Summary
Ein Protokoll wird mit synthetischen Biologie-Techniken vorgestellt, um eine Reihe von bakteriellen Biosensoren zur Analyse von Schussrückständen zu synthetischen Biologiesensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetischen Sensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisieren und die Funktionsweise der Geräte mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie auf ihren beabsichtigten Einsatz zu testen.
Abstract
MicRoboCop ist ein Biosensor, der für eine einzigartige Anwendung in der forensischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System, das aus drei Geräten besteht, die, wenn sie zusammen verwendet werden, das Vorhandensein von Schussrückständen (GSR) anzeigen können, indem sie ein Fluoreszenzsignal in Anwesenheit von drei Schlüsselanalyten (Antimon, Blei und organische Komponenten der GSR) erzeugen. Das Protokoll beschreibt die Synthese der Biosensoren mit Escherichia coli (E. coli) und die analytischen Methoden der Chemie, mit denen die Selektivität und Empfindlichkeit der Sensoren bewertet wird. Die Funktionsweise des Systems wird durch die Verwendung von GSR aus dem Inneren eines verbrauchten Patronenhülers gesammelt. Nach der Vorbereitung können die Biosensoren bis zum Bedarf gespeichert und als Test für diese Schlüsselanalysen verwendet werden. Eine positive Resonanz aller drei Analyten liefert einen voraussichtlichen positiven Test für GSR, während jedes einzelne Gerät Anwendungen zur Erkennung der Analyten in anderen Proben (z.B. ein Detektor für Bleikontamination im Trinkwasser) hat. Die Haupteinschränkung des Systems ist die Zeit, die für ein positives Signal erforderlich ist; In Zukunft kann es sein, verschiedene Organismen zu untersuchen, um die Reaktionszeit zu optimieren.
Introduction
Ein Biosensor ist jedes Analysegerät, das biologische Komponenten (wie Proteine, Nukleinsäuren oder ganze Organismen) verwendet, die eine Reaktion erzeugen, die zur Erkennung einer chemischen Substanz oder eines Analyten verwendet werden kann. Zum Beispiel nutzte der Kohlebergbau einen Biosensor für einen Großteil des 20. Jahrhunderts, um das Vorhandensein giftiger Minengase zu erkennen: Den Kanarienvogel in der Kohlemine1. Die Reaktion des biologischen Organismus (Tod oder Bedrängnis) auf einen chemischen Analyten (Kohlenmonoxid) wurde von den Bergarbeitern beobachtet, um die Arbeiter zu schützen. In einem moderneren und ausgeklügelteren Beispiel können Bakterien mit synthetischen Biologie-Techniken verändert werden, um auf das Vorhandensein eines bestimmten chemischen Analyten zu reagieren, indem eine spezifische Reaktion, wie die Expression eines fluoreszierenden Proteins, angezeigt wird.
Die synthetische Biologie ist ein breiter Begriff, der sich auf den Bau biologischer Geräte und Systeme bezieht, die nicht auf natürliche Weise existieren, oder auf die Neugestaltung bestehender biologischer Systeme für einen bestimmten Zweck2. Die synthetische Biologie unterscheidet sich von der Gentechnik durch eine Standardmethodik und das Vorhandensein standardisierter Teile (Standard-synthetische Biologie-genetische Elemente), die zur Synthese von Geräten und Systemenverwendet werden können. Ein Teil wird in das Genom eines Gerätes,eines Organismus wie eines Bakteriums, eingeführt, um ein bestimmtes Merkmal auszudrücken, das als Funktionsindikation dienen wird. So wird bei vielen synthetischen Geräten der Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins als Reporter-Protein in einen einzigen zellenden Organismus eingeführt. Mehrere Geräte können zu einem Systemkombiniert werden. Die Genome von Mikroorganismen wie Bakterien lassen sich auf diese Weise leicht manipulieren. In den letzten zehn Jahren wurden in der Literatur zahlreiche Beispiele von Biosensoren berichtet,dieauf eine VielzahlchemischerAnalyten zugeschnitten sind.
In dieser Arbeit wird das MicRoboCop-System als Beispiel für einen Biosensor präsentiert, der mit synthetischen Biologie-Techniken mit neuartigen Anwendungen in der forensischen und ökologischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System von drei separaten Geräten, die, wenn sie kombiniert werden, es Escherichia coli ermöglichen, rotes fluoreszierendes Protein (RFP) in Anwesenheit von Schussrückständen (GSR) auszudrücken, die aus den Händen einer Person oder einer Oberfläche gesammelt wurden. Jedes der drei Geräte reagiert auf einen spezifischen chemischen Analyten, der als Bestandteil von GSR5bekannt ist. Die drei Analyten, auf die das System reagiert, sind I. 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) und verwandte Verbindungen, II. Blei (in Form von Blei-Ionen), und III. Antimon (auch in Form von Ionen).
GSR besteht aus vielen verschiedenen chemischen Substanzen, aber die drei, die normalerweise verwendet werden, um einen Rückstand zu identifizieren, wie GSR sind Barium, Blei und Antimon5. Der Standard-Nachweistest zur Identifizierung von GSR ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit energiedispergierender Röntgenfluoreszenz (EDX)5. SEM-EDX ermöglicht es Analysten, die einzigartigen Morphologie und die Elementarkomponenten der GSR zu identifizieren. Derzeit gibt es nur wenige weit verbreitete binäre Anmaßungstests zur Verfügung. In einem kürzlich veröffentlichten Präsenztest wird die Ionenbewegungsspektroskopie (IMS) verwendet, die spezialisierte Geräte ist, die in vielen Labors6nicht verfügbar sein könnten. Es gibt auch ein paar farbige "Spot"-Tests, die verwendet werden können, obwohl sie in der Regel für die Distanzbestimmung oder für die GSR-Identifikation auf Einschusslöchern und Wunden 5 verwendet werden. Darüber hinaus gab es in der Literatur eine begrenzte Aufmerksamkeit für elektrochemische Tests für GSR, die voltammetrische Analyse, die den Vorteil hat, dass potenziell Feld tragbar ist, oder anodic Stripping Voltammetry, die eine extrem Empfindliche Methode für metallische Elemente7. In der Literatur von Biosensoren, die speziell für die Erkennung von GSR entwickelt wurden, wird nur sehr wenig erwähnt, obwohl einige Biosensoren für andere forensische Anwendungen veröffentlicht wurden8.
Die biologischen Elemente für jedes Gerät im MicRoboCop-System und die Plasmid-Konstruktion sind in Abbildung1 dargestellt. Der geschwungene Pfeil in Abbildung 1b stellt die Promoter-Region dar, die in Anwesenheit des Analyten aktiviert wird, das Oval ist die ribosomale Bindungsstelle, die die Übersetzung des Reporter-Proteins ermöglicht, die graue Box mit der Bezeichnung RFP ist das Gen, das Rot drückt Fluoreszierendes Protein, und das rote Achteck ist die Transkriptionsabbruchstelle. Alle drei Geräte werden zusammen als System zur Erkennung von GSR eingesetzt. Jedes Gerät mit einem bestimmten Promoter (SbRFP, PbRFP und TNT-RFP) wird mit der Probe, die getestet wird, inkubiert und die Fluoreszenz von RFP wird gemessen. RFP wird nur dann zum Ausdruck gebracht, wenn der entsprechende chemische Analyt vorhanden ist und die Promoterregion aktiviert wird. Drei Geräte, die auf einige der in GSR vorhandenen chemischen Substanzen reagieren, wurden entworfen und werden in dieser Arbeit vorgestellt.
Die Promoter, die in den drei MicRoboCop-Geräten eingesetzt werden, sind ein arsen-und antimonempfindlicher Promoter, SbRFP 9 , 10,ein bleisensibler Promoter, PbRFP11, 12und ein TNT-sensibler Promoter, TNT-RFP 13. Da eine Suche in der Literatur keinen Promoter ergab, der darauf reagiert, wurde stattdessen der TNT-Promoter ausgewählt, da dieser Promoter empfindlich auf eine Reihe von strukturell verwandten Verbindungen reagiert (insbesondere 2,4-Dinitrotoluene und Dinitrobenzol), die als Teil der organischen Verbindungen bekannt sind, die in der GSR zurückgelassen werden. Dieser Projektträger wurde erfolgreich eingesetzt, um in vergrabenen Landminen 13 Minenmengen von TNT und 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT) gezielt zu erkennen. Mit den drei Geräten gemeinsam als System wird ein positiver Test für GSR in allen drei Geräten Fluoreszenz erzeugen. Ein Fluoreszenzsignal in nur einem oder zwei Geräten zeigt eine andere Umweltquelle der Analyten oder im Fall des TNT-Promoters an, die Aktivierung durch eine Verbindung, die keine organische Verbindung ist, die in GSR zurückgelassen wird. Durch die gemeinsame Nutzung aller drei Geräte wird die Möglichkeit eines falschen positiven Ergebnisses aufgrund von Umweltquellen minimiert. Bleifreie Munition, die an Popularität gewinnt, macht immer noch nur etwa 5% des Munitionsverkaufs in den USA aus; Daher können falsche negative Ergebnisse aufgrund des Fehlens von Blei möglich sein, aber es gibt immer noch einen Nutzen in einem Sensor, der Blei als Markerfür GSR 14 verwendet. Zusätzlich zu dieser speziellen forensischen Anwendung kann jedes Gerät separat zur Erkennung von Umweltbelastungen eingesetzt werden.
Zu den vorgestellten Protokollen gehören die synthetischen Biologietechniken, mit denen die Geräte (Sensorbakterien) erstellt werden, und die Analysetechniken, um die Funktion der Geräte zu überprüfen und die erhaltenen Fluoreszenzsignale zu analysieren. Das Protokoll umfasst auch die Sammlung von forensischen Beweisen in Form von Handwischungen, um GSR aus den Händen eines Verdächtigen oder Swabbing zu sammeln, um GSR von einer Oberfläche zu sammeln. Die Ergebnisse des Bleisensor-Gerätes werden als Beispielresultate dargestellt, zusammen mit der Demonstration eines positiven Tests für GSR mit einem verbrauchten Patronengehäuse.
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Protocol
NOTE: Synthese von E. coli Ausdruck RFP wird vorgestellt.
1. Zubereitung der Plasmid-DNA von E. coli
- Tauen Sie E.coli , das ein Plasmid mit einem RFP-Gen und Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, und wachsen Sie die E.coli auf Luria Broth (LB) Agarplatten, die 100 μg/mL Ampicillin bei 37 ° C für 24 Stunden enthalten. Verwenden Sie zum Beispiel das Plasmid J10060 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe Materialtabelle). Das Plasmid J10060 enthält ein Gen für RFP (rotes Fluoreszenzprotein) unter der Kontrolle einer pBad Promoter-Region und ein Ampicillin-Resistenz-Gen. Alternativ können Sie E.coli (siehe Schritt 3.2) mit dem Plasmid vor dem Wachstum auf den LB-Bagar-Platten umwandeln.
- Folgen Sie einem Standard-Miniprep-Protokoll (siehe Materialtabelle), um die DNA von 1 mL einer E. coli-Kultur zu isolieren, die das Plasmid J10060 enthält. Der Zweck des folgenden Protokolls ist es, den pBad Promoter zu entfernen und durch den gewünschten Promoter für das Gerät zu ersetzen.
- Nach dem Plasmid-Miniprauch die DNA im Gefrierschrank aufbewahren, bis sie zur Verdauung bereit sind.
2. Restriction-Enzym Verdauung
- Richten Sie die folgende Reaktion in einem Mikrozentrifugenrohr für die Verdauung von EcoRI und NheI ein: 10 μL von J10060 Plasmid DNA (isoliert in Schritt 1), 8 μL Wasser und 1 μL von EcoRI und NheI-Enzymen, die vorgemischt sind mit 1 μL Puffer (siehe Materialtabelle).
- Für den Promoter DNA, die folgende Reaktion in einem Mikrozentrifugenrohr für EcoRI und NheI Verdauung: 10 μL von geglühten Promoter-DNA-Sequenzen (8 μL Wasser, und 1 μL von EcoRI und NheI-Enzymen, die vorgemischt mit 1 μL Puffer.
- Für Sb-, Pb-, Die Oligonukleotide im Puffer auflösen (30 mM HEPES, pH 7,5; 100 mM Kaliumacetat), Inkubat in gleichmäßigen molaren Konzentrationen, Wärme auf 94 ° C für 2 min und bei Raumtemperatur nach und nach abkühlen).
- Mischen Sie die Proben, indem Sie die Proben vorsichtig nach oben und unten mit der Pipette auf 10 μL setzen.
- 30 min bei 37 ° C in die Höhe treiben.
- Hitze inaktivieren Sie die Enzyme bei 80 ° C für 5 min.
- Bewahren Sie die verdaute DNA im Gefrierschrank auf, bis Sie für den nächsten Schritt bereit sind.
3. Ligation und Transformation
-
Verbindung
- Mit der Plasmid-und Promoter-DNA, die mit EcoRI und NheI in Schritt 2 doppelt verdaut wurde, setzte das Reaktionsgemisch, das in Tabelle 1 in einem Mikrozentrifugenrohr auf Eis gezeigt wird; Fügen Sie die T4 DNA Ligase zuletzt hinzu.
Hinweis: Tabelle 1 zeigt eine Ligation mit einem molaren Verhältnis von 1:3 Vektor, die für die angegebenen DNA-Größen eingelegt werden. - Die Reaktion sanft vermischen, indem man auf und ab pipettieren und kurz mikrozentrifugen.
- Bei Raumtemperatur 10 min einweichen.
- Hitze bei 65 ° C für 10 min inaktivieren.
- Mit der Plasmid-und Promoter-DNA, die mit EcoRI und NheI in Schritt 2 doppelt verdaut wurde, setzte das Reaktionsgemisch, das in Tabelle 1 in einem Mikrozentrifugenrohr auf Eis gezeigt wird; Fügen Sie die T4 DNA Ligase zuletzt hinzu.
-
Umwandlung
- Tauschen Sie ein Rohr mit 20 μL DH5-alpha-Kompetent E. coli-Zellen auf Eis, bis die letzten Eiskristalle verschwinden.
- Fügen Sie 5 μL Plasmid-DNA in das Zellgemisch ein. Die Röhre 4-5 mal vorsichtig flecken, um die Zellen und die DNA zu mischen.
- Die Mischung 2 min auf Eis legen.
- Hitzeschock bei exakt 42 ° C für exakt 30 s. Nicht mischen.
- 2 min auf Eis legen. Nicht mischen.
- Pipette 380 μL Raumtemperatur SOC in das Gemisch. Sofort auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/mL) verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
- Überprüfen Sie die Platten innerhalb von 24 Stunden auf Wachstum.
- Die Platten mit Dichtungsfolie versiegeln und im Kühlschrank aufbewahren, bis der nächste Schritt fertig ist.
4. Kolonie PCR
- Fügen Sie die Reaktionsmischungen, die in Tabelle 2 gezeigt werden, in einPCR-Rohr (4 Reaktionsrohre einrichten) hinzu.
- Die Reaktionen vorsichtig vermischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
- Mit einer gelben Pipette-Spitze eine Kolonie (oder eine sehr kleine Region) des umgebauten E. coli abkratzen. Übertragen Sie einen Schwenk dieses E. coli auf eine neue LB/Ampicillin/Agar-Platte, die abgetrennt wurde, und legen Sie dann die Pipette-Spitze in das PCR-Rohr ein. Schütteln Sie die Pipettspitze, um den E. coli mit dem PCR-Mix zu mischen. Wiederholen Sie drei weitere Male für zusätzliche Kolonien. Übertragen Sie die PCR-Rohre auf eine PCR-Maschine und beginnen Sie mit dem Thermofahren mit dem Programm in Tabelle 3.
- Führen Sie Gel-Elektrophorese mit einem 2%-Agrog-Gel in TAE aus, um festzustellen, welche Kolonien die beste Ligation in das Plasmid haben und wachsen Sie diese Kolonien auf einer neuen Platte.
- Die Platten im Kühlschrank aufbewahren, bis sie zum Testen bereit sind. Bereiten Sie eine flüssige Kultur in der Luria-Brühe mit 100 μg/mL Ampicillin für chemische Tests.
5. DNA-Sequenzierung
- Für jede Probe 5 μL Plasmid, 4 μL der Sequenzierungsgrundierung und 3 μL deionisiertes Wasser hinzufügen.
- Legen Sie dieses Gemisch in ein Rohr und senden Sie es zur DNA-Sequenzierung (siehe Materialtabelle).
- Analysieren Sie DNA-Sequenzdaten, um die zu erwartenden und beobachteten DNA-Sequenzen mit Hilfe von DNA-Sequenzanalyse-Software zu vergleichen, um sicherzustellen, dass es keine Mutation gibt und dass die Gene korrekt eingefügt wurden.
Hinweis: Die Verwendung von E. coli als Chemikaliensensor wird unten dargestellt.
6. Zubereitung von E. coli-Kulturen
- Bereiten Sie LB mit 100 μg/mL Ampicillin für flüssige Kulturen vor.
- Bereiten Sie flüssige Kulturen der Sensorbakterien, die positiven Kontroll-*-Bakterien und die negative Kontrolle * * Bakterien vor.
NOTE: * Positive Kontrollbakterien: E. coli, das ein Plasmid enthält, mit dem RFP-Gen unter Kontrolle eines konstitutiven Promoters; Plasmid E1010 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe Materialtabelle) wurde bei dieser Arbeit verwendet.
* * Negative Kontrollbakterien: E. coli, das ein Plasmid enthält, mit dem RFP-Gen unter Kontrolle eines anderen Promoters, wie dem pBad Promoter (Plasmid J10060 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe Tabelle der Materialien) ) oder ein Plasmid, das nicht über das RFP-Gen verfügt. - Legen Sie die Kulturen bei 37 ° C und 220 U/min bei mindestens 8 Stunden, maximal 18 Stunden, in einen schüttelnden Brutkasten.
7. Titrierung E. coli, um die Funktion des Gerätes zu überprüfen
Hinweis: Sobald die Sensoren zur Überprüfung der Funktion zugeordnet sind, muss dieser Schritt nicht mehr wiederholt werden. Eine positive Steuerung in Form von Addition von Blei, Antimon, und 2,4-DNT oder 1,3-Dinitrobenzol (1,3-DNB) kann die Funktion der Geräte für jeden Einsatz überprüfen, ohne dass die volle Titration erforderlich ist.
- Bereiten Sie eine Bestandslösung der Analysten (n) von Interesse bei einer Konzentration von 10 ppm in Wasser. Wenn es sich um eine Lösung handelt, verwenden Sie eine 50/50 Wasser-/Methanol-Mischung.
- Mit der Tabelle 4 als Anleitung die entsprechende Anzahl steriler Kulturrohre kennzeichnen und Platz 2 mL der kultivierten Brühe (aus Protokollschritt 6) in jede Röhre geben.
Hinweis: Um einen allgemeinen Analysebereich zu bestimmen, machen Sie mindestens drei verschiedene Ebenen eines Analyten mit den Sensorbakterien, eine Ebene mit der negativen Kontrolle und eine Ebene mit der positiven Kontrolle. Es sollte auch ein Rohr von jedem der Bakterien, die kein zusätzliches Metall hat (eine andere Art von negativer Kontrolle). Um den analytischen Bereich und die Grenzen der Erkennung genauer zu bestimmen, verwenden Sie eine größere Bandbreite an Analytenkonzentrationen. - Fügen Sie die Rohre mit 2 ml Brühe, wie in Tabelle 4erwähnt, mit Analytenlagerlösung fort, legen Sie die Schnappkappen auf die Kulturröhre, so dass sie locker sind (um den Luftstrom in die Röhre zu ermöglichen) und wirbeln Sie die Kulturröhre.
- Die Schnappkappen locker auf den Kulturrohren lassen, bei 220 U/min in einen Schüttelinkubator und bei mindestens 24 Stunden 37 ° C in einen Schüttelinkel geben.
- Entfernen Sie die Rohre aus dem Inkubator, schnappen Sie die Kappen fest auf die Rohre und lagern Sie die Rohre im Kühlschrank, bis die Rohre für die Fluoreszenzanalyse bereit sind.
8. Verwendung von E. coli als chemischer Sensor für GSR
- Mit Hilfe eines Ethanol-basierten Wischs, der für das Entfernen von Blei konzipiert ist (siehe Materialtabelle), wischen Sie alle Oberflächen, auch zwischen den Fingern. Verwenden Sie für jede Hand eine separate Abwisches. Die Tücher in einem entsprechend gekennzeichneten Dichtungsbeutel bis zur Analyse lagern.
- Für zu prüfende Oberflächen: Verwenden Sie eine alkoholhaltige Wische für große Oberflächen oder einen mit Ethanol befeuchteten Baumwollschwab für kleine Oberflächen.
Hinweis: Um die Reaktion der Sensoren auf GSR zu demonstrieren, wurde das Innere eines verbrauchten 40 Kaliber-Patronenhauses mit einem Ethanol befeuchteten Wattestäbchen überzogen. - Mit sauberen Handschuhen und mit gesäuberter Schere, schneiden Sie einen ca. 1 cm2 Abschnitt aus der Mitte des Wischens.
- Das geschnittene Stück der Hand wischen oder den Baumwollschwab direkt in ein Kulturrohr legen, das 2 ml der Sensorbakterien enthält und so sicher ist, dass es in die Brühe eintaucht.
- Gehen Sie wie oben beschrieben in den Schritten 7.4 – 7.5 vor.
9. Fluoreszenzanalyse mit tragbarem Spektrometer (siehe Materialtabelle)
- Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Rohre zu schütteln.
- Bereiten Sie das Spektrometer vor, um Fluoreszenzemissionen auf der entsprechenden Wellenlänge für Ihre RFP-Variante mit einer Anregungswellenlänge von 500 nm zu sammeln.
- Verwenden Sie die Luria-Brühe, um ein leeres Spektrum aufzunehmen.
- Übertragen Sie jeden Supernatant vorsichtig auf eine Kleinserien und sammeln Sie die Emissionsintensität.
10. Fluoreszenzanalyse mit 96-Brunnenplattenleser (siehe Materialtabelle)
- Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Rohre zu schütteln.
- 200 mL der Brühe auf einen Brunnen in der Brunnenplatte übertragen. Zeichnen, welche Proben in jeden Brunnen der Platte gingen.
- Stellen Sie das Fluorimeter ein, um die Emissionsintensität an der entsprechenden Wellenlänge für die RFP-Variante zu erfassen.
11. Datenanalyse
- Mit dem Signal, das aus allen negativen Kontrollen gewonnen wird (RFP-Negative Bakterien oder Sensorbakterien ohne zusätzliche Analyte), berechnen Sie ein durchschnittliches Fluoreszenzsignal für den Hintergrund.
- Subtrahieren Sie das durchschnittliche Hintergrundsignal von jedem Fluoreszenzsignal, das für die Sensorbakterien gewonnen wird, um einen Hintergrund korrigierte Fluoreszenzintensität zu erhalten.
- Schätzen Sie das Verhältnis von Signal-Rauschen (S/N), indem Sie den Hintergrund korrigierte Fluoreszenzintensität durch das durchschnittliche Hintergrundsignal teilen. Wenn das S/N-Verhältnis größer als 3 ist, ist der Test positiv.
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Representative Results
Fluoreszenzspektren für die RFP-Variante, die in dieser Arbeit verwendet wird, sind in Abbildung2 dargestellt. Diese Daten stammen vom PbRFP-Gerät, da es auf Blei und das TNT-RFP-Gerät reagiert, da es auf zwei Analyten reagiert, 2, 4-DNT und 1,3-DNB. Diese Abbildung zeigt das Spektrum einer negativen Kontrolle (kein Analyte hinzugefügt), und die Spektren auf zwei verschiedenen Ebenen der Analyse hinzugefügt. Das maximale Fluoreszenzsignal für die verwendete RFP-Variante wurde bei 575 nm (Anregungswellenlänge 500 nm) beobachtet. Die Daten in Abbildung 3 sind repräsentativ für ein einzelnes Titration Experiment (daher sind keine Fehlerbalken enthalten) des PbRFP-Geräts, das wie in Schritt 7 des Protokolls zugetippt wird. Abbildung 3a zeigt Daten, die aus dem tragbaren Spektrometer gesammelt wurden, während Abbildung 3b Daten zeigt, die aus dem Fluorimeter (aus dem gleichen Satz von Lösungen) gesammelt wurden. Es gibt einen allgemeinen Trend, die Fluoreszenz zu erhöhen, da die Konzentration von Metall zunimmt. Bemerkenswert ist, dass bei hohen Konzentrationen, größer als etwa 800 ppb, die Reaktion aufgrund der Toxizität des Metalls bei einer so hohen Konzentration abnimmt. Diese maximale Antwortstufe kann je nach Analyte variieren. Unsere bisherige Arbeit mit dem SbRFP hat gezeigt, dass die Bakterien höhere Mengen (mindestens bis zu 1.000 ppb) an Arsen und Antimon 10 vertragen können. Die Literatur auf der Ebene dieser Analysen, die von Handschwaben gesammelt werden, zeigt, dass diese Blei-und Antimoniveaus mit dem übereinstimmen, was aus einemHandschwab 15 gesammelt werden könnte. Darüber hinaus zeigen die in Abbildung 4 vorgestellten Ergebnisse, dass die Bakterien die Mengen an Analyten, die in einem Patronengehäuse vorhanden sind, ohne Zelltod vertragen können, was deutlich höher sein wird als das, was aus einem Handschwab gesammelt wird.
Mit den berechneten S/N-Werten für diese Daten war der niedrigste nachweisbare Bleigehalt 12 ppb (nachweisbar, wie er durch einen S/N größer als 3 definiert ist). Im Gegensatz dazu wird der S/N für die tragbaren Spektrometerdaten nur 2 auf höchster Ebene getestet. Der Trend, die Fluoreszenz mit zunehmender Analytenkonzentration zu erhöhen, ist aber noch deutlich zu erkennen.
Abbildung 4a zeigt einen positiven Test für GSR. Um dieses Ergebnis zu erzielen, wurden Ethanolschwaben aus dem Inneren eines verbrauchten. 40 Kaliber-Patronengehäuse gesammelt und den drei Sensorbakterien zugesetzt, wie in Schritt 8 des Protokolls. Diese Abbildung zeigt auch eine positive Kontrolle (Bakterien, die RFP verfassungsmäßig ausdrücken) und eine negative Kontrolle in Form des SbRFP-Geräts ohne Analyte. Die Patronengehäuse wurden als Tessengergebnisse verwendet. Bei künftigen Arbeiten werden Handschwaben von Personen gesammelt, von denen bekannt ist, dass sie eine Pistole abgefeuert haben, um zu zeigen, dass die Sensoren auch auf Handschwabs reagieren.
| der Teil | 20 μL REACTION |
| 10X T4 DNA Ligase Buffer | 2 μL |
| Plasmid-DNA (3 kb) | 3 μL |
| Promoter-DNA (0,7 kb) | 10 μL |
| Nukleasfreies Wasser | 4 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
Tabelle 1. Reaktionsmix für Ligation, Protokollschritt 3.1.1.
| der Teil | 25 μL Reaktion |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| EinTaq 2X Master Mix | 12,5 μL |
| Nukleasfreies Wasser | 11 μL |
Tabelle 2. Reaktionsmischungen für Kolonie PCR, Protokollschritt 4.1.
| der Schritt | Aushilfskraft | die Zeit |
| Erste Denaturierung | 94 ° C | 30 s |
| 30 Zyklen | 94 ° C | 30 s |
| 55 ° C | 45 s | |
| 68 ° C | 60 s | |
| Endverlängerung | 68 ° C | 5 Min. |
| halten | 4 ° C |
Tabelle 3. PCR-Thermocycling-Parameter für den Protokollschritt 4.3.
| Röhrenausweis | die Bakterien | Konzentration der Analytenlösung hinzugefügt (ppm) | Metal hinzugefügt | Volumen der Analyselösung auf 2.000 μL Brühe hinzugefügt | [analyte], ppb |
| 1 | PbRFP | 10 | Pb | 2,5 | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP | 0 | nichts | 0 | 0 |
| 5 | RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | RFP pos | 10 | Pb | 10 | 50 |
Tabelle 4. Allgemeines Experiment für die Titration von Biosensoren, Protokollschritt 7.2.
Bild 1. Biologische Elemente der MicRoboCop Geräte. (a) Diagramm des allgemeinen Geräts für MicRoboCop in einem Plasmid mit einem Ampicillin-Resistenzgen. (b) Diagramm jedes Gerätes, das zu einem MicRoboCop-System kombiniert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2. Fluoreszenzspektren von PbRFP und TNT-RFP-Bakterien in Anwesenheit und Abwesenheit von Analyten. Daten, die über Fluorimeter gesammelt werden. (a) Fluoreszenzspektren von PbRFP-Bakterien in Gegenwart und Fehlen von Analyten (Pb). (b) Fluoreszenzspektren von TNT-RFP-Bakterien in Anwesenheit und Abwesenheit von zwei Analyten (2,4-DNT und 1,3-DNB). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3. Vergleich des tragbaren Spektrometersystems und des Fluorimeters zur Erkennung der Fluoreszenzspektren von PbRFP-Bakterien in Gegenwart und Fehlen von Analyten (Blei). (a) Lead-Tittrationsdaten für PbRFP-Sensorbakterien, die auf tragbarem Spektrometersystem gesammelt werden. (b) Lead titration Data (gleiche Proben) für PbRFP-Sensorbakterien, die auf Fluorimeter gesammelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4. Ethanolschwaben, die aus dem Inneren einer Pistolenpatrone im Kaliber 0,40 entnommen wurden, um die Reaktion der drei Geräte auf GSR zu zeigen. S/N für alle Signale war größer als 3, was auf einen positiven Test für GSR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Änderungen und Fehlerbehebungen
Das in Tabelle 4 beschriebene Experiment kann in jeder Weise modifiziert werden, die den entworfenen Sensoren entspricht. Der wichtigste Aspekt eines chemischen Sensors ist die Bewertung seiner Empfindlichkeit und Spezifität. Es ist von Vorteil, dass eine Vielzahl von Konzentrationen des Analyten analysiert wird, um den nützlichen Analysebereich des Sensors zu bestimmen. Es lohnt sich auch, ein Maximum an Analyte für die Zellen zu bestimmen. Da es sich bei den in dieser Studie verwendeten Analyten um toxische Metalle (Pb und Sb) oder organische Verbindungen in einer Methanol-Lösung (für die TNT-Derivate) handelt, gibt es eine obere Ebene, auf der der Zelltod aufgrund der Toxizität des Analyten oder der Lösung auftreten wird (in der Regel höher als 500 – 1,0 00 ppb für die bisher durchgeführten Experimente).
Einschränkungen der Technik
Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, sind qualitativ hochwertiger Natur, sollen aber die quantitativen Fähigkeiten von RFP modifizierten E. coli demonstrieren. Die Empfindlichkeit des Sensors kann je nach Dichte der Zellen in der Brühe erheblich zwischen den kultivierten Chargen variieren. Wenn quantitative Ergebnisse erforderlich sind, sollte die Zellkonzentration durch die Messung der optischen Dichte der flüssigen Kulturen vor der Analyse geschätzt werden. Wenn die optische Dichte der Kulturen bestimmt wird, können die Zellen entsprechend verdünnt werden, um die Variabilität zwischen den Experimenten zu verringern. Als voraussichtlicher Test für die gewünschten Analysen ist die qualitative "present/not present"-Antwort jedoch für die hier diskutierten Anwendungen akzeptabel. Die Lebensdauer der Zellen auf der Agarplatte ist ebenfalls zu beachten – bisherige Arbeiten haben darauf hingewiesen, dass die Platten bis zu 2 Wochen im Kühlschrank gelagert werden können, aber die Geräte funktionieren gegen Ende dieses Zeitrahmens und darüber hinaus nicht sehr gut.
Eine weitere Überlegung ist die Wahl der Geräte, die zur Analyse des Fluoreszenzsignals verwendet werden. Mit einem Forschungsgrade-Spektrophotometer mit 96-Wellplattenleser können exakte Erregungs-und Emissionswellenlängen ausgewählt werden, die die Empfindlichkeit erhöhen können. Mit diesem System können die Ergebnisse von bis zu 96 Experimenten gleichzeitig gesammelt werden. RFP-Fluoreszenz kann auch mit einem tragbaren Spektrometersystem analysiert werden. Tragbare Instrumente erlauben in der Regel ausgewählte Erregungsbänder, die mit der Anregungsmaxima der verwendeten RFP-Variante übereinstimmen können oder auch nicht. Solange sich die Anregungswellenlänge jedoch in einem angemessenen Bereich der Anregungsmaxima befindet, ist das tragbare Instrument in der Regel einsatzfähig (wenn auch mit einem Verlust an Empfindlichkeit). Die Kosten für die tragbaren Systeme sind deutlich geringer als das Forschungsgrade-Spektrophotometer, und die Portabilität kann sicherlich von Vorteil sein. Anhand der möglichen Anwendung der Bakterien kann der Analyst entscheiden, ob die zusätzlichen Kosten und der Verlust der Portabilität mit dem Spektrophotometer-System gerechtfertigt sind.
Bedeutung gegenüber bestehenden Methoden
Das in dieser Arbeit beschriebene dreiteilige MicRoboCop-System soll als qualitativer, voraussichtlicher Test für die Anwesenheit von GSR dienen. Derzeit erfordert der "Goldstandard"-Nachweistest für GSR eine Expertenanalyse durch SEM-EDX. SEM-EDX-Geräte sind teuer und werden in der Regel von hoch spezialisierten Analysten betrieben. Darüber hinaus ist die GSR-Evidenz in der forensischen Kasse sehr variabel und viele Variablen tragen zur Ablagerung von GSR auf Händen und Flächen16 bei. Ein voraussichtlicher Test für GSR kann für die Ermittler nützlich sein, da er eine wahrscheinliche Ursache für die Suche nach Personen oder Eigentum liefert. Im Vergleich zu elektrochemischen Tests oder Tests wie der Ionenbewegungsspektroskopie bietet diese Methode eine einfache, leicht verfügbare Instrumentierung, zu der die meisten analytischen Labore Zugang haben sollten.
Weitere Anwendungen
Die in diesem Manuskript beschriebenen Geräte sollen zu einem dreiteiligen System zur voraussichtlichen Identifizierung von GSR kombiniert werden. Jedes Gerät des MicRoboCop-Systems (SbRFP, PbRFP und TNT-RFP) kann aber auch einzeln eingesetzt werden, um chemische Verunreinigungen in Lebensmitteln, Wasser oder Umweltproben zu erkennen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass das TNT-RFP-Gerät als In-situ-Sensor für Landminen13,17eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse, die hier und in unseren bisherigen Arbeiten vorgestellt wurden, haben gezeigt, dass die Geräte SbRFP und PbRFP Konzentrationen erkennen können, die niedrig genug sind, um teurere und ausgeklügelte Geräte zu konkurrieren, wie z. B. induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissionsspektroskopie ( ICP-AES) und Atomabsorptionsspektroskopie (AAS). Der SbRFP-Sensor ist sowohl empfindlich gegen Arsen als auch für Antimon. Diese Geräte können eine kostengünstige Option für die Analyse von toxischen Schwermetallkontamination bieten.
Das hier vorgestellte Protokoll zur Herstellung des E. coli ist für jedes System anwendbar, das Standard-genetische Teile der synthetischen Biologie verwendet, um E . coli zu synthetisieren, das RFP ausdrückt. Die analytische Methode ist für jedes System, das RFP ausdrückt, anwendbar und kann daher verwendet werden, um jedes bakterielle Biosensorsystem zu analysieren, das mit synthetischen Methoden erstellt wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Studenten der Longwood University in BIOL 324 (Genetics) und die Studierenden von CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory Problem Solving) würdigen, die an der ersten Vorbereitung und Erprobung der Antimonie-und Bleibiosensoren beteiligt waren. Die Idee für MicRoboCop entstand auf dem GCAT SynBIO-Workshop (Sommer 2014), der vom NSF und Howard Hughes Medical Institute finanziert und von der University of Maryland Baltimore County veranstaltet wird. Die Autoren bestätigen auch die Förderung, die sie von der Cook-Cole College of Arts and Sciences der Longwood University und dem GCAT SynBio Alumni Grant erhalten haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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