Summary
फेफड़ों एडेनोकार्सीनोमा पीसी-9 कोशिकाओं से afatinib प्रतिरोध सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक विधि विकसित किया गया था, और प्रतिरोधी कोशिकाओं की विशेषता थी। प्रतिरोधी कोशिकाओं epidermal विकास कारक रिसेप्टर tyrosine kinase अवरोध करनेवाला प्रतिरोध तंत्र, गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों के लिए लागू की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
आणविक लक्ष्य inhibitors के लिए प्राप्त प्रतिरोध कैंसर चिकित्सा में एक गंभीर समस्या है. फेफड़ों के कैंसर ज्यादातर देशों में कैंसर से संबंधित मौत का प्रमुख कारण बनी हुई है। "ऑनकोजेनिक ड्राइवर उत्परिवर्तनों" की खोज, जैसे एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर(ईजीएफआर)-परिवर्तनों को सक्रिय करना, और ईजीएफआर टायरोसिन किनेस इनहिबिटर (टीकेआई) (जीफ़िटिनिब, एर्लोटिनीब, afatinib, dacomitinib, और osimertinib) नाटकीय रूप से हाल के दशकों में फेफड़ों के कैंसर के इलाज बदल दिया है. हालांकि, इन दवाओं अभी भी गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों में प्रभावी नहीं हैं (NSCLC) EGFR-सक्रिय उत्परिवर्तनले ले जाने. अधिग्रहीत प्रतिरोध के बाद, NSCLC की प्रणालीगत प्रगति EGFR उत्परिवर्तन सकारात्मक NSCLC के साथ रोगियों के इलाज में एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है. यहाँ, हम तीन स्वतंत्र अधिग्रहीत afatinib-प्रतिरोधी सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक stepwise खुराक वृद्धि विधि प्रस्तुत NSCLC पीसी -9 कोशिकाओं EGFR-सक्रिय उत्परिवर्तनों की स्थापना के लिए 15-आधार जोड़ी विलोपन में EGFR exon 19. तीन स्वतंत्र afatinib प्रतिरोध सेल लाइनों की विशेषता के लिए तरीके संक्षेप में प्रस्तुत कर रहे हैं. EGFR TKIs के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध तंत्र विषम हैं. इसलिए, EGFR-TKIs के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के साथ कई सेल लाइनों की जांच की जानी चाहिए। दस से बारह महीने के लिए इस stepwise खुराक वृद्धि दृष्टिकोण का उपयोग कर अर्जित प्रतिरोध के साथ सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. उपन्यास अधिग्रहीत प्रतिरोध तंत्र की खोज अधिक प्रभावी और सुरक्षित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में योगदान देगा।
Introduction
पांच टायरोसिन काइनेज अवरोधक, एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (ईजीएफआर) को लक्षित करना, जिसमें gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, और osimertinib वर्तमान में ईजीएफआर उत्परिवर्तन-सकारात्मक गैर-छोटे सेल फेफड़ों के साथ रोगियों के इलाज के लिए उपलब्ध हैं कैंसर (NSCLC). पिछले दशक में, ऐसे रोगियों के लिए उपचार नई क्षमता EGFR-TKIs की खोज के साथ नाटकीय विकास आया है. फेफड़ों एडेनोकार्सीनोमा वाले रोगियों में, ईजीएफआर में कायिक उत्परिवर्तनों की पहचान लगभग 50% एशियाई और 15% कोकेशियान रोगियों में की जाती है1. EGFR में सबसे आम उत्परिवर्तन EGFR exon में एक L858R बिंदु उत्परिवर्तन कर रहे हैं 21 और 15 आधार जोड़ी (बीपी) eGFR exon 192में विलोपन . एनएससीएलसी के साथ ईजीएफआर उत्परिवर्तन-सकारात्मक रोगियों में, ईजीएफआर-टीकेआई प्लैटिनम डबलेट कीमोथेरेपी3के पिछले मानक की तुलना में प्रतिक्रिया दरों और नैदानिक परिणामों में सुधार करते हैं।
Gefitinib और erlotinib पहले अनुमोदित छोटे अणु inhibitors थे और आम तौर पर पहली पीढ़ी के EGFR TKIs के रूप में जाना जाता है. ये ईजीएफआर टीकेआई एटीपी के साथ प्रतिस्पर्धा करके और एटीपी बाइंडिंग साइटों4के लिए प्रतिवर्ती बाध्यकारी द्वारा टायरोसिन काइनेज़ गतिविधि को अवरुद्ध करते हैं। Afatinib एक दूसरी पीढ़ी के EGFR TKI है कि irreversibly और covalently EGFR के tyrosine kinase डोमेन के लिए बांधता है और एक अखिल मानव EGFR परिवार अवरोध करनेवाला5के रूप में विशेषता है.
NSCLC के साथ रोगियों में इन उपचारों के नाटकीय लाभ के बावजूद, अधिग्रहीत प्रतिरोध अपरिहार्य है. पहली और दूसरी पीढ़ी के EGFR TKIs के खिलाफ सबसे आम प्रतिरोध तंत्र EGFR exon 20 में T790M उत्परिवर्तनके उद्भव है, जो ट्यूमर के नमूने 6,7,8के 50-70% में मौजूद है. अन्य प्रतिरोध तंत्र बाईपास संकेतों में शामिल हैं (MET करने के लिए, IGF1R, और HER2), छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के लिए परिवर्तन, और उपकला से mesenchymal संक्रमण के प्रेरण, जो पूर्व नैदानिक और चिकित्सकीय9होते हैं. EGFR TKIs के लिए प्रतिरोध तंत्र विषम हैं. पूर्व नैदानिक अध्ययन में उपन्यास प्रतिरोध तंत्र की पहचान करके, यह प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए उपन्यास चिकित्सकीय विकसित करने के लिए संभव हो सकता है. इष्टतम अनुक्रम चिकित्सा है कि रोगियों के लिए नैदानिक लाभ को अधिकतम प्रतिरोध तंत्र और चिकित्सीय लक्ष्य पर विचार करना चाहिए.
यह सही माता पिता की कोशिका लाइन का चयन करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह सभी बाद के प्रयोगों का आधार है. चयन रणनीतियों नैदानिक प्रासंगिकता के साथ शुरू; यह एक रसायन चिकित्सा और विकिरण भोले सेल लाइन का चयन करने के लिए आवश्यक है। पिछले रसायन चिकित्सा और / या विकिरण उपचार प्रतिरोध रास्ते और दवा प्रतिरोध मार्करों की अभिव्यक्ति के परिवर्तन के परिवर्तन प्रेरित कर सकते हैं. इस अध्ययन में, पीसी-9 कोशिकाओं, EGFR exon 19 में 15 बीपी विलोपन ले जाने, afatinib के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध की स्थापना के लिए कार्यरत हैं. इस सेल लाइन एक जापानी NSCLC रोगी, जो पूर्व रसायन चिकित्सा और विकिरण प्राप्त नहीं किया था से प्राप्त किया गया था.
क्योंकि afatinib मौखिक रूप से एक दैनिक आधार पर प्रशासित किया जाता है, इन विट्रो उपचार में निरंतर, जहां कोशिकाओं afatinib की उपस्थिति में लगातार सुसंस्कृत कर रहे हैं चिकित्सकीय प्रासंगिक होगा. प्रयोग के विभिन्न चरणों में इस्तेमाल दवाओं की खुराक माता पिता की कोशिका चयनित लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. एक cytotoxicity परख एक उपयुक्त दवा रेंज है, जो दवा के फार्माकोकाइनेटिक जानकारी के लिए तुलनीय होना चाहिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चयन प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं की पूरी आबादी को एकल समूह के रूप में बनाए रखा जाता है; क्लोनिंग या अन्य जुदाई तरीकों का उपयोग नहीं कर रहे हैं. कोशिकाओं को पहले लगातार दवा के एक निम्न स्तर को उजागर कर रहे हैं. बाद में, कोशिकाओं को दवा की उपस्थिति में विकसित करने के लिए अनुकूल ित लेने के बाद, दवा की खुराक धीरे-धीरे दवा की अंतिम इष्टतम खुराक के लिए बढ़ जाती है10,11. वैकल्पिक रूप से, एक पल्स दवा प्रशासन या mutagenesis प्रतिरोध कोशिकाओं का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो भी दवा उपचार से पहले प्रदर्शन कर रहे हैं 12,13. दुर्भाग्य से, मामलों में जहां दवा प्रतिरोध विकसित करने में विफल रहता है आम तौर पर रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं. चयन रणनीतियों नैदानिक प्रासंगिक प्रतिरोध के पुनर्निर्माण के लिए कैंसर रोगियों की स्थिति की नकल करने की कोशिश कर के उद्देश्य से विकसित कर रहे हैं. कभी कभी, दवा प्रतिरोध के तंत्र के साथ जुड़े आणविक परिवर्तन की पहचान करने के लिए, एक उच्च दवा एकाग्रता का उपयोग किया जाता है. इस मॉडल को कम चिकित्सकीय प्रासंगिक हो जाता है.
यहाँ, हम पीसी-9 कोशिकाओं से तीन स्वतंत्र afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक विधि का वर्णन EGFR exon 19 में 15 बीपी विलोपन शरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों के प्रारंभिक लक्षण.
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Protocol
1. तीन स्वतंत्र Afatinib प्रतिरोधी पीसी-9 सेल लाइन्स की स्थापना
- पीसी-9 कोशिकाओं के लिए प्रारंभिक afatinib जोखिम एकाग्रता का निर्धारण 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) परख
- विकास माध्यम में संस्कृति पीसी-9 कोशिकाओं भ्रूण गोजातीय सीरम (10%), पेनिसिलिन (100 U/mL), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 डिग्री ग्राम/एमएल) एक सेल संस्कृति में इलाज किया 10 सेमी एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
- विकास माध्यम में 4 x 104 कोशिकाओं/एमएल पर पीसी-9 कोशिकाओं को पुन: स्पंद करें और फिर 96-वेल माइक्रोप्लेट में 50 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से बीज दें। कोशिकाओं की अंतिम सांद्रता 2ण्0 ग 103 कोशिकाओं/50 $L/अच्छी तरह से है। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट।
- विकास माध्यम (50 डिग्री सेल्सियस) वाले कुओं में 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, और 20 डिग्री सेल्सियस के साथ कूपों में afatinib समाधान के 50 $L जोड़ें। अफ़ीनिब की अंतिम मात्रा और सांद्रता क्रमशः 100 डिग्री सेल्सियस और 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, और 10 $M है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 96 एच के लिए 96-वेल प्लेट इनक्यूबेट करें।
- डाई समाधान के 15 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें ) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए और एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट, और फिर solubilization के 100 $L जोड़ें / c10 डिग्री 2 इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
- माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करते हुए 570 एनएम (ओडी570) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें (सामग्री की सारणीदेखें ) 6-12 प्रतिकृति तैयार करें और कम से कम तीन बार प्रयोगों को दोहराएँ।
- सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर काउपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें) रेखांकन एक अर्द्ध लॉग ग्राफ के रूप में इन डेटा साजिश और आईसी50 मूल्य है, जो दवा एकाग्रता है कि अपनी अधिकतम के 50% के लिए प्रतिक्रिया कम कर देता है की गणना करने के लिए (सामग्री की तालिका देखें ).
- तीन स्वतंत्र 10 सेमी व्यंजन में stepwise खुराक वृद्धि द्वारा अपरिवर्तनीय EGFR-TKI, afatinib करने के लिए पीसी-9 कोशिकाओं के सतत जोखिम
- विकास माध्यम के 10 एमएल युक्त p100 व्यंजन में संस्कृति पीसी-9 कोशिकाओं. जब पीसी-9 कोशिकाओं उप-अनुकूल चरण तक पहुँचने, तीन नए p100 व्यंजन में सेल निलंबन के 1 एमएल हस्तांतरण, विकास के माध्यम के 9 एमएल के साथ. 1:10 पतला पीसी-9 कोशिकाओं 3-4 दिनों में उप-संप्रवाह हो जाते हैं, लगभग 4-5 x 105 कोशिकाओं की एक सेल संख्या के साथ /
- अगले दिन, तीन p100 व्यंजनों में से प्रत्येक में afatinib के आईसी50 मूल्य के 1/
नोट: Afatinib 1 $M, 10 डिग्री सेल्सियस, 100 डिग्री एम, 1 मीटर, और 5 मीटर के स्टॉक सांद्रता पर DMSO में पुनर्गठन किया गया है। आवश्यक अंतिम सांद्रता के अनुसार, संस्कृति में 10 एमएल विकास माध्यम में 1 से 10 डिग्री सेल्सियस एफ़ाटिनिब-समाधान जोड़ा जाता है। - जब afatinib युक्त p100 व्यंजन में कोशिकाओं उप-confluent हो जाते हैं, एक 1 एमएल पिपेट के साथ आकांक्षा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और एक नया p100 डिश में ताजा विकास मध्यम के 9 एमएल करने के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें. इसके बाद, नई संस्कृति में अफ़ीनिब की 10-20% उच्च सांद्रता जोड़ें।
- 10-12 महीनों की अवधि में प्रत्येक चरण में एफ़थाटिनिब एकाग्रता में 10-20% की वृद्धि के साथ चरणवार खुराक वृद्धि द्वारा माध्यम में 0.1 एनएम की afatinib एकाग्रता में वृद्धि हुई है।
नोट: जब अतातिब सांद्रता आईसी50 मान तक पहुँचती है, तो कोशिका वृद्धि काफी धीमी हो जाती है। यदि कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं 1:9, वे विकसित नहीं हो सकता है, के रूप में इन कोशिकाओं afatinib की उच्च सांद्रता द्वारा मारे जाते हैं. इसलिए, उच्च afanitib सांद्रता पर, कोशिकाओं के अनुपात में विभाजित किया जा सकता है 1:2. सबसे प्रतिरोधी कोशिकाओं afatinib निहित माध्यम में 3-14 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे, और मध्यम प्रतिरोधी कोशिकाओं को पारित करने की जरूरत है जब तक नहीं बदला गया था. - 1 $M afatinib युक्त विकास माध्यम में 2-3 महीने के लिए afatinib प्रतिरोधी कोशिकाओं संस्कृति. 1 डिग्री सेल्सियस की एक afatinib एकाग्रता में, 10-12 महीने इस मॉडल में afatinib के लिए प्रतिरोध विकसित करने के लिए आवश्यक हैं. यह पुष्टि करने के लिए एमटीटी परख करें कि कोशिकाएं अफातिब के प्रतिरोधी हैं। तीन स्वतंत्र रूप से स्थापित afatinib प्रतिरोध सेल लाइनों AFR1, AFR2, और AFR3 नाम थे.
2. तीन स्वतंत्र Afatinib प्रतिरोधी कोशिकाओं की विशेषता
- माता पिता पीसी-9 कोशिकाओं के विकास वक्र का निर्धारण और afatinib प्रतिरोधी कोशिकाओं की स्थापना
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में विकास माध्यम में पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं संस्कृति।
- वृद्धि माध्यम के साथ 5 x 103 कोशिकाओं/एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और बीज 100 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से 96-वेल माइक्रोप्लेट में, ताकि कोशिकाओं की अंतिम सांद्रता 500 कोशिकाओं/100 $L/अच्छी तरह से हो।
नोट: MTT परख 0, 1, 2, 3, 5, और 7 दिनों में OD570 मानों को मापने के लिए किया जाता है। प्रत्येक दिन के लिए छह 96-वेल माइक्रोप्लेट की आवश्यकता होती है। - MTT परख हर 24 ज और फिर दिन 0, 1, 2, 3, 5, और 7 पर प्रदर्शन करें। OD570 मूल्यों को मापने और 6-12 प्रतिकृति तैयार; प्रयोगों को कम से कम तीन बार दोहराएँ, और रेखांकन एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणाम साजिश (सामग्री की तालिकादेखें).
- वास्तविक समय पीसीआर द्वारा EGFR में जीनोमिक डीएनए परिवर्तन की पहचान
नोट: अफातिब एक छोटा सा अणु अवरोधक है जो ईजीएफआर टायरोसिन काइनेज को लक्षित करता है। EGFR अभिव्यक्ति की स्थिति डीएनए और प्रोटीन के स्तर पर निर्धारित किया जाता है.- जीनोमिक डीएनए एक डीएनए शोधन किट का उपयोग कर अलग है (सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों का पालन. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ पृथक जीनोमिक डीएनए की सांद्रता को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें ) और सभी जीनोमिक डीएनए नमूनों को 25 एनजी/
- जीनोमिक डीएनए के 50 एनजी को बढ़ाना, जो 25 एनजी/जेडएल स्टॉक के 2 डिग्री एल के बराबर है, एक SYBR ग्रीन मास्टर मिश्रण का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) और एक फ्लोरोसेंट-आधारित आरटी-पीसीआर-डिटेक्शन प्रणाली का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
नोट: पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति 20 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम के साथ शुरू हुई, इसके बाद 3 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस विकृतीकरण के 40 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस अनेलिंग। विशिष्ट प्राइमर सेट इस प्रकार हैं: ईजीएफआर एफ: 5"-CAAGGCCATCTGTGTGTCA-3], R: 5]-CTGGAATGAGGAGGA-3]। सामान्यीकरण जीन लाइन-1 एफ: 5"-AAAGCCCTCAACTACATGG-3], R: 5[TGCTtGAATGCGCCCAGAG-3]।
- पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा EGFR स्तर पर प्रोटीन परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन
- 24 ज. वॉश पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं के लिए प्रयोगों से पहले लगातार afatinib के साथ कोशिकाओं का इलाज करें और फिर उन्हें afatinib बिना विकास मीडिया में बीज. पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं को 5 एमएल बर्फ ठंडा पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
- आरआईपीए बफर में कोशिकाओं को 1% प्रोटीज़ इनहिबिटर कॉकटेल (सामग्री की तालिकादेखें ) और फॉस्फेटेस अवरोधक कॉकटेल II और III (सामग्री की तालिकादेखें ) और इस समाधान को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 100 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर और साफ lysates इकट्ठा।
- Bicinchoninic एसिड परख का उपयोग कर प्रोटीन सांद्रता निर्धारित (सामग्री की तालिकादेखें), सभी प्रोटीन नमूनों को समायोजित करने के लिए 0.5 या 1 $g/ 5 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर फोड़ा, इन प्रोटीन नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण नहीं किया जाता है।
- प्रोटीन के नमूनों की समान मात्रा को अलग करें, अधिमानतः 20-30 डिग्री सेल्सियस, 8% एसडीएस-पृष्ठ द्वारा और प्रोटीन को पॉलीविनाइलीडेन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें।
नोट: सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीऐक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) आमतौर पर उनके आणविक वजन के आधार पर प्रोटीन की जुदाई के लिए प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है।- इथेनॉल के साथ कांच की प्लेटों को साफ करें और कांच की प्लेट और स्पेसर्स को इकट्ठा करें। 1.5 एम Tris-HCl, पीएच 8.8, 40% बिस्-acrylamide, 10% एसडीएस, 10% एपीएस, और TEMED युक्त 8% पाली-acrylamide जैल तैयार करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पॉलिमराइज़ करें।
- बाद में, 0.5 एम Tris-HCl, पीएच 6.8, 40% बिस-acrylamide, 10% एसडीएस, 10% एपीएस, और TEMED युक्त एक स्टैकिंग जेल तैयार करते हैं। स्टैकिंग जेल समाधान जोड़ें, कंघी डालने, और कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए जेल बहुलक.
- इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण में जैल रखें और बफर चलाने के साथ टैंक को भरें (0.25 एम ट्रिस, 1.92 एम ग्लिसिन, और 1% एसडीएस)। प्रोटीन के नमूनों की बराबर राशि लोड (20-30 $L) और 180 V. पर जेल चलाने के इलेक्ट्रोफोरोसिस बंद करो एक बार डाई सामने जेल से बाहर बहती है, लगभग 60 मिनट के बाद.
- टीबीएसटी के साथ 1-2 मिनट के लिए जेल को धोएं और फिर प्रोटीन को पीवीडीएफ झिल्ली पर अर्द्ध-सूखी ब्लॉटिंग द्वारा स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें ) 300 लेकिन की निरंतर धारा में 1.5 एच के लिए।
- nonfat शुष्क दूध के 5% के साथ झिल्ली ब्लॉक (सामग्री की तालिकादेखें) TBST समाधान के साथ पतला (सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए, और फिर विरोधी EGFR के साथ झिल्ली की जांच, विरोधी phospho-EGFR (Y1068), विरोधी HER2, एंटी-HER3, एंटी-एमईटी, और एंटी-एक्टिन एंटीबॉडी (टीबीएसटी में 1:3,000) (सामग्री की तालिकादेखें) रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- 10 मिनट के लिए तीन बार TBST के साथ झिल्ली धो लें, और फिर कमरे के तापमान पर 1-1.5 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (टीबीएसटी में 1:200 पतला) के लिए झिल्ली को बेनकाब करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए TBST के साथ पांच बार झिल्ली धो, उन्हें ईसीएल समाधान को बेनकाब (सामग्री की तालिकादेखें), और फिल्मों का उपयोग कर संकेतों कल्पना.
- अनुक्रमण द्वारा EGFR उत्परिवर्तनों का विश्लेषण
- EGFR exons 19-21 के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग जीनोमिक डीएनए बढ़ाना. पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम के साथ शुरू होती है, इसके बाद 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 30 चक्र, 30 के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर annealing, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार।
नोट: EGFR exon 19 के लिए विशिष्ट प्राइमर: F: 5"-GCAATCAGCCTTAGGTGCGCCTC-3] R: 5]-CATAGAAGTGAATTAGGTGGTG-3], Exon 20: F: 5[-CCATGAGTACGTTTGAAACTC-3], R: 5]-CATATCCCATGGCAAACTCTGC-3], और एक्सऑन 21: F: 5"-ATGACATGACTGAATTCGG-3, R: 5]- GCTCACCCAGAATGTGGA-3]. - एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों को शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें) और amplicons अनुक्रम।
- EGFR exons 19-21 के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग जीनोमिक डीएनए बढ़ाना. पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम के साथ शुरू होती है, इसके बाद 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 30 चक्र, 30 के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर annealing, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार।
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Representative Results
चरणवार खुराक-वृद्धि प्रक्रिया का उपयोग करते हुए पीसी-9 कोशिकाओं से तीन अतातिब-प्रतिरोध सेल लाइनों की स्थापना के लिए स्कीमा चित्र 1में दर्शाया गया है। चित्रा 2 माता पिता का पीसी-9 कोशिकाओं के सेल प्रसार में कमी से पता चलता है के रूप में afatinib की एकाग्रता बढ़ जाती है, यह दर्शाता है कि पीसी-9 कोशिकाओं afatinib जोखिम के प्रति संवेदनशील हैं. चित्र 3 तीन कोशिका रेखाओं के अतातिब-प्रतिरोध को दर्शाता है। तीन afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों में से कोई भी, AFR1, AFR2, और AFR3, afatinib जोखिम के तहत सेल प्रसार के दमन दिखाया. चित्र 4 पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं के लिए सेल प्रसार घटता दिखाता है. तीन afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों माता पिता पीसी-9 कोशिकाओं की तुलना में काफी धीमी वृद्धि का प्रदर्शन किया. चित्रा 5 पीसी-9 में EGFR gDNA की अभिव्यक्ति के स्तर और तीन afatinib प्रतिरोधी कोशिकाओं से पता चलता है, जो संकेत मिलता है कि afatinib प्रतिरोधी कोशिकाओं माता पिता के पीसी-9 कोशिकाओं की तुलना में EGFR gDNA के काफी उच्च स्तर व्यक्त की. चित्र 6 पीसी-9 और afatinib-प्रतिरोधी कोशिकाओं में EGFR के प्रोटीन अभिव्यक्ति से पता चलता है. तुलनीय gDNA अभिव्यक्ति के स्तर पर, EGFR प्रोटीन अभिव्यक्ति माता पिता का पीसी-9 कोशिकाओं की तुलना में प्रतिरोधी कोशिकाओं में अधिक था. चित्र 7 से पता चलता है कि EGFR exons के अनुक्रमण परिणाम 19 और 20 पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं में. पीसी-9 कोशिकाओं EGFR exon 19 में 15 बीपी विलोपन दिखाया और 20 exon में जंगली प्रकार EGFR. हालांकि, AFR1 और AFR2 कोशिकाओं जंगली प्रकार EGFR exon 19 के प्रवर्धन का प्रदर्शन किया. AFR3 कोशिकाओं EGFR exon में 15 बीपी विलोपन निहित 19 पीसी-9 कोशिकाओं में के रूप में, लेकिन बिंदु उत्परिवर्तन T790M EGFR exon 20 में मनाया गया था.
चित्र 1 : पीसी-9 से तीन afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल की प्रक्रिया की स्कीमा. सबसे पहले, पीसी-9 कोशिकाओं को तीन p100 व्यंजनों में विभाजित किया गया और आईसी50 मूल्य के 1/10 पर afatinib को उजागर किया गया. इसके बाद, विकास माध्यम में afatinib सांद्रता चरणवार खुराक वृद्धि से 1 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ गए थे। 10-12 महीने के बाद, तीन स्वतंत्र afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों की स्थापना की और AFR1, AFR2, और AFR3 नाम थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : माता पिता पीसी-9 कोशिकाओं अपरिवर्तनीय EGFR TKI, afatinib के प्रति संवेदनशील हैं. कोशिकाओं को 2 x 103 कोशिकाओं/वेल/50 डिग्री एल वृद्धि माध्यम पर 96-वेल माइक्रोप्लेट में बीजित किया गया था, और रात भर preincubated किया गया था। कोशिकाओं 96 एच के लिए afatinib के संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया. एक MTT परख किया गया था, OD570 मूल्यों एक microplate पाठक का उपयोग कर मापा गया (सामग्री की तालिकादेखें) और नियंत्रण कोशिकाओं के लिए प्राप्त मूल्य के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की. डेटा को माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है - 6-12 प्रतिकृति कुओं से मूल्यों का SEM। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : स्थापित कोशिकाओं अपरिवर्तनीय EGFR TKI, afatinib के लिए प्रतिरोध का प्रदर्शन किया. कोशिकाओं को 2 x 103 कोशिकाओं/वेल/50 डिग्री एल वृद्धि माध्यम पर 96-वेल माइक्रोप्लेट में बीजित किया गया था और रात भर प्रीइन्क्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं 96 एच के लिए afatinib के संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया. एक MTT परख किया गया था, OD570 मूल्यों एक microplate पाठक का उपयोग कर मापा गया (सामग्री की तालिकादेखें) और नियंत्रण कोशिकाओं के लिए प्राप्त मूल्य के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की. डेटा को माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है - 6-12 प्रतिकृति कुओं से मूल्यों का SEM। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : Afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों माता पिता पीसी-9 कोशिकाओं की तुलना में धीमी प्रसार दिखाया. कोशिकाओं को 5 x 102 कोशिकाओं/100 डिग्री एल/वेल पर 96-वेल माइक्रोप्लेट्स में बीजित किया गया था। MTT परख किया गया था, और OD570 मान दिन 0, 1, 2, 3, 5, और 7 पर मापा गया एक microplate पाठक का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) और नियंत्रण कोशिकाओं के लिए प्राप्त मूल्य के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया. डेटा को माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है - 6-12 प्रतिकृति कुओं से मूल्यों का SEM। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : EGFR की जीन कॉपी संख्या afatinib प्रतिरोधी कोशिकाओं में ऊंचा किया गया था. EGFR जीन प्रतिलिपि संख्या की ऊंचाई पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं से अलग जीनोमिक डीएनए की मात्रात्मक पीसीआर द्वारा मापा गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : ईजीएफआर प्रोटीन का बेसल स्तर अफाटिनिब-प्रतिरोधी कोशिकाओं में बढ़ा था। फॉस्फो-EGFR, EGFR, HER2, HER3, और पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 कोशिकाओं में एमईटी अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. जेड-Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7 : डीएनए अनुक्रम EGFR exons 19 और 20 में पढ़ता है. पीसी-9, AFR1, AFR2, और AFR3 के जीनोमिक डीएनए EGFR exon 19 और 21 के लिए विशिष्ट प्राइमर के साथ परिलक्षित किया गया था और अनुक्रमण के लिए शुद्ध. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ, हम तीन स्वतंत्र afatinib प्रतिरोधी सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक विधि का वर्णन किया और माता पिता का पीसी-9 कोशिकाओं की तुलना में इन कोशिकाओं की विशेषता. चरणवार खुराक वृद्धि जोखिम द्वारा, माता पिता का पीसी-9 कोशिकाओं 10-12 महीने की अवधि में afatinib के लिए प्रतिरोध का अधिग्रहण किया. चिकित्सकीय, EGFR TKIs के लिए प्रतिरोध तंत्र विषम हैं, और इसलिए, afatinib के साथ प्रारंभिक उपचार के बाद, पीसी-9 कोशिकाओं को तीन स्वतंत्र p100 व्यंजनों में विभाजित किया गया और आगे afatinib को उजागर किया गया. शुरू में, सेल विकास काफी धीमा नहीं था, लेकिन दवा एकाग्रता आईसी50 मूल्य से संपर्क के रूप में, सेल प्रसार धीमा था. यह inhibitors के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के साथ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. proliferating कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए और 1:10 या 1:5 के अनुपात में नए p100 व्यंजनों को स्थानांतरित. जब पीसी-9 कोशिकाओं एक p100 पकवान में सुसंस्कृत थे, कुछ पालन मनाया गया था, लेकिन ज्यादातर कोशिकाओं निलंबन में वृद्धि हुई. के रूप में afatinib की एकाग्रता में वृद्धि हुई थी, कोशिकाओं ऊतक संस्कृति के नीचे का पालन किया व्यंजन इलाज किया. यदि अधिकांश कोशिकाएं अनुलग्न हैं, तो उन्हें सेल-स्क्रेपर से अलग किया जा सकता है। अफ़ीटिनिब की अंतिम सांद्रता 1 डिग्री सेल्सियस थी, जो अधिकतम सीरम सांद्रता (सीअधिकतम)14से लगभग 5 गुना है। माता पिता और प्रतिरोध क्लोन के बीच स्पष्ट मतभेद प्राप्त करने के लिए, अंतिम एकाग्रता सीअधिकतमसे अधिक होने के लिए निर्धारित किया गया था।
प्रक्रिया के दौरान एक गंभीर चिंता जीवाणु संदूषण है, भले ही RPMI-1640 पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है। इससे बचने के लिए, कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं जब ताजा विकास माध्यम युक्त दो p100 व्यंजन तैयार किया जा सकता है. जब कोशिकाएं उप-प्रवाही अवस्था तक पहुँचती हैं, तो एक p100 डिश में कोशिकाओं को और विभाजित किया जा सकता है, जबकि अन्य p100 डिश की कोशिकाओं को क्रायोप्रेक्षण माध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें) एक बैकअप के रूप में, जैसे कि यदि एक पंक्ति दूषित हो , संग्रहीत लाइन का उपयोग किया जा सकता है.
यह पूरी तरह से सेल संस्कृति का उपयोग कर मनुष्यों में afatinib प्रतिरोध के अधिग्रहण को पुन: पेश करने के लिए मुश्किल होगा. EGFR exon 20 में T790M उत्परिवर्तन के उद्भव afatinib के लिए प्रतिरोध का प्रमुख कारण के रूप में सूचित किया गया था. हमारी रिपोर्ट में, एक प्रतिरोधी क्लोन T790M उत्परिवर्तन11निहित. इसके अलावा, जंगली प्रकार EGFR में वृद्धि, जैसे AFR1 और AFR2 कोशिकाओं में, हमारे और अन्य समूहों द्वारा सूचित किया गया है15,16. ईजीएफआर उत्परिवर्तन की हानि और जंगली प्रकार ईजीएफआर में वृद्धि भी ईजीएफआर-टीकेआई 17,18के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध वाले रोगियों के नैदानिक नमूनों में सूचित की जाती है. इसलिए, हमारे वर्तमान मॉडल के इन विट्रो अध्ययनों में अधिग्रहीत प्रतिरोध के साथ नैदानिक नमूनों की आणविक प्रोफाइल को प्रतिबिंबित कर सकते हैं.
यह चरणवार खुराक वृद्धि विधि प्राप्त प्रतिरोधी कोशिकाओं लाइनों प्राप्त करने के लिए सबसे विश्वसनीय माना जाता है. हालांकि, सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रारंभिक उच्च खुराक afatinib जोखिम की संभावना बेहतर कैंसर के साथ रोगियों में afatinib उपचार के प्रभाव को प्रतिबिंबित करेगा, हालांकि प्रतिरोधी कोशिकाओं की स्थापना और अधिक कठिन है. न केवल चल सेल लाइनों, जैसे PC-9 लेकिन यह भी adherent सेल लाइनों, जैसे HCC827, 11-18, या HCC4006, इस विधि के लिए नियोजित किया जा सकता है। यह stepwise खुराक वृद्धि विधि भी अन्य inhibitors के लिए प्रतिरोधी क्लोन स्थापित करने के लिए उपयोगी है, अन्य सेल लाइनों का उपयोग कर, कैंसर के अन्य प्रकार का प्रतिनिधित्व.
म्यूटाजेनिक एजेंटों के लिए माता-पिता की कोशिकाओं के एक्सपोजर, जैसे एन-एथिल-एन-नाइटोसौरिया, इसके बाद अफातिब या ओसिमर्टिनिब उपचार के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं के चयन के बाद प्रतिरोधी क्लोन 19 के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम करने के लिए सूचित किया गया है ,20. हालांकि, इस कृत्रिम विधि विशिष्ट आधार प्रतिस्थापन, जैसे GC AT संक्रमण और AT करने के लिए TA ट्रांसवर्शन के लिए कारण हो जाता है। इसके अलावा, एनएससीएलसी वाले रोगियों में ईजीएफआर टीकेआई एक म्यूटाजेनिक एजेंट नहीं है। इसलिए, stepwise खुराक वृद्धि की विधि mutagenic एजेंटों का उपयोग करने से अधिक प्रतिनिधि है.
हालांकि EGFR TKIs शुरू में प्रभावी रहे हैं, कोशिकाओं को अंततः इस तरह के एकल लक्ष्य दवाओं के लिए प्रतिरोध का विकास, यह मुश्किल कैंसर का इलाज करने के लिए कर रही है. कई अणुओं को लक्षित करने वाले अवरोधक इसलिए विकसित करने के लिए आवश्यक हैं। इस उद्देश्य के लिए, बहु-लक्ष्य अवरोधकों के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के साथ कोशिकाओं को प्राप्त करना और दवा प्रतिरोध अंतर्निहित तंत्र का मूल्यांकन करना आवश्यक है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम अंग्रेजी भाषा संपादन के साथ उनकी सहायता के लिए उनके विचारशील टिप्पणी और संपादन के लिए उन्नत कैंसर अनुवाद अनुसंधान संस्थान के सदस्य धन्यवाद. यह काम जेएसपीएस KAKENHI (अनुदान संख्या: 16K09590 से T.Y.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
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