione nel plasmide e crescono quelle colonie su una nuova piastra.
- Conservare le piastre in frigorifero fino a quando non sono pronte per il collaudo. Preparare una coltura liquida in brodo di Luria con 100 μg/mL di ampicillina aggiunto per i test chimici.
5. sequenziamento del DNA
- Per ogni campione, aggiungere 5 μL di plasmide, 4 μL del primer di sequenziamento e 3 μL di acqua deionizzata.
- Mettere questa miscela in un tubo e inviarlo per il sequenziamento del DNA (vedere tabella dei materiali).
- Analizzare i dati della sequenza del DNA per confrontare le sequenze di DNA attese e osservate utilizzando il software di analisi della sequenza del DNA per garantire che non vi sia alcuna mutazione e che i geni siano stati inseriti correttamente.
Nota: utilizzando E. coli come un sensore chimico è presentato di seguito.
6. preparazione delle colture di E. coli
- Preparare LB con 100 μg/mL di ampicillina per colture liquide.
- Preparare colture liquide dei batteri del sensore, i batteri di controllo positivo * e il controllo negativo * * batteri.
Nota: * batteri di controllo positivo: E. coli contenenti un plasmide con il gene RFP sotto il controllo di un promotore costitutivo; plasmide E1010 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedere tabella dei materiali) è stato utilizzato in questo lavoro.
* * Batteri di controllo negativi: E. coli contenenti un plasmide con il gene RFP sotto il controllo di un promotore diverso, come il promotore di pbad (plasmide J10060 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (cfr. tabella delle Materiali)) o un plasmide che non ha il gene RFP. - Collocare le colture in un incubatore a scuotimento a 37 ° c e 220 rpm per un minimo di 8 h, massimo 18 h. il brodo nuvoloso indica la crescita batterica.
7. titolazione E. coli per controllare la funzione del dispositivo
Nota: una volta che i sensori sono stati titolati per controllare la funzione, questo passaggio non deve essere ripetuto. Un controllo positivo sotto forma di aggiunta di piombo, antimonio, e 2, 4-DNT o 1, 3-dinitrobenzene (1, 3-DNB) può controllare la funzione dei dispositivi per ogni uso senza la necessità di una titolazione completa.
- Preparare una soluzione di riserva degli analiti di interesse ad una concentrazione di 10 ppm in acqua. Se la solubilità è un problema, utilizzare una miscela di acqua/metanolo 50/50.
- Utilizzando la tabella 4 come guida, etichettare il numero appropriato di tubi di coltura sterili e posizionare 2 ml del brodo coltivato (dal passaggio del protocollo 6) in ogni tubo.
Nota: al fine di determinare un intervallo analitico generale, fare almeno tre diversi livelli di un analita con i batteri del sensore, un livello con il controllo negativo e un livello con il controllo positivo. Ci dovrebbe essere anche un tubo di ciascuno dei batteri che non ha aggiunto metallo (un altro tipo di controllo negativo). Per determinare con maggiore precisione l'intervallo analitico e i limiti di rilevazione, utilizzare una gamma più ampia di concentrazioni di analiti. - Aggiungere soluzione di stock di analita ai tubi contenenti 2 mL di brodo come indicato nella tabella 4, posizionare i tappi a scatto sul tubo di coltura in modo che siano allentati (per consentire il flusso d'aria nel tubo), e vortice il tubo di coltura.
- Lasciando i tappi a scatto liberamente sui tubi di coltura, mettere in un incubatore agitazione a 220 giri/min e 37 ° c per almeno 24 h.
- Rimuovere i tubi dall'incubatore, agganciare saldamente i tappi sui tubi e conservare i tubi nel frigorifero fino a quando non sono pronti per l'analisi della fluorescenza.
8. utilizzo di E. coli come sensore chimico per GSR
- Utilizzando una salvietta a base di etanolo progettata per rimuovere il piombo (vedere tabella dei materiali), pulire tutte le superfici delle mani, anche tra le dita. Usa una salvietta separata per ogni mano. Conservare le salviette in una busta sigillabile opportunamente etichettata fino all'analisi.
- Per le superfici da testare: utilizzare una salvietta a base di alcool per superfici di grandi dimensioni o un batuffolo di cotone inumidito con etanolo per piccole superfici.
Nota: per dimostrare la risposta dei sensori alla GSR, l'interno di un involucro di cartuccia calibro 40 è stato scambiato con un tampone di cotone inumidito con etanolo. - Indossando guanti puliti e usando le forbici che sono state pulite con alcool, tagliare una sezione di circa 1 cm2 fuori dal centro della salvietta.
- Posizionare il pezzo tagliato della salvietta o il batuffolo di cotone direttamente in un tubo di coltura che contiene 2 mL dei batteri del sensore, assicurandosi che sia immerso nel brodo.
- Procedere come descritto in precedenza nei passaggi 7,4 – 7,5.
9. analisi della fluorescenza mediante Spettrometro portatile (vedere tabella dei materiali)
- Utilizzare un miscelatore Vortex per scuotere i tubi.
- Preparare lo spettrometro per raccogliere l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata per la variante RFP con una lunghezza di eccitazione di 500 Nm.
- Utilizzare il brodo Luria per registrare uno spettro vuoto.
- Trasferire con cautela ogni supernatante a una cuvetta a basso volume e raccogliere l'intensità di emissione.
10. analisi della fluorescenza con lettore di piastre 96-well (vedere tabella dei materiali)
- Utilizzare un miscelatore Vortex per scuotere i tubi.
- Trasferire 200 mL di brodo ad un pozzo nella piastra ben. Registrare quali campioni sono andati in ogni pozzo della piastra.
- Impostare il fluorimetro per raccogliere l'intensità di emissione alla lunghezza d'onda appropriata per la variante RFP.
11. analisi dei dati
- Utilizzando il segnale ottenuto da tutti i controlli negativi (batteri RFP negativi o batteri sensore senza analita aggiunto), calcolare un segnale di fluorescenza media per lo sfondo.
- Sottrarre il segnale di fondo medio da ogni segnale di fluorescenza ottenuto per i batteri del sensore per ottenere un'intensità di fluorescenza corretta in background.
- Stimare il rapporto segnale/rumore (S/N) dividendo l'intensità di fluorescenza corretta in background per il segnale di fondo medio. Se il rapporto S/N è maggiore di 3, il test è positivo.
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Representative Results
Gli spettri di fluorescenza per la variante RFP utilizzata in questo lavoro sono illustrati nella Figura 2. Questi dati sono dal dispositivo PbRFP in quanto rispondono al piombo e al dispositivo TNT-RFP in quanto rispondono a due analiti, 2, 4-DNT e 1, 3-DNB. Questa figura mostra lo spettro di un controllo negativo (nessun analita aggiunto), e gli spettri a due diversi livelli di analita aggiunto. Il segnale di fluorescenza massimo per la variante RFP utilizzata è stato osservato a 575 Nm (lunghezza d'onda di eccitazione 500 Nm). I dati in Figura 3 sono rappresentativi di un singolo esperimento di titolazione (quindi non sono incluse barre di errore) del dispositivo pbrfp, titolato come nel passaggio 7 del protocollo. La Figura 3A Mostra i dati raccolti dallo spettrometro portatile, mentre la Figura 3B Mostra i dati raccolti dal fluorimetro (dalla stessa serie di soluzioni). C'è una tendenza generale di aumentare la fluorescenza come la concentrazione di metallo aumenta. Vale la pena notare che ad alte concentrazioni, maggiore di circa 800 PPB, la risposta scende a causa della tossicità del metallo a una concentrazione così elevata. Questo livello di risposta massima può variare a seconda dell'analita utilizzato. Il nostro precedente lavoro con il SbRFP ha mostrato che i batteri potevano tollerare livelli più elevati (almeno fino a 1.000 PPB) di arsenico e antimonio10. La letteratura sui livelli di questi analiti raccolti da tamponi a mano indica che questi livelli di piombo e antimonio sono coerenti con quello che potrebbe essere raccolto da un tampone a mano15. Inoltre, i risultati presentati nella Figura 4 dimostrano che i batteri possono tollerare la quantità di analiti presenti in un tampone di bossolo senza morte cellulare, che sarà significativamente più alto di quello che viene raccolto da un tampone a mano.
Utilizzando i valori S/N calcolati per questi dati, il livello di piombo rilevabile più basso era 12 ppb (rilevabile come definito da un S/N maggiore di 3). Al contrario, la S/N per i dati dello spettrometro portatile è solo 2 al livello più alto testato. Tuttavia, la tendenza ad aumentare la fluorescenza con la crescente concentrazione di analiti è ancora chiaramente nota.
La Figura 4a Mostra un test positivo per GSR. Per ottenere questo risultato, i tamponi di etanolo sono stati raccolti dall'interno di un involucro di cartuccia di calibro 40 speso e aggiunto ai tre batteri del sensore, come nella fase 8 del protocollo. Questa cifra Mostra anche un controllo positivo (batteri che esprimono costituzionalmente RFP) e un controllo negativo sotto forma di dispositivo SbRFP senza analita aggiunto. I tamponi delle cartucce sono stati utilizzati come risultati di prova di principio. Nel lavoro futuro, i tamponi a mano saranno raccolti da persone che sono noti per aver sparato una pistola per dimostrare che i sensori sono sensibili ai tamponi a mano pure.
| componente | 20 μL di reazione |
| Tampone di DNA ligase 10X T4 | 2 μL di |
| DNA plasmide (3 KB) | 3 μL di |
| DNA del promotore (0.7 KB) | 10 μL di |
| Acqua priva di nucleasi | 4 μL di |
| T4 DNA ligase | 1 μL di |
Tabella 1. Miscela di reazione per la legazione, fase di protocollo 3.1.1.
| componente | 25 μL di reazione |
| Primer forward da 10 μM | 0,5 μL di microlitro |
| Primer inverso da 10 μM | 0,5 μL di microlitro |
| Un mix di masterTaq 2x | 12,5 μL di microlitro |
| Acqua priva di nucleasi | 11 μL di |
Tabella 2. Miscele di reazione per PCR di Colonia, protocollo Step 4,1.
| passo | impiegato | ora |
| Denaturazione iniziale | 94 ° c | 30 s di |
| 30 cicli di | 94 ° c | 30 s di |
| 55 ° c | 45 s | |
| 68 ° c | 60 s | |
| Estensione finale | 68 ° c | a 5 minuti |
| tenere | a 4 ° c |
Tabella 3. Parametri termociclici PCR per protocollo Step 4,3.
| ID tubo | batteri | Concentrazione di soluzione di analita aggiunto (ppm) | Metallo aggiunto | Volume di soluzione di analita aggiunto a 2.000 μL di brodo | [analita], PPB |
| 1 | Di PbRFP | 10 | Pb | 2,5 a | 12 |
| 2 | Di PbRFP | 10 | Pb | 75 a | 361 a |
| 3 | Di PbRFP | 10 | Pb | 150 a | 698 a |
| 4 | Di PbRFP | 0 | nessuno | 0 | 0 |
| 5 | RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 a |
| 6 | POS RFP | 10 | Pb | 10 | 50 a |
Tabella 4. Esperimento generale istituito per la titolazione dei biosensori, protocollo STEP 7,2.
Figura 1. Elementi biologici dei dispositivi MicRoboCop. a) diagramma del dispositivo generale per MicRoboCop in un plasmide con un gene di resistenza all'ampicillina. (b) diagramma di ciascun dispositivo che viene combinato per creare il sistema MicRoboCop. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2. Spettro di fluorescenza dei batteri PbRFP e TNT-RFP in presenza e assenza di analita. Dati raccolti sul fluorimetro. a) spettri di fluorescenza dei batteri PbRFP in presenza e assenza di analita (PB). b) spettri di fluorescenza dei batteri TNT-RFP in presenza e assenza di due analiti (2, 4-DNT e 1, 3-DNB). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3. Confronto tra il sistema di Spettrometro portatile e il fluorimetro per la rilevazione degli spettri di fluorescenza dei batteri PbRFP in presenza e assenza di analita (piombo). (a) dati di titolazione del piombo per i batteri del sensore PbRFP raccolti su un sistema di Spettrometro portatile. b) dati di titolazione del piombo (stessi campioni) per i batteri del sensore PbRFP raccolti sul fluorimetro. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4. Tamponi di etanolo prelevati dall'interno di un calibro. 40 hanno impiegato una cartuccia a pistola per mostrare la risposta dei tre dispositivi alla GSR. S/N per tutti i segnali è stato maggiore di 3, indicando un test positivo per GSR. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Modifiche e risoluzione dei problemi
L'esperimento descritto nella tabella 4 può essere modificato in qualsiasi modo appropriato ai sensori che sono stati progettati. L'aspetto più importante di un sensore chimico è quello di valutarne la sensibilità e la specificità. È utile garantire che un'ampia gamma di concentrazioni dell'analita venga analizzata per determinare l'utile intervallo analitico del sensore. Vale anche la pena di determinare un livello massimo di analita per le cellule. Poiché gli analiti utilizzati in questo studio sono metalli tossici (PB e SB) o composti organici in una soluzione di metanolo (per i derivati TNT), c'è un livello superiore a cui si verificherà la morte cellulare a causa della tossicità dell'analita o della soluzione (generalmente superiore a 500 – 1,0 00 PPB per gli esperimenti condotti finora).
Limitazioni della tecnica
I risultati presentati in questo lavoro sono di natura qualitativa, ma hanno lo scopo di dimostrare le capacità quantitative del RFP modificato E. coli. La sensibilità del sensore può variare significativamente tra i lotti coltivati a seconda della densità delle cellule nel brodo. Se sono necessari risultati quantitativi, la concentrazione delle cellule deve essere stimata misurando la densità ottica delle colture liquide prima dell'analisi. Se la densità ottica delle colture è determinata, le cellule possono essere diluite in modo appropriato per ridurre la variabilità tra gli esperimenti. Come prova presuntiva per gli analiti desiderati, tuttavia, la risposta qualitativa "presente/non presente" è accettabile per le applicazioni discusse qui. Anche la durata delle cellule sulla piastra di agar dovrebbe essere notato-lavoro precedente ha indicato che le piastre possono essere conservati in frigorifero per fino a 2 settimane, ma i dispositivi non funzionano molto bene verso la fine di quel lasso di tempo e oltre.
Un'altra considerazione è la scelta delle apparecchiature utilizzate per analizzare il segnale di fluorescenza. Utilizzando uno spettrofotometro di grado di ricerca con un lettore di piastre 96-well permette la selezione di precise lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione, che può aumentare la sensibilità. Utilizzando questo sistema, i risultati di fino a 96 esperimenti possono essere raccolti simultaneamente. La fluorescenza RFP può anche essere analizzata utilizzando un sistema di Spettrometro portatile. Gli strumenti portatili in genere consentono bande di eccitazione selezionate, che possono o non possono coincidere con l'eccitazione Maxima della variante RFP utilizzata. Tuttavia, fintanto che la lunghezza d'onda di eccitazione è all'interno di un intervallo ragionevole di eccitazione Maxima, lo strumento portatile sarà generalmente riparabile (anche se con una perdita di sensibilità). Il costo dei sistemi portatili è significativamente inferiore allo spettrofotometro di grado di ricerca, e la portabilità può certamente essere un vantaggio. In base alla potenziale applicazione dei batteri, l'analista può decidere se il costo aggiuntivo e la perdita di portabilità con il sistema dello spettrofotometro siano giustificati.
Significato rispetto ai metodi esistenti
Il sistema MicRoboCop in tre parti descritto in questo lavoro è destinato ad essere utilizzato come test qualitativo e presuntivo per la presenza di GSR. Attualmente, il test probatorio "Gold standard" per GSR richiede l'analisi di esperti da parte di SEM-EDX. Le apparecchiature SEM-EDX sono costose e tipicamente gestite da analisti altamente specializzati. Inoltre, la prova GSR è altamente variabile nel casato forense e molte variabili contribuiscono alla deposizione di GSR su mani e superfici16. Un test presuntivo per GSR può essere utile agli investigatori come fornire probabile causa per una ricerca di persona o di proprietà. Rispetto ai test elettrochimici o ai test come la spettroscopia per la mobilità ionica, questo metodo offre una strumentazione semplice e prontamente disponibile alla quale la maggior parte dei laboratori analitici dovrebbe avere accesso.
Altre applicazioni
I dispositivi descritti in questo manoscritto sono progettati per essere combinati in un sistema a tre parti per l'identificazione presuntiva di GSR. Tuttavia, ogni dispositivo del sistema MicRoboCop (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) può essere utilizzato anche singolarmente per rilevare la contaminazione chimica in alimenti, acqua o campioni ambientali. Il lavoro precedente ha dimostrato che il dispositivo TNT-RFP può essere utilizzato come sensore in situ per le miniere di terra13,17. I risultati presentati qui e nel nostro precedente lavoro10 hanno dimostrato che i dispositivi Sbrfp e pbrfp possono rilevare concentrazioni abbastanza basse da rivaleggiare con apparecchiature più costose e sofisticate, come la spettroscopia a emissione atomica plasmatica induttivamente accoppiata ( (ICP-AES) e spettroscopia di assorbimento atomico (AAS). Il sensore SbRFP è sensibile all'arsenico e all'antimonio. Questi dispositivi possono fornire un'opzione a basso costo per l'analisi della contaminazione da metalli pesanti tossici.
Il protocollo di biologia sintetica per la preparazione del E. coli presentato qui è applicabile a qualsiasi sistema che utilizza le parti genetiche di biologia sintetica standard per sintetizzare E. coli che esprimono RFP. Il metodo analitico è applicabile a qualsiasi sistema che esprime RFP, e quindi può essere utilizzato per analizzare qualsiasi sistema di biosensori batterico che è stato creato utilizzando metodi di biologia sintetica.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere gli studenti della Longwood University in BIOL 324 (genetica) e gli studenti di CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory problem solving) che sono stati coinvolti nella preparazione iniziale e nel collaudo dei biosensori antimonio e piombo. L'idea di MicRoboCop è stata concepita presso il workshop GCAT SynBIO (Summer 2014), finanziato dalla NSF e dall'Howard Hughes Medical Institute e ospitato dall'Università del Maryland Contea di Baltimora. Gli autori riconoscono anche i finanziamenti ricevuti dal Cook-Cole College delle arti e delle scienze di Longwood University e dal GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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