Summary
En metode til at etablere afatinib-resistens cellelinjer fra lunge adenokarcinom PC-9 celler blev udviklet, og resistente celler blev karakteriseret. De resistente celler kan bruges til at undersøge epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinase hæmmer-resistensmekanismer, der gælder for patienter med ikke-småcellet lungekræft.
Abstract
Erhvervet resistens over for molekylære målhæmmere er et alvorligt problem i kræftbehandling. Lungekræft er fortsat den hyppigste årsag til kræft relateret død i de fleste lande. Opdagelsen af "oncogenic driver mutationer", såsom epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)-aktiverende mutationer, og efterfølgende udvikling af molekylære målrettede agenter af EGFR Tyrosinkinasehæmmere (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib) har i de seneste årtier dramatisk ændret lungekræft behandling. Men, disse lægemidler er stadig ikke effektiv hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) transporterer EGFR-aktiverende mutationer. Efter erhvervet resistens er den systemiske progression af NSCLC fortsat en væsentlig hindring for behandling af patienter med EGFR-mutation-positiv NSCLC. Her præsenterer vi en trinvis dosisoptrapning metode til etablering af tre uafhængige erhvervede afatinib-resistente cellelinjer fra NSCLC PC-9 celler husly EGFR-aktiverende mutationer af 15-base par sletninger i EGFR exon 19. Metoder til karakterisering af de tre uafhængige afatinib-resistens cellelinjer præsenteres kortvarigt. De erhvervede resistensmekanismer til EGFR TKIs er heterogene. Derfor skal flere cellelinjer med erhvervet resistens over for EGFR-TKIs undersøges. Ti til tolv måneder er forpligtet til at opnå cellelinjer med erhvervet resistens ved hjælp af denne trinvise dosisoptrapning tilgang. Opdagelsen af nye erhvervede resistensmekanismer vil bidrage til udviklingen af mere effektive og sikre terapeutiske strategier.
Introduction
Fem tyrosinkinasehæmmere, der er rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), herunder Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib, er i øjeblikket tilgængelige til behandling af patienter med EGFR-mutation-positiv ikke-småcellet lunge kræft (NSCLC). I løbet af det seneste årti har terapier for sådanne patienter gennemgået en dramatisk udvikling med opdagelsen af nye potentielle EGFR-TKIs. Blandt patienter med lungeadenokarcinom er somatiske mutationer i EGFR identificeret hos ca. 50% af de asiatiske og 15% af de kaukasiske patienter1. De mest almindeligt forekommende mutationer i EGFR er en L858R point mutation i EGFR exon 21 og 15 base pair (BP) sletninger i EGFR exon 192. Hos EGFR-mutation-positive patienter med NSCLC forbedrer EGFR-TKIs responsraterne og de kliniske resultater sammenlignet med den tidligere platin-dobbelt-Doublet-kemoterapi3.
Gefitinib og erlotinib var de første godkendte små molekyle inhibitorer og omtales almindeligvis som første generations-EGFR-TKIs. Disse EGFR TKIs blokere tyrosinkinase aktivitet ved at konkurrere med ATP og reversibelt binding til ATP bindingssteder4. Afatinib er en anden generation af EGFR TKI, som uigenkaldeligt og kovalent binder sig til EGFR 's tyrosinkinase-domæne og er karakteriseret som en pan-menneskelig EGFR-familie hæmmer5.
På trods af den dramatiske fordel af disse terapier hos patienter med NSCLC, erhvervet resistens er uundgåelig. Den mest almindeligt modstands mekanisme mod første-og andengenerations EGFR tkis er fremkomsten af T790M-mutationen i EGFR exon 20, som er til stede i 50-70% af tumor prøverne6,7,8. Andre resistensmekanismer omfatter bypass-signaler (til at opfylde, IGF1R, og HER2), omdannelse til småcellet lungekræft, og induktion af epitel-til-mesenchymal overgang, som forekommer præklinisk og klinisk9. Resistensmekanismerne til EGFR TKIs er heterogene. Ved at identificere nye resistensmekanismer i prækliniske undersøgelser, det kan være muligt at udvikle nye Therapeutics at overvinde resistens. Optimale sekvens terapier, der maksimerer den kliniske fordel for patienter skal overveje resistensmekanismer og terapeutiske mål.
Det er bydende nødvendigt at vælge den rigtige forældre cellelinje, da det er grundlaget for alle de efterfølgende eksperimenter. Udvælgelses strategierne begynder med klinisk relevans; Det er nødvendigt at vælge en kemoterapi og stråling naive cellelinje. Tidligere kemoterapeutisk og/eller strålebehandling kan medføre ændring af resistens veje og ændringer i ekspression af resistensmarkører. I denne undersøgelse anvendes PC-9-celler, der transporterer 15 BP-sletninger i EGFR exon 19, til etablering af erhvervet resistens over for afatinib. Denne cellelinje blev afledt af en japansk NSCLC patient, der ikke fik tidligere kemoterapi og stråling.
Da afatinib administreres oralt på daglig basis, vil kontinuerlig in vitro-behandling, hvor cellerne konstant dyrkes i nærværelse af afatinib, være klinisk relevante. Den dosis af lægemidler, der anvendes i de forskellige trin af eksperimentet, skal optimeres for den valgte forældre cellelinje. En cytotoksicitet analyse kan anvendes til bestemmelse af et egnet stof område, som bør være sammenlignelig med de farmakokinetiske oplysninger af lægemidlet.
Under hele udvælgelsesprocessen opretholdes hele populationen af celler som en enkelt gruppe. kloning eller andre separations metoder anvendes ikke. Cellerne er først kontinuerligt udsat for et lavt niveau af lægemidlet. Efterfølgende, når cellerne tilpasse sig til at vokse i nærværelse af stoffet, dosis af lægemidlet er langsomt steget til den endelige optimale dosis af lægemidlet10,11. Alternativt kan en puls Drug-Administration eller mutagenese anvendes til udvælgelse af resistens celler, som også udføres før behandling med lægemidler 12,13. Desværre er tilfælde, hvor lægemiddelresistens ikke udvikler, generelt ikke indberettet. Udvælgelses strategierne er udviklet med det formål at forsøge at efterligne betingelserne for kræftpatienter til genopbygning af klinisk relevant resistens. Nogle gange, for at identificere molekylære ændringer i forbindelse med mekanismer af lægemiddelresistens, en høj stof koncentration anvendes. Denne model bliver mindre klinisk relevant.
Her beskriver vi en metode til at etablere tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer fra PC-9-celler, der harkedeligt 15 BP-sletninger i EGFR exon 19 samt den indledende karakterisering af de afatinib-resistente cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. etablering af tre uafhængige Afatinib-resistente PC-9 cellelinjer
- Bestemmelse af den initiale eksponeringskoncentration afatinib for PC-9-celler ved hjælp af 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse
- Kultur PC-9 celler i vækstmedium indeholdende føtal kvægserum (10%), penicillin (100 U/mL), og streptomycin (100 μg/mL) i en celle-kultur behandlet 10 cm parabol i en 5% CO2 inkubator ved 37 °c.
- Resuspendere PC-9 celler ved 4 x 104 celler/ml i vækstmedium og derefter frø på 50 μl/brønd i en 96-brønd mikropladen. Den endelige koncentration af celler er 2,0 x 103 celler/50 μl/brønd. Inkubér natten over i en 5% CO2 kubator ved 37 °c.
- Der tilsættes 50 μL afatinib-opløsning ved forskellige koncentrationer: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 og 20 μM til brøndene med vækstmediet (50 μL). Afatinibs endelige volumen og koncentrationer er henholdsvis 100 μL og 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 og 10 μM.
- Inkubér 96-brønd pladen for 96 h i en 5% CO2 -inkubator ved 37 °c.
- Der tilsættes 15 μL af farveopløsningen (Se tabel over materialer) til hver brønd og Inkubér i 4 timer i en 5% Co2 -inkubator ved 37 °c, og tilsæt derefter 100 μl solubilization/stop-opløsning (Se tabel over materialer) til hver brønd og Inkubér natten over i en 5% Co < C10 > 2 inkubator ved 37 °c.
- Måle den optiske tæthed ved 570 nm (OD570) ved hjælp af en mikroplade læser (Se tabel over materialer). Forbered 6-12 replikater og Gentag eksperimenterne mindst tre gange.
- Brug statistisk software (Se tabel over materialer) til grafisk at afbilde disse data som en semi-log graf og beregne IC50 værdi, som er den Drug koncentration, der reducerer respons på 50% af dens maksimum (Se tabel over materialer ).
- Kontinuerlig eksponering af PC-9-celler til den irreversible EGFR-TKI, afatinib, ved trinvis dosisoptrapning i tre uafhængige 10 cm retter
- Kultur PC-9 celler i P100 retter indeholdende 10 mL vækstmedium. Når PC-9-cellerne når sub-confluent-stadiet, overføres 1 mL cellesuspension til tre nye P100 retter med 9 mL vækstmedium. De 1:10 fortyndede PC-9-celler bliver sub-confluent i 3-4 dage med et celle nummer på ca. 4-5 x 105 celler/ml.
- Næste dag tilsættes 1/10 af IC50 -værdien af afatinib til hver af de tre P100 retter.
Bemærk: Afatinib rekonstitueres i DMSO ved lager koncentrationer på 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM og 5 mM. 1 til 10 μL afatinib-opløsning tilsættes 10 mL vækstmedium i kulturen i forhold til de påkrævede endelige koncentrationer. - Når cellerne i de afatinib-holdige P100 retter bliver sub-confluent, blandes godt ved aspiration med en 1 mL pipette og tilsættes 1 mL af cellesuspensionen til 9 mL frisk vækstmedium i en ny P100 skål. Dernæst tilsættes 10-20% højere koncentrationer af afatinib til den nye kultur.
- Afatinib-koncentrationen på 0,1 nM øges til 1 μM i mediet ved trinvis Dosisøgning med afatinibkoncentrationen forhøjet med 10-20% ved hvert trin i perioden på 10-12 måneder.
Bemærk: Når koncentrationen af afatinib nærmer sig IC50 -værdien, bliver cellevæksten ret langsom. Hvis cellerne opdeles i 1:9, kan de ikke vokse, da disse celler dræbes af højere koncentrationer af afatinib. Derfor kan cellerne ved højere afanitib-koncentrationer opdeles i et forhold på 1:2. De mest resistente celler blev dyrket i afatinib-indeholdt medium for 3-14 dage, og mediet blev ikke ændret, før de resistente celler skulle være passaged. - Kultur de afatinib-resistente celler i 2-3 måneder i 1 μM afatinib-indeholdende vækstmedium. Ved en afatinib-koncentration på 1 μM kræves der 10-12 måneder til at udvikle resistens over for afatinib i denne model. Udfør MTT-analysen for at bekræfte, at cellerne er resistente over for afatinib. De tre selvstændigt etablerede afatinib modstands cellelinjer blev navnet AFR1, AFR2 og AFR3.
2. karakterisering af tre uafhængige Afatinib-resistente celler
- Bestemmelse af vækstkurven for forældre PC-9 celler og etablering af afatinib-resistente celler
- Kultur PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3 celler i vækstmedium i en 5% CO2 inkubator ved 37 °c.
- Resuspension cellerne ved 5 x 103 celler/ml med vækstmedium, og frø 100 μl/brønd ind i en 96-brønd mikropladen, således at den endelige koncentration af celler er 500 celler/100 μl/brønd.
Bemærk: MTT-analysen udføres for at måle OD570 -værdierne ved 0, 1, 2, 3, 5 og 7 dage. 6 96-der kræves et godt mikrotallerkener til hver dag. - Udfør MTT-analysen hver 24 h og derefter på dage 0, 1, 2, 3, 5 og 7. Måle OD570 værdier og forberede 6-12 replikater; Gentag eksperimenterne mindst tre gange, og Afbild resultaterne grafisk ved hjælp af en statistisk software (Se tabel over materialer).
- Identifikation af genomiske DNA-ændringer i EGFR ved real-time PCR
Bemærk: Afatinib er en lille molekyle hæmmer, der er rettet mod EGFR tyrosinkinase. EGFR-udtryks statussen bestemmes ved DNA-og protein niveauerne.- Genomisk DNA isoleres ved hjælp af et DNA-rensningsudstyr (Se tabel over materialer) efter fabrikantens anvisninger. Koncentrationen af det isolerede genomiske DNA måles med et spektrofotometer (Se tabel over materialer), og alle GENOMISKE DNA-prøver justeres til 25 ng/μl.
- Amplify 50 ng af genomisk DNA, som svarer til 2 μL af de 25 ng/μL bestande, ved hjælp af en SYBR grøn Master Mix (Se tabel over materialer) og analysere resultaterne ved hjælp af en fluorescens-baseret RT-PCR-detektion system (Se tabel over materialer).
Bemærk: PCR cykling betingelser begyndte med en indledende denaturering trin ved 95 °c for 20 s, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 °c denaturering for 3 s, 60 °c udglødning for 30 s. De specifikke primer sæt er som følger: EGFR F: 5 ′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3 ′, R: 5 ′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3 ′. Normalisering gen linje-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
- Vurdering af virkningen af protein ændringer på EGFR-niveau ved Western blot-analyse
- Behandl cellerne med afatinib kontinuerligt før forsøg i 24 timer. vask PC-9-, AFR1-, AFR2-og AFR3-cellerne to gange med PBS, og frø dem derefter i vækstmedier uden afatinib. Vask PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3 celler to gange med 5 mL iskold PBS.
- Cellerne i RIPA buffer indeholdende 1% proteasehæmmer cocktail (Se tabel over materialer) og FOSFATASEHÆMMER cocktail II og III (Se tabel over materialer) og inkubere denne opløsning ved 4 °c i 30 min. centrifuger lysaterne i 10 min. ved 100 x g og 4 °c og opsamles de ryddede lysater.
- Bestem protein koncentrationerne ved hjælp af bicinchoninsyre-analysen (Se tabel over materialer), Juster alle protein prøver til 0,5 eller 1 μg/μl ved hjælp af 4X prøve buffer (500 mm tris (pH 6,8), 40% glycerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromphenolblåt blå) og kog ved 96 °C i 5 min. Opbevar disse protein prøver ved-80 °C, indtil der udføres Western blot-analyse.
- Der adskilles lige store mængder protein prøver, fortrinsvis 20-30 μL, med 8% SDS-side, og proteinerne overføres til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
Bemærk: Natriumdodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side) er almindeligt anvendt i laboratoriet til adskillelse af proteiner baseret på deres molekylvægt.- Rengør glaspladerne med ethanol og saml glaspladen og spacerne. Forbered 8% poly-acrylamid geler indeholdende 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% bis-acrylamid, 10% SDS, 10% APS, og TEMED. Polymeriserer i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Derefter forberede en stabling gel indeholdende 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrylamid, 10% SDS, 10% APS, og TEMED. Tilsæt stabel gel opløsningen, Indsæt kammen og polymeriserer gelen i 20-30 min ved stuetemperatur.
- Anbring geler i elektroforese-apparatet og fyld beholderen med løbe buffer (0,25 M Tris, 1,92 M Glycin og 1% SDS). Læg lige store mængde protein prøver (20-30 μL) og Kør gelen ved 180 V. stop elektroforese, når farvestoffet foran strømmer ud af gelen, efter ca. 60 min.
- Gelen vaskes i 1-2 min med TBST, hvorefter proteinerne overføres til en PVDF-membran ved hjælp af semi-Dry-blotting (Se tabel over materialer) for 1,5 h ved en konstant strøm på 300 ma.
- Bloker membranerne med 5% fedtfri mælk (Se tabel over materialer) fortyndet med tbst opløsning (Se tabel over materialer) i 1 time ved stuetemperatur, og sonde derefter membranerne med anti-EGFR, anti-phospho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET, og anti-actin antistoffer (fortyndet 1:3000 i TBST) (Se tabel over materialer) ved 4 °c natten over.
- Membranerne vaskes med TBST tre gange i 10 minutter, hvorefter membranerne eksponerer for det sekundære antistof (fortyndet 1:200 i TBST) i 1-1,5 timer ved stuetemperatur. Skyl membranerne fem gange med TBST i 10 minutter ved stuetemperatur, Udsæt dem til ECL-opløsningen (Se tabel over materialer), og Visualiser signalerne ved hjælp af film.
- Analyse af EGFR-mutationer ved sekvensering
- Amplificere genomisk DNA ved hjælp af specifikke primere til EGFR exons 19-21. PCR-cykelforholdene begynder med et indledende Denaturerings trin ved 94 °C i 1 min, efterfulgt af 30 cyklusser af denaturering ved 98 °C i 10 s, udglødning ved 55 °C i 30 s og forlængelse ved 72 °C i 1 min.
Bemærk: De specifikke primere for EGFR exon 19: F: 5 ′-gcaatatcagccttaggtgcggctc-3 ′ R: 5 ′-catagaaagtgaacatttaggatgtg-3 ′, eXoN 20: F: 5 ′-ccatgagtacgtattttgaaactc-3 ′, R: 5 ′-catatccccatggcaaactcttgc-3 ′, og exon 21: F: 5 ′-atgaacatgaccctgaattcgg-3 ′, R: 5 ′- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3 ′. - Rens de forstærkede PCR-produkter ved hjælp af et PCR-rensningsudstyr (Se tabel over materialer) og sekvens af amplicons.
- Amplificere genomisk DNA ved hjælp af specifikke primere til EGFR exons 19-21. PCR-cykelforholdene begynder med et indledende Denaturerings trin ved 94 °C i 1 min, efterfulgt af 30 cyklusser af denaturering ved 98 °C i 10 s, udglødning ved 55 °C i 30 s og forlængelse ved 72 °C i 1 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skemaet til oprettelse af tre afatinib-modstands cellelinjer fra PC-9-celler ved hjælp af en trinvis dosis eskaleringsprocedure er vist i figur 1. Figur 2 viser et fald i celle spredningen i forældrenes PC-9-celler, da koncentrationen af afatinib øges, hvilket indikerer, at PC-9-celler er følsomme over for afatinib-eksponeringen. Figur 3 viser afatinibresistens for de tre cellelinjer. Ingen af de tre afatinib-resistente cellelinjer, AFR1, AFR2 og AFR3, viste undertrykkelse af celle proliferation under eksponering af afatinib. Figur 4 viser celle sprednings kurverne for PC-9-, AFR1-, AFR2-og AFR3-cellerne. De tre afatinib-resistente cellelinjer udviste markant langsommere vækst end de forældre baserede PC-9-celler. Figur 5 viser ekspressions niveauerne for EGFR GDNA i PC-9 og de tre afatinib-resistente celler, hvilket indikerer, at afatinib-resistente celler udtrykte signifikant højere niveauer af EGFR gDNA end forældre-PC-9-cellerne. Figur 6 viser protein ekspression af EGFR i PC-9 og afatinib-resistente celler. Ved sammenlignelige gDNA-udtryks niveauer var EGFR-protein ekspression højere i resistente celler end i forældre-PC-9-celler. Figur 7 viser, at sekvensering resultater af EGFR exons 19 og 20 i PC-9, AFR1, AFR2, og AFR3 celler. PC-9-celler viste 15 BP sletninger i EGFR exon 19 og Wild-type EGFR i exon 20. Men, AFR1 og AFR2 celler udstillet forstærkning af vildtype EGFR exon 19. AFR3 celler indeholdt 15 BP sletninger i EGFR exon 19 som i PC-9 celler, men punkt mutation T790M blev observeret i EGFR exon 20.
Figur 1 : Skema for den proces, der anvendes til at etablere tre afatinib-resistente cellelinjer fra PC-9. Først blev PC-9-celler opdelt i tre P100 retter og eksponeret for afatinib ved 1/10 af IC50 værdien. Dernæst blev koncentrationerne af afatinib i vækstmediet forøget med trinvis Dosisøgning til 1 μM. Efter 10-12 måneder blev der etableret tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer, som blev AFR1, AFR2 og AFR3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Forældre-PC-9-celler er følsomme over for den irreversible EGFR TKI, afatinib. Celler blev seedet i en 96-brønd mikroplade ved 2 x 103 celler/godt/50 μl af vækstmedium, og præinkuberet natten over. Cellerne blev behandlet med de angivne koncentrationer af afatinib i 96 h. Der blev udført en MTT-analyse, blev OD570 -værdierne målt ved hjælp af en mikroplade læser (Se tabel over materialer) og udtrykt som en procentdel af den værdi, der blev opnået for kontrol cellerne. Data præsenteres som middel ± SEM af værdier fra 6-12 replikat brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Etablerede celler udviste resistens over for irreversibel EGFR TKI, afatinib. Celler blev seedet i en 96-brønd mikroplade ved 2 x 103 celler/godt/50 μl af vækstmedium og præinkuberet natten over. Cellerne blev behandlet med de angivne koncentrationer af afatinib i 96 h. Der blev udført en MTT-analyse, blev OD570 -værdierne målt ved hjælp af en mikroplade læser (Se tabel over materialer) og udtrykt som en procentdel af den værdi, der blev opnået for kontrol cellerne. Data præsenteres som middel ± SEM af værdier fra 6-12 replikat brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Afatinib-resistente cellelinjer viste langsommere spredning end FORÆLDRENES PC-9 celler. Celler blev seedet i 96-brønd mikroplader ved 5 x 102 celler/100 μl/brønd. MTT-assay blev udført, og OD570 -værdier blev målt på dag 0, 1, 2, 3, 5 og 7 ved hjælp af en mikroplade læser (Se tabel over materialer) og udtrykt som en procentdel af den værdi, der opnås for kontrol cellerne. Data præsenteres som middel ± SEM af værdier fra 6-12 replikat brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Genkopierings antallet af EGFR blev forhøjet i afatinib-resistente celler. Højden af EGFR-genkopierings nummeret blev målt ved kvantitativ PCR af genomisk DNA isoleret fra PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3 celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Basal niveau af EGFR-protein blev forhøjet i afatinib-resistente celler. Western blot analyse af phospho-EGFR, EGFR, HER2, HER3, og MET udtryk i PC-9, AFR1, AFR2, og AFR3 celler. β-actin blev brugt som læsse kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : DNA-sekvens læser i EGFR exons 19 og 20. Genomisk DNA fra PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3 blev forstærket med specifikke primere for EGFR exon 19 og 21 og renset for sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en metode til etablering af tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer og karakteriserede disse celler i forhold til forældre-PC-9-celler. Ved trinvise dosiseskalerende eksponering erhvervede de forældre baserede PC-9-celler resistens over for afatinib i en periode på 10-12 måneder. Klinisk, resistensmekanismerne til EGFR TKIs er heterogene, og derfor, efter den indledende behandling med afatinib, PC-9 celler blev opdelt i tre uafhængige P100 retter og eksponeret yderligere for afatinib. I første omgang, cellevækst var ikke væsentligt bremset, men da narkotika koncentrationen nærmede sig IC50 værdi, celle spredning blev bremset. Dette er et kritisk skridt for at opnå celler med erhvervet resistens over for inhibitorer. De prolifererende celler skal opdeles og overføres til nye P100 retter i et forhold på 1:10 eller 1:5. Når PC-9 celler blev dyrket i en P100 skål, nogle overholdelse blev observeret, men de fleste celler voksede i suspension. Da koncentrationen af afatinib blev forøget, blev cellerne overholdt til bunden af de behandlede retter af vævs kulturen. Hvis de fleste celler er klæber, kan de løsnes med en celle skraber. Den endelige koncentration af afatinib var 1 μM, hvilket er ca. 5 gange den maksimale serumkoncentration (CMax)14. For at opnå klare forskelle mellem forældre-og modstands kloner blev den endelige koncentration sat til at være højere end CMax.
En alvorlig bekymring under proceduren er bakteriel kontaminering, selv om RPMI-1640 indeholder penicillin og streptomycin. For at undgå dette, to P100 retter, der indeholder frisk vækstmedium kan forberedes, når cellerne er opdelt. Når cellerne når sub-confluent-stadiet, kan cellerne i en P100 skål opdeles yderligere, mens cellerne i den anden P100 skål kan opbevares ved-80 °C i kryopreserverings mediet (Se tabel over materialer) som en sikkerhedskopi, således at hvis en linje er forurenet , kan den lagrede linje bruges.
Det ville være vanskeligt fuldstændigt at reproducere erhvervelsen af afatinibresistens hos mennesker ved hjælp af cellekultur. Fremkomsten af T790M-mutationen i EGFR exon 20 blev rapporteret som den dominerende årsag til resistens over for afatinib. I vores rapport indeholdt en resistent klon T790M mutation11. Desuden er stigningen i vildtype EGFR, såsom i AFR1 og AFR2 celler, blevet rapporteret af os og andre grupper15,16. Tabet af EGFR-mutationen og stigningen i vildtype EGFR rapporteres også i kliniske prøver fra patienter med erhvervet resistens over for EGFR-tkis 17,18. Derfor kan in vitro-undersøgelser af vores nuværende model afspejle de molekylære profiler af kliniske prøver med erhvervet resistens.
Denne trinvise dosis eskalerings metode betragtes som den mest pålidelige for at opnå erhvervede resistente celler linjer. Den initiale højdosis afatinib-eksponering i dyrkede celler vil sandsynligvis bedre afspejle virkningerne af afatinib-behandling hos patienter med kræft, selv om det er vanskeligere at etablere resistente celler. Ikke kun flydende cellelinjer, såsom PC-9, men også overholder cellelinjer, såsom HCC827, 11-18, eller HCC4006, kan anvendes til denne metode. Denne trinvise dosis eskalerings metode er også nyttig til at etablere kloner resistente over for andre hæmmere, ved hjælp af andre cellelinjer, der repræsenterer andre typer af kræft.
Eksponering af forældre celler for mutagene stoffer, såsom n-ethyl-n-nitrosourea, efterfulgt af selektion af celler, som er resistente over for afatinib eller osimertinib-behandling, er blevet rapporteret for at muliggøre hurtig erhvervelse af resistente kloner 19 ,20. Men denne kunstige metode har tendens til at forårsage specifikke base erstatninger, såsom GC til ved overgange og til TA transversioner. Desuden er EGFR TKI ikke en mutagent agens hos patienter med NSCLC. Derfor er metoden til trinvis dosisoptrapning mere repræsentativ end anvendelse af mutagene stoffer.
Selv EGFR TKIs er i første omgang effektive, celler i sidste ende udvikle resistens over for sådanne enkelt-mål narkotika, hvilket gør det vanskeligt at helbrede kræft. Hæmmere, der er målrettet mod flere molekyler, er derfor afgørende at udvikle. Til dette formål er det nødvendigt at opnå celler med erhvervet resistens over for multi-Target-hæmmere og evaluere de mekanismer, der ligger til grund for lægemiddelresistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmet af Advanced Cancer translationelle Research Institute for deres tankevækkende kommentarer og Editage for deres hjælp med engelsk sprog redigering. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (tilskudsnummer: 16K09590 til T.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
