Summary
Разработан метод установления клеточных линий афатиниб-сопротивления из клеток легких Аденокарциномы ПК-9, и были охарактеризованы устойчивые клетки. Устойчивые клетки могут быть использованы для исследования эпидермального фактора роста рецептора тирозина киназы ингибитор-резистентность механизмов, применимых для пациентов с немелкоклеточным раком легких.
Abstract
Приобретенная устойчивость к молекулярным ингибиторам целей является серьезной проблемой в терапии рака. Рак легких остается основной причиной смерти, связанной с раком, в большинстве стран. Открытие "онкогенных мутаций драйвера", таких как рецепторэпидермального фактора роста (EGFR)-активирующие мутации, и последующее развитие молекулярных целевых агентов ингибиторов тирозина киназы EGFR (TKIs) (гефитиниб, эрлотиниб, afatinib, dacomitinib, и osimertinib) резко изменили лечение рака легких в последние десятилетия. Тем не менее, эти препараты по-прежнему не эффективны у пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC), несущими EGFR-активирующие мутации. После приобретенной резистентности, системное прогрессирование NSCLC остается значительным препятствием в лечении пациентов с мутацией-положительным И ЕНФР NSCLC. Здесь мы представляем пошаговый метод эскалации дозы для создания трех независимых приобретенных афатиниб-устойчивых клеточных линий из NSCLC PC-9 клеток укрывательство EGFR-активирующих мутаций 15-базовых удаляний пары в EGFR exon 19. Кратко представлены методы характеристики трех независимых линий клеток сопротивления афатиниба. Приобретенные механизмы сопротивления ЭГФР ТКИ неоднородны. Поэтому необходимо изучить несколько клеточных линий с приобретенным сопротивлением EGFR-TKIs. Десять-двенадцать месяцев, необходимых для получения клеточных линий с приобретенным сопротивлением, используя этот шаг подход эскалации дозы. Открытие новых механизмов приобретенного сопротивления будет способствовать разработке более эффективных и безопасных терапевтических стратегий.
Introduction
Пять ингибиторов тирозина киназы, ориентированные на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), в том числе гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дакомитиниб и осимертиниб в настоящее время доступны для лечения пациентов с EGFR мутацией-положительной немелкоклеточной легкой рака (NSCLC). За последнее десятилетие, терапии для таких пациентов претерпели драматические разработки с открытием новых потенциальных EGFR-TKIs. Среди пациентов с аденокарциномой легких соматические мутации в ЭГФР выявлены примерно у50% азиатских и 15% кавказских пациентов 1. Наиболее распространенными мутациями в EGFR являются мутация точки L858R в EGFR exon 21 и 15 базовых парах (bp) удаления в EGFR exon 192. В EGFR мутационно-положительных пациентов с NSCLC, EGFR-TKIs улучшить скорость ответа и клинические исходы по сравнению с предыдущим стандартом платиновой химиотерапии дублет3.
Gefitinib и эрлотиниб были первыми утвержденными ингибиторами малых молекул и, как правило, называются EGFR TKIs первого поколения. Эти EGFR ТКИ блокируют активность тирозина киназы, конкурируя с АТФ и обратимо связывая с ат-плехаумом4. Afatinib является второе поколение EGFR TKI, что необратимо и ковалентно связывается с тиразин киназы области EGFR и характеризуется как пан-человеческого ингибитора семьи EGFR5.
Несмотря на драматическую пользу этих методов лечения у пациентов с NSCLC, приобретенная резистентность неизбежна. Наиболее распространенным механизмом сопротивления против первого и второго поколения EGFR TKIs является появление мутации T790M в EGFRexon 20, которая присутствует в 50-70% образцов опухоли 6,7,8. Другие механизмы сопротивления включают сигналы шунтирования (к MET, IGF1R, и HER2), преобразование в мелкоклеточный рак легких, и индукции эпителиального к мезенхимальному переходу, который происходит до клинически и клинически9. Механизмы сопротивления ЭГФР ТКИ неоднородны. Путем определять новые механизмы сопротивления в доклинических изучениях, может быть по возможности начать новые терапии для того чтобы отжать сопротивление. Оптимальная последовательность терапии, которые максимизируют клиническую пользу для пациентов должны рассмотреть механизмы сопротивления и терапевтической цели.
Крайне важно выбрать правильную родительскую клеточную линию, так как она является основой всех последующих экспериментов. Стратегии отбора начинаются с клинической значимости; необходимо выбрать химиотерапию и лучевую наивную клеточную линию. Предыдущая химиотерапевтическая и/или радиационная обработка может вызвать изменение путей сопротивления и изменения выражения маркеров лекарственной резистентности. В этом исследовании, PC-9 клетки, несущие 15 bp удаления в EGFR exon 19, используются для создания приобретенных устойчивость к afatinib. Эта клеточная линия была получена от японского пациента NSCLC, который не получил предварительной химиотерапии и радиации.
Потому что afatinib вводится устно на ежедневной основе, непрерывное лечение в пробирке, где клетки культивируются постоянно в присутствии afatinib будет клинически актуальным. Доза препаратов, используемых в различных этапах эксперимента, должна быть оптимизирована для родительской клеточной линии выбранной. Для определения подходящего лекарственного диапазона можно использовать цитотоксический асссс, который должен быть сопоставим с фармакокинетической информацией препарата.
На протяжении всего процесса отбора вся популяция клеток поддерживается как единая группа; клонирование или другие методы разделения не используются. Клетки сначала постоянно подвергаются воздействию низкого уровня препарата. Впоследствии, после того, как клетки адаптируются к росту в присутствии препарата, дозу препарата медленно увеличивается до конечной оптимальной дозы препарата10,11. Кроме того, пульс препарата-администрации или мутагенеза могут быть использованы для выбора клеток резистентности, которые также выполняются до медикаментозного лечения 12,13. К сожалению, случаи, когда лекарственная устойчивость не развивается, как правило, не сообщаются. Стратегии отбора разрабатываются с целью имитации условий онкологических больных для восстановления клинически релевантной резистентности. Иногда для выявления молекулярных изменений, связанных с механизмами лекарственной устойчивости, используется высокая концентрация препарата. Эта модель становится менее клинически актуальной.
Здесь мы описываем метод создания трех независимых афатиниб-устойчивых клеточных линий из клеток PC-9, укрывающих 15 bp удаления в EGFR exon 19, а также первоначальную характеристику устойчивых к афатинибным клеточным линиям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание трех независимых Afatinib устойчивых PC-9 сотовых линий
- Определение первоначальной концентрации воздействия афатиниба для клеток ПК-9 с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-yl)-2,5- дифениллеттразолий бромид (МТТ)
- Культура PC-9 клеток в среде роста, содержащей сыворотки крупного рогатого скота плода (10%), пенициллин (100 U/mL), и стрептомицин (100 мкг/мл) в клеточной культуре лечение 10-см блюдо в 5% CO2 инкубатора при 37 градусов по Цельсию.
- Resuspend PC-9 клеток на 4 х 104 клетки / мл в среде роста, а затем семена на 50 л / хорошо в 96-хорошо микроплиты. Окончательная концентрация клеток составляет 2,0 х 103 клетки/50 л/ну. Инкубировать на ночь в 5% CO2 инкубатор при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 50 зЛ раствора афатиниба в различных концентрациях: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 и 20 мкм к скважинам, содержащим среду роста (50 л). Окончательный объем и концентрации афатиниба составляют 100 кл/ и 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 и 10 мкм соответственно.
- Инкубировать 96-хорошую пластину на 96 ч в 5% CO2 инкубаторпри при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 15 qL раствора красителя (см. Таблицаматериалов) к каждому колодцу и инкубировать по 4 ч в 5% CO2 инкубатор при 37 градусах По Цельсия, а затем добавьте 100 л растворения/стоп-решения (см. Таблица Материалов)к каждому колодцу и инкубировать на ночь в 5% CO» c10-2 инкубатор при 37 градусах По Цельсию.
- Измерьте оптическую плотность на уровне 570 нм (OD570)с помощью микроплитного считывателя (см. Таблицаматериалов). Подготовьте 6-12 реплики и повторите эксперименты по крайней мере три раза.
- Используйте статистическое программное обеспечение (см. Таблица материалов), чтобы графически участок этих данных в качестве полу-журнальный график и вычислить значение IC50, которое является концентрацией препарата, что снижает реакцию до 50% от его максимального (см. Таблица материалов ).
- Непрерывное воздействие клеток ПК-9 на необратимые EGFR-TKI, afatinib, пошаговая эскалация дозы в трех независимых 10 см блюд
- Культура PC-9 клеток в p100 блюда, содержащие 10 мл среды роста. Когда клетки PC-9 достигнут суб-слияния стадии, перенесите 1 мл клеточной подвески в три новых блюда p100 с 9 мл среды роста. 1:10 разбавленных pc-9 клетки становятся суб-слияние в 3-4 дней, с числом клеток примерно 4-5 х 105 клеток / мл.
- На следующий день добавьте 1/10 значения IC50 афатиниба в каждую из трех блюд p100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Афатиниб воссоздан в ДМСО при концентрациях запасов 1 мкм, 10 мкм, 100 мкм, 1 мМ и 5 мМ. От 1 до 10 л афатиниб-раствора добавляется в 10 мл среды роста в культуре, в соответствии с требуемой конечной концентрацией. - Когда клетки в afatinib-содержащих p100 блюда становятся суб-конфлюент, хорошо перемешать стремление с 1 мл пипетки и добавить 1 мл клеточной подвески до 9 мл свежей среды роста в новом блюде p100. Далее, добавить 10-20% более высокие концентрации afatinib к новой культуре.
- Увеличьте концентрацию афатиниба от 0,1 нМ до 1 мкм в среде путем эскалации дозы с концентрацией афатиниба, увеличенной на 10-20% на каждом шагу в течение 10-12 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда концентрация афатиниба приближается к значению IC50, рост клеток становится довольно медленным. Если клетки разделены 1:9, они не могут расти, так как эти клетки погибают от более высоких концентраций афатиниба. Поэтому при более высоких концентрациях афанитиба клетки могут быть разделены в соотношении 1:2. Наиболее устойчивые клетки выращивались в афатиниб-содержащих средах в течение 3-14 дней, и среда не была изменена до тех пор, пока устойчивые клетки должны быть проложены. - Культура афатиниб-устойчивых клеток в течение 2-3 месяцев в 1 ММ афатиниб-содержащих среды роста. При концентрации афатиниба в размере 1 мкм, 10-12 месяцев, необходимых для развития устойчивости к афатиниб в этой модели. Выполните MTT асссее, чтобы подтвердить, что клетки устойчивы к афатинибу. Три независимо установленные линии клеток сопротивления афатинаби были названы AFR1, AFR2 и AFR3.
2. Характеристика трех независимых афатиниб-устойчивых клеток
- Определение кривой роста родительских клеток PC-9 и создание устойчивых к афатинибным клеткам
- Культура PC-9, AFR1, AFR2, и AFR3 клетки в среде роста в 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию.
- Приостановите работу клеток на уровне 5 х 103 клеток/мл со средой роста, а семена 100 л/хорошо в микроплиту 96 колодцей, так что конечная концентрация клеток составляет 500 клеток/100 л/ну.
ПРИМЕЧАНИЕ: Асссес MTT выполняется для измерения значений OD570 в 0, 1, 2, 3, 5 и 7 дней. На каждый день требуется шесть 96-колотых микроплит. - Выполните MTT ассссекаждый 24 ч, а затем в дни 0, 1, 2, 3, 5 и 7. Измерьте значения OD570 и подготовьте 6-12 репликаток; повторить эксперименты по крайней мере три раза, и графически график результатов с помощью статистического программного обеспечения (см. Таблица материалов).
- Идентификация изменений геномной ДНК в EGFR по ПЦР в реальном времени
ПРИМЕЧАНИЕ: Afatinib является небольшой ингибитор молекулы, которая направлена egFR тирозина киназы. Состояние экспрессии EGFR определяется на уровне ДНК и белка.- Геномная ДНК изолирована с помощью комплекта для очистки ДНК (см. ТаблицаМатериалов) в соответствии с инструкциями производителя. Измерьте концентрацию изолированной геномной ДНК с помощью спектрофотометра (см. ТаблицаМатериалов) и отрегулируйте все образцы геномной ДНК до 25 нг/ Л.
- Усиль 50 нг геномной ДНК, что эквивалентно 2 л из 25 нг / Л запасов, используя SYBR Зеленый мастер смеси (см. Таблица материалов) и анализировать результаты с помощью флуоресценции на основе RT-PCR-системы обнаружения (см. Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия пЦР-велосипедного движения начались с первоначального шага денатурации при 95 градусах по Цельсию в течение 20 с, за которым последовали 40 циклов денатурации 95 градусов по Цельсию в течение 3 с, 60 градусов по Цельсию в течение 30 с. Конкретные наборы грунтовки таковы: EGFR F: 5 "-CAAGGCCATGGAATCTCA-3", R: 5 "-CTGGAATGAGGGAA-3". Нормализация гена LINE-1 F: 5 "-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3", R: 5 "-TGCTTGAATGCGCGTCAGAG-3".
- Оценка влияния изменений белка на уровень EGFR по западному анализу поблу
- Лечить клетки с afatinib непрерывно до экспериментов для 24 h. Мыть PC-9, AFR1, AFR2, и AFR3 клетки дважды с PBS, а затем семян их в среде роста без afatinib. Вымойте pc-9, AFR1, AFR2 и AFR3 клетки дважды с 5 мл ледяной PBS.
- Лысы клетки в буфере RIPA, содержащий 1% коктейль-ингибитор протеазы (см. Таблица материалов) и лизинируемый хилизатор фосфатазы коктейль II и III (см. Таблица материалов)и инкубировать этот раствор при 4 кв. м в течение 30 мин. Центрифуга лисаты в течение 10 мин при 100 х г и 4 градусах по Цельсию и соберите очищенные лисаты.
- Определить концентрацию белка с помощью анализа двинчониновой кислоты (см. Таблицаматериалов), настроить все образцы белка до 0,5 или 1 мкг /Л с помощью 4x образец буфера (500 мм Tris (PH 6.8), 40% глицерол, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% бромофенол синий) и варить при температуре 96 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Храните эти образцы белка при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет проведен анализ западной побелки.
- Разделите равное количество образцов белка, желательно 20-30 Л, на 8% SDS-страницы и перенесите белки на мембрану фтора поливилидена (PVDF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Натрий dodecyl сульфат-полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE) широко используется в лаборатории для разделения белков на основе их молекулярного веса.- Очистите стеклянные пластины с этанолом и собрать стеклянную пластину и прокладки. Приготовьте 8% полиакриламидных гелей, содержащих 1,5 М Tris-HCl, рН 8,8, 40% Бис-акриламид, 10% SDS, 10% APS и TEMED. Полимеризуется в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Впоследствии подготовьте укладка геля, содержащего 0,5 М Tris-HCl, рН 6,8, 40% бис-акриламида, 10% SDS, 10% APS и TEMED. Добавьте раствор укладки геля, вставьте гребень и полимеризуйте гель в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
- Поместите гели в аппарат электрофореза и заполните бак бегущим буфером (0,25 М, глицин 1,92 М и 1% SDS). Загрузите равное количество образцов белка (20-30 л) и запустите гель при 180 В. Остановить электрофорус, как только краситель фронт вытекает из геля, примерно через 60 минут.
- Вымойте гель в течение 1-2 мин с TBST, а затем передать белки на мембрану PVDF полусухой промотирования (см. Таблица материалов) для 1,5 ч при постоянном токе 300 мА.
- Блокируйте мембраны 5% обезжиренного сухого молока (см. Таблица Материалов),разбавленного раствором TBST (см. ТаблицаМатериалов) на 1 ч при комнатной температуре, а затем исследуйте мембраны с помощью анти-EGFR, антифосфо-EGFR (Y1068), anti-HER2, анти-HER3, анти-MET, и анти-актин антител (разбавленных 1:3,000 в TBST) (см. Таблица материалов) на 4 кв.м.
- Вымойте мембраны с TBST три раза в течение 10 минут, а затем подвергать мембраны вторичного антитела (разбавленные 1:200 в TBST) для 1-1,5 ч при комнатной температуре. Вымойте мембраны пять раз с TBST в течение 10 минут при комнатной температуре, подвергать их eCL решение (см. Таблица материалов), и визуализировать сигналы с помощью пленок.
- Анализ мутаций EGFR путем секвенирования
- Усиль геномную ДНК с помощью специальных грунтовок для экзонов EGFR 19-21. Условия велосипедного ПЦР начинаются с первоначального шага денатурации при 94 градусах по Цельсию в течение 1 мин, за которым следуют 30 циклов денатурации при 98 градусах по Цельсию на 10 с, аннулирование при 55 градусах по Цельсию на 30 с и расширение на 72 градуса х 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные грунтовки для EGFR Exon 19: F: 5 "-GCAATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3" R: 5 "-CATAGAAGTGAATTATGTG-3", Exon 20: F: 5 "-CCATGAGTACTATTTTGAAACTC-3", R: 5 "-CATATCCCCATGGCAACTCTTGC-3" и exon 21: F: 5 "-ATGAACATGAATTCGG-3", R: 5- GCTCACCCAGAATGTGTGGAGA-3 ". - Очистите усиленные продукты ПЦР с помощью комплекта очистки ПЦР (см. Таблицаматериалов) и последовательность ампликонов.
- Усиль геномную ДНК с помощью специальных грунтовок для экзонов EGFR 19-21. Условия велосипедного ПЦР начинаются с первоначального шага денатурации при 94 градусах по Цельсию в течение 1 мин, за которым следуют 30 циклов денатурации при 98 градусах по Цельсию на 10 с, аннулирование при 55 градусах по Цельсию на 30 с и расширение на 72 градуса х 1 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема для создания трех афатиниб-резистентных клеточных линий из клеток PC-9 с помощью поэтапной процедуры эскалации дозы показана на рисунке 1. На рисунке 2 показано снижение пролиферации клеток родительских клеток PC-9 по мере увеличения концентрации афатиниба, что указывает на то, что клетки PC-9 чувствительны к воздействию афатиниба. На рисунке 3 показано афатиниб-сопротивление трех клеточных линий. Ни одна из трех устойчивых к афатинибным клеточным линиям, AFR1, AFR2 и AFR3, не показала подавления пролиферации клеток под воздействием афатиниба. На рисунке 4 показаны кривые клеточного пролиферации для клеток PC-9, AFR1, AFR2 и AFR3. Три устойчивые афатинибные клеточные линии продемонстрировали значительно более медленный рост, чем родительские клетки PC-9. На рисунке 5 показаны уровни экспрессии EGFR gDNA в PC-9 и три устойчивые к афатиниб клеткам, которые указывают на то, что устойчивые к афатинабу клетки выражают значительно более высокие уровни EGFR gDNA, чем родительские клетки PC-9. На рисунке 6 показано белковое выражение EGFR в PC-9 и устойчивых к афатинибу клеткам. На сопоставимых уровнях экспрессии gDNA экспрессия белка EGFR была выше в резистентных клетках, чем в родительских клетках PC-9. На рисунке 7 показано, что результаты секвенирования экзонов EGFR 19 и 20 в ячейках PC-9, AFR1, AFR2 и AFR3. Pc-9 клетки показали 15 bp удаления в EGFR exon 19 и дикого типа EGFR в exon 20. Тем не менее, AFR1 и AFR2 клетки продемонстрировали усиление дикого типа EGFR exon 19. Клетки AFR3 содержали 15 bp удаления в EGFR exon 19, как в клетках PC-9, но точечная мутация T790M наблюдалась в EGFR exon 20.
Рисунок 1 : Схема процесса, используемого для создания трех устойчивых к афатинибным клеточным линиям от PC-9. Во-первых, pc-9 клетки были разделены на три p100 блюд и подвергаются afatinib на 1/10 от IC50 значение. Далее концентрации афатиниба в среде роста были увеличены поэтапно доза эскалации до 1 мкм. Через 10-12 месяцев были созданы три независимые линии клеток, устойчивых к афатинибу, которые получили название AFR1, AFR2 и AFR3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Родительские клетки PC-9 чувствительны к необратимым EGFR TKI, afatinib. Клетки были посеяны в 96-колодец микроплиты на 2 х 103 клетки / хорошо / 50 л среды роста, и preincubated ночь. Клетки лечились с указанной концентрацией афатиниба в течение 96 ч. Был проведен анализ MTT, значения OD570 были измерены с помощью микроплитного считывателя (см. ТаблицаМатериалов) и выражены в процентах от значения, полученного для контрольных ячеек. Данные представлены в виде среднего значения SEM значений от 6-12 повторяются скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Установленные клетки проявили устойчивость к необратимым EGFR TKI, afatinib. Клетки были посеяны в 96-колодец микроплиты на 2 х 103 клетки / хорошо /50 Л роста среднего и preincubated ночь. Клетки лечились с указанной концентрацией афатиниба в течение 96 ч. Был проведен анализ MTT, значения OD570 были измерены с помощью микроплитного считывателя (см. ТаблицаМатериалов) и выражены в процентах от значения, полученного для контрольных ячеек. Данные представлены в виде среднего значения SEM значений от 6-12 повторяются скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Афатиниб-устойчивые клеточные линии показали более медленное пролиферацию, чем родительские клетки PC-9. Клетки были посеяны в 96-колодные микроплиты на 5 х 102 клетки/100 Л/ну. MtT анализ был выполнен, и OD570 значения были измерены в дни 0, 1, 2, 3, 5 и 7 с помощью микроплиты читателя (см. Таблица материалов) и выражается в процентах от значения, полученного для контрольных ячеек. Данные представлены в виде среднего значения SEM значений от 6-12 повторяются скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Номер копирования гена EGFR был повышен в клетках, устойчивых к афатинибу. Высота числа копий гена EGFR измерялась количественным ПЦР геномной ДНК, выделенной из клеток PC-9, AFR1, AFR2 и AFR3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Базальный уровень белка EGFR был увеличен в устойчивых к афатинибным клеткам. Западный анализ фосфо-EGFR, EGFR, HER2, HER3 и MET-выражения в клетках PC-9, AFR1, AFR2 и AFR3. В качестве погрузочного контроля использовался актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 : Последовательность ДНК считывается в экзонах EGFR 19 и 20. Геномная ДНК PC-9, AFR1, AFR2 и AFR3 была усилена специфическими грунтовками egFR exon 19 и 21 и очищена для секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали метод создания трех независимых афатиниб-устойчивых клеточных линий и охарактеризовали эти клетки по сравнению с родительскими клетками PC-9. Пошагово облучение дозы, родительские клетки PC-9 приобрели устойчивость к afatinib в течение 10-12 месяцев. Клинически, механизмы сопротивления EGFR TKIs неоднородны, и поэтому, после первоначального лечения афатинибом, клетки PC-9 были разделены на три независимые блюда p100 и подверглись дальнейшему воздействию афатиниба. Первоначально рост клеток не был значительно замедлен, но по мере того как концентрация снадобья причалила значению IC50, пролиферация клетки была замедляна. Это критический шаг для получения клеток с приобретенной устойчивостью к ингибиторам. Распространяющиеся клетки следует разделить и перенести на новые блюда p100 в соотношении 1:10 или 1:5. Когда клетки PC-9 культивировались в блюде p100, наблюдалось некоторое соблюдение, но большинство клеток росло в суспензии. По мере увеличения концентрации афатиниба клетки придерживались дна тканевой культуры, обработанной блюдами. Если большинство клеток являются приверженцами, они могут быть отделены с помощью клеточного скребок. Окончательная концентрация афатиниба составила 1 км,5, что примерно в 5 раз превышает максимальную концентрацию сыворотки (Cmax)14. Чтобы получить явные различия между родительскими и сопротивление клонов, окончательная концентрация была установлена быть выше, чем Cмакс.
Одной из серьезных проблем во время процедуры является бактериальное загрязнение, хотя RPMI-1640 содержит пенициллин и стрептомицин. Чтобы избежать этого, два p100 блюда, содержащие свежие среды роста могут быть подготовлены, когда клетки разделены. Когда клетки достигают стадии суб-слияния, клетки в одном блюде p100 могут быть дополнительно разделены, в то время как клетки в другой тарелке p100 могут храниться при -80 градусов по Цельсию в криоконсервационном носителе (см. ТаблицаМатериалов) в качестве резервного копирования, так что если одна линия загрязнена , сохраненная линия может быть использована.
Было бы трудно полностью воспроизвести приобретение устойчивости афатиниба у людей с помощью клеточной культуры. Сообщалось, что появление мутации T790M в EGFR exon 20 является основной причиной устойчивости к афатинибу. В нашем отчете один устойчивый клон содержал мутацию T790M11. Кроме того, увеличение дикого типа EGFR, таких как в AFR1 и AFR2 клеток, было сообщено нами и другими группами15,16. Потеря мутации EGFR и увеличение дикого типа EGFR также сообщается в клинических образцах у пациентов с приобретенной устойчивостью к EGFR-TKIs 17,18. Поэтому исследования в пробирке нашей нынешней модели могут отражать молекулярные профили клинических образцов с приобретенным сопротивлением.
Этот пошаговый метод эскалации дозы считается наиболее надежным для получения приобретенных устойчивых клеток линий. Тем не менее, первоначальное воздействие высоких доз афатиниба в культивированных клетках, вероятно, лучше отражает последствия лечения афатиниб у больных раком, хотя создание устойчивых клеток является более трудным. Для этого метода можно использовать не только плавающие клеточные линии, такие как PC-9, но и линии клеток, например HCC827, 11-18 или HCC4006. Этот пошаговый метод эскалации дозы также полезен для установления клонов, устойчивых к другим ингибиторам, используя другие клеточные линии, представляющие другие виды рака.
Воздействие родительских клеток на мутагенные агенты, такие как N-этил-N-нитросоура, а затем выбор клеток, устойчивых к афатиниб или osimertinib лечения, как сообщается, чтобы позволить быстрое приобретение устойчивых клонов 19 ,20. Однако этот искусственный метод, как правило, вызывает определенные базовые замены, такие как GC на переходы AT и трансверсии AT на TA. Кроме того, EGFR TKI не является мутагенным агентом у пациентов с NSCLC. Таким образом, метод поэтапной эскалации дозы более репрезентативна, чем использование мутагенных агентов.
Хотя EGFR ТКИ изначально эффективны, клетки в конечном итоге развивают устойчивость к таким одноцелевым препаратам, что затрудняет лечение рака. Поэтому для развития необходимы ингибиторы, нацеленные на несколько молекул. Для этого необходимо получить клетки с приобретенной устойчивостью к многоцелевым ингибиторам и оценить механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим члена Института передовых исследований рака за их вдумчивые комментарии и Editage за их помощь в редактировании английского языка. Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (грант номер: 16K09590 до T.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
