Summary
En metod för att fastställa afatinib-resistens cellinjer från lung adenocarcinom PC-9 celler utvecklades, och resistenta celler karakteriserades. De resistenta cellerna kan användas för att undersöka epidermal tillväxtfaktorreceptor tyrosinkinashämmare-resistensmekanismer, gäller för patienter med icke-småcellig lungcancer.
Abstract
Förvärvad resistens mot molekylära mål hämmare är ett allvarligt problem i cancerbehandling. Lung cancer är fortfarande den vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i de flesta länder. Upptäckten av "onkogen driver mutationer," såsom epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR)-aktiverande mutationer, och efterföljande utveckling av molekylära riktade medel av EGFR tyrosinkinashämmare (tkis) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib och osimertinib) har dramatiskt förändrat lungcancer behandlingen under de senaste decennierna. Emellertid, dessa läkemedel är fortfarande inte effektiva hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) redovisade EGFR-aktiverande mutationer. Efter förvärvad resistens är den systemiska progressionen av NSCLC fortfarande ett betydande hinder vid behandling av patienter med EGFR-mutationspositiv NSCLC. Här presenterar vi en stegvis dos upptrappnings metod för att etablera tre oberoende förvärvade afatinib-resistenta cellinjer från NSCLC PC-9-celler som hartråkigt EGFR-aktiverande mutationer av 15-bas par borttagningar i EGFR exon 19. Metoder för att karakterisera de tre oberoende cellinjer med afatinib-resistens presenteras kortfattat. De förvärvade Resistensmekanismerna till EGFR TKIs är heterogena. Därför måste flera cellinjer med förvärvad resistens mot EGFR-TKIs undersökas. Tio till tolv månader krävs för att få cellinjer med förvärvad resistens med hjälp av denna stegvis dosupptrappning metod. Upptäckten av nya mekanismer för förvärvad resistens kommer att bidra till att utveckla effektivare och säkrare terapeutiska strategier.
Introduction
Fem tyrosinkinashämmare, riktade mot epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), inklusive gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib och osimertinib är för närvarande tillgängliga för behandling av patienter med EGFR-mutationspositiva icke-småcellig lung cancer (NSCLC). Under det senaste decenniet har terapier för sådana patienter genomgått en dramatisk utveckling med upptäckten av nya potentiella EGFR-TKIs. Bland patienter med lungadenocarcinom, identifieras somatiska mutationer i EGFR hos cirka 50% av Asiaten och 15% av kaukasiska patienter1. De vanligaste mutationer i EGFR är en L858R punktmutation i EGFR exon 21 och 15 bas par (BP) borttagningar i EGFR exon 192. Hos EGFR-mutationspositiva patienter med NSCLC förbättrar EGFR-TKIs responsfrekvensen och de kliniska resultaten jämfört med den tidigare standarden på platina-Doublet kemoterapi3.
Gefitinib och erlotinib var de första godkända småmolekylära hämmare och kallas i allmänhet för första generationens EGFR TKIs. Dessa EGFR TKIs blockerar tyrosinkinas aktivitet genom att konkurrera med ATP och reversibelt bindning till ATP bindningsställen4. Afatinib är en andra generationens EGFR TKI som oåterkalleligt och kovalent binder till tyrosinkinasdomänen av EGFR och karaktäriseras som en pan-Human EGFR-familjehämmare5.
Trots den dramatiska nyttan av dessa terapier hos patienter med NSCLC, förvärvad resistens är oundviklig. Den vanligaste resistensmekanismen mot första och andra generationens EGFR-tkis är uppkomsten av T790M-mutationen i EGFR exon 20, som finns i 50-70% av tumörproverna6,7,8. Andra resistensmekanismer inkluderar bypass-signaler (till MET, IGF1R, och HER2), omvandling till småcellig lungcancer, och induktion av epitelial till mesenkymala övergång, som inträffar prekliniskt och kliniskt9. Resistensmekanismerna till EGFR TKIs är heterogena. Genom att identifiera nya resistensmekanismer i prekliniska studier kan det vara möjligt att utveckla nya Therapeutics för att övervinna resistens. Optimala sekvens terapier som maximerar den kliniska nyttan för patienter måste överväga resistensmekanismer och terapeutiska mål.
Det är absolut nödvändigt att välja rätt föräldra cell linje, eftersom det är grunden för alla efterföljande experiment. Urvals strategierna inleds med klinisk relevans; Det är nödvändigt att välja en kemoterapi och strålning naiva cellinjer. Tidigare kemoterapeutiska och/eller strålningsbehandling kan inducera förändringen av resistens vägar och förändringar av uttrycket av läkemedelsresistens markörer. I denna studie, PC-9 celler, transporterar 15 BP borttagningar i EGFR exon 19, är anställda för etablering av förvärvad resistens mot afatinib. Denna cell linje härstammar från en japansk NSCLC patient, som inte fick tidigare kemoterapi och strålning.
Eftersom afatinib administreras oralt på daglig basis, kontinuerlig in vitro-behandling, där cellerna odlas ständigt i närvaro av afatinib skulle vara kliniskt relevant. Dosen av läkemedel som används i de olika stegen i experimentet måste optimeras för den valda föräldra cellen. En cytotoxicitetstest kan användas för att bestämma ett lämpligt läkemedels område, som bör vara jämförbar med den farmakokinetiska informationen av drogen.
Hela urvalsprocessen bibehålls hela populationen av celler som en enda grupp; kloning eller andra separationsmetoder används inte. Cellerna är först kontinuerligt utsätts för en låg nivå av drogen. Därefter, efter att cellerna anpassar sig för att växa i närvaro av drogen, dosen av drogen ökas långsamt till den slutliga optimala dosen av drogen10,11. Alternativt kan en puls läkemedelsadministrering eller mutagenes användas för att välja motstånds celler, som också utförs före läkemedelsbehandling 12,13. Tyvärr, fall där läkemedelsresistens inte utvecklas är i allmänhet inte rapporteras. Urvals strategierna utvecklas i syfte att försöka efterlikna cancer patienternas tillstånd för att återuppbygga kliniskt relevant resistens. Ibland, för att identifiera molekylära förändringar i samband med mekanismer för läkemedelsresistens, en hög läkemedelskoncentration används. Denna modell blir mindre kliniskt relevant.
Här beskriver vi en metod för att etablera tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer från PC-9-celler som hartråkigt 15 BP-borttagningar i EGFR exon 19 samt den initiala karakteriseringen av afatinib-resistenta cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. upprättande av tre oberoende afatinib-resistenta PC-9-cellinjer
- Bestämning av den initiala exponeringskoncentrationen av afatinib för PC-9-celler med hjälp av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys
- Kultur PC-9 celler i tillväxtmedium som innehåller fetalt Nötkreaturserum (10%), penicillin (100 U/mL), och streptomycin (100 μg/mL) i en cell-kultur behandlas 10-cm skålen i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c.
- Resuspend PC-9 celler på 4 x 104 celler/ml i odlingssubstrat och sedan utsäde på 50 μl/brunn i en 96-väl mikroplatta. Den slutliga koncentrationen av celler är 2,0 x 103 celler/50 μl/brunn. Inkubera över natten i en 5% CO2 -inkubator vid 37 ° c.
- Tillsätt 50 μL afatinib-lösning vid olika koncentrationer: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 och 20 μM till brunnarna som innehåller odlingsmediet (50 μL). Den slutliga volymen och koncentrationerna av afatinib är 100 μL och 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 respektive 10 μM.
- Inkubera 96-brunnen plattan för 96 h i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c.
- Tillsätt 15 μL av färglösningen (se tabell över material) till varje brunn och inkubera i 4 timmar i en 5% Co2 -inkubator vid 37 ° c, och tillsätt sedan 100 μl solubilization/stopp-lösning (se tabell över material) till varje brunn och inkubera över natten i en 5% Co < C10 > 2 inkubator vid 37 ° c.
- Mät den optiska densiteten vid 570 nm (OD570) med hjälp av en mikroplattläsare (se tabell över material). Förbered 6-12 replikat och upprepa experimenten minst tre gånger.
- Använd statistisk programvara (se tabell över material) för att grafiskt Rita dessa data som en semi-log graf och beräkna IC50 värde, vilket är den läkemedelskoncentration som minskar svaret till 50% av dess maximala (se tabell över material ).
- Kontinuerlig exponering av PC-9-celler till irreversibel EGFR-TKI, afatinib, genom stegvis dosökning i tre oberoende 10 cm rätter
- Culture PC-9 celler i P100 rätter som innehåller 10 mL odlingssubstrat. När PC-9-celler når sub-konflytande skede, överföra 1 mL cellsuspension i tre nya P100 rätter, med 9 mL av odlingssubstrat. Den 1:10 utspädda PC-9 celler blir sub-confluent i 3-4 dagar, med ett cell nummer av cirka 4-5 x 105 celler/ml.
- På nästa dag, tillsätt 1/10 av IC50 värdet av afatinib i var och en av de tre P100 rätter.
Anmärkning: Afatinib bereds i DMSO vid lagerkoncentrationer på 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM och 5 mM. 1 till 10 μL afatinib-lösning tillsätts i 10 mL odlingssubstrat i kulturen, enligt de slutliga koncentrationerna som krävs. - När cellerna i afatinib-innehållande P100 rätter blir sub-confluent, blanda väl genom aspiration med en 1 mL pipett och tillsätt 1 mL av cellsuspensionen till 9 mL färskt odlingsmedium i en ny P100 maträtt. Tillsätt sedan 10-20% högre koncentrationer av afatinib till den nya kulturen.
- Öka afatinib-koncentrationen på 0,1 nM till 1 μM på mediet med stegvis dosökning med afatinib-koncentrationen ökade med 10-20% vid varje steg under perioden 10-12 månader.
Anmärkning: När afatinib koncentrationen närmar sig IC50 värde, celltillväxt blir ganska långsam. Om cellerna är uppdelade 1:9, de får inte växa, eftersom dessa celler dödas av högre koncentrationer av afatinib. Därför, vid högre afanitib koncentrationer, cellerna kan delas i ett förhållande av 1:2. De mest resistenta cellerna odlades i afatinib-inneslutna medium för 3-14 dagar, och mediet ändrades inte förrän de resistenta cellerna behövde passaged. - Odla de afatinib-resistenta cellerna i 2-3 månader i 1 μM afatinib-innehållande odlingssubstrat. Vid en afatinib-koncentration på 1 μM krävs 10-12 månader för att utveckla resistens mot afatinib i denna modell. Utför MTT-analysen för att bekräfta att cellerna är resistenta mot afatinib. De tre självständigt etablerade afatinib-resistenscellinjer fick namnet AFR1, AFR2 och AFR3.
2. karakterisering av tre oberoende afatinib-resistenta celler
- Bestämning av tillväxtkurvan för föräldra PC-9-celler och etablering av afatinib-resistenta celler
- Kultur PC-9, AFR1, AFR2, och AFR3 celler i tillväxtmedium i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c.
- Omsuspendera cellerna vid 5 x 103 celler/ml med odlingssubstrat, och utsäde 100 μl/brunn i en 96-väl mikroplatta, så att den slutliga koncentrationen av celler är 500 celler/100 μl/brunn.
Anmärkning: MTT-analysen utförs för att mäta OD570 -värdena vid 0, 1, 2, 3, 5 och 7 dagar. 6 96-Tja mikroplattor krävs för varje dag. - Utför MTT-analysen varje 24 h och sedan på dag 0, 1, 2, 3, 5 och 7. Mät OD570 -värdena och Förbered 6-12 replikat; Upprepa experimenten minst tre gånger, och grafiskt Rita resultaten med hjälp av en statistisk programvara (se tabell över material).
- Identifiering av genomiska DNA-förändringar i EGFR genom realtids PCR
Anmärkning: Afatinib är en liten molekyl hämmare som riktar EGFR-tyrosinkinas. EGFR-uttryckets status bestäms på DNA-och proteinnivåerna.- Genomiskt DNA isoleras med hjälp av ett DNA-renings Kit (se tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar. Mät koncentrationen av det isolerade genomiskt DNA med en spektrofotometer (se tabell över material) och justera alla genomiska DNA-prover till 25 ng/μl.
- Amplifiera 50 ng av genomiskt DNA, vilket motsvarar 2 μL av de 25 ng/μL lagren, med hjälp av en SYBR grön Master Mix (se tabell över material) och analysera resultaten med hjälp av en Fluorescence-baserade RT-PCR-Detection System (se tabell över material).
Anmärkning: PCR cykel förhållanden började med en initial denaturering steg vid 95 ° c för 20 s, följt av 40 cykler av 95 ° c denaturering för 3 s, 60 ° c glödgning för 30 s. De specifika primer-uppsättningarna är följande: EGFR F: 5 ′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3 ′, R: 5 ′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3 ′. Normalisering Gene LINE-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
- Utvärdering av effekten av protein förändringar på EGFR-nivå genom Western blot-analys
- Behandla cellerna med afatinib kontinuerligt före experiment för 24 h. Tvätta PC-9, AFR1, AFR2, och AFR3 celler två gånger med PBS och sedan utsäde dem i tillväxt medier utan afatinib. Tvätta PC-9, AFR1, AFR2 och AFR3 celler två gånger med 5 mL iskall PBS.
- Lyse cellerna i Ripa buffert som innehåller 1% proteashämmare cocktail (se tabell över material) och fosfatas hämmare cocktail II och III (se tabell över material) och inkubera denna lösning vid 4 ° c i 30 min. Centrifugera lysaterna i 10 min vid 100 x g och 4 ° c och samla de rensade lysaterna.
- Bestäm proteinkoncentrationer med hjälp av och Acid-analysen (se tabell över material), justera alla proteinprover till 0,5 eller 1 μg/μl med hjälp av 4x-provbuffert (500 mm tris (pH 6,8), 40% glycerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromfenolblått) och koka vid 96 ° c i 5 min. Förvara dessa proteinprover vid-80 ° c tills västerländsk blot-analys utförs.
- Separera lika mängder av proteinprover, företrädesvis 20-30 μL, med 8% SDS-Page och överför proteinerna till ett polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
Anmärkning: Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) används ofta i labbet för separation av proteiner baserat på deras molekylvikt.- Rengör glasplattorna med etanol och montera glasplattan och distanarna. Förbered 8% Poly-akrylamidgeler som innehåller 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% BIS-akrylamid, 10% SDS, 10% APS och TEMED. Polymerisera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Bered därefter en Staplings gel som innehåller 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% BIS-akrylamid, 10% SDS, 10% APS och TEMED. Tillsätt den stapling gellösningen, sätt i kam, och polymerisera gelen för 20-30 min vid rumstemperatur.
- Placera gelerna i elektrofores-apparaten och fyll tanken med löpbuffert (0,25 M Tris, 1,92 M glycin och 1% SDS). Ladda lika mycket protein prov (20-30 μL) och kör gelen vid 180 V. stoppa elektrofores när färgen framsidan rinner ut ur gelen, efter cirka 60 min.
- Tvätta gelen i 1-2 min med TBST och överför sedan proteinerna vidare till ett PVDF-membran genom halvtorr blotting (se tabell över material) för 1,5 h vid en konstant ström på 300 mA.
- Blockera membranen med 5% av nonfat torrmjölk (se tabell över material) utspädd med tbst lösning (se tabell över material) för 1 h vid rumstemperatur, och sedan sond membranen med anti-EGFR, anti-Phospho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET, och anti-Actin antikroppar (utspädd 1:3000 i TBST) (se tabell över material) vid 4 ° c över natten.
- Tvätta membranen med TBST tre gånger i 10 min, och sedan utsätta membranen till den sekundära antikroppen (utspädd 1:200 i TBST) för 1-1.5 h vid rumstemperatur. Tvätta membranen fem gånger med TBST i 10 min vid rumstemperatur, exponera dem för ECL-lösningen (se tabell över material) och visualisera signalerna med hjälp av filmer.
- Analys av EGFR-mutationer genom sekvensering
- Förstärka genomisk DNA med specifika primers för EGFR exonerna 19-21. PCR-cyklingförhållandena inleds med ett initialt denatureringssteg vid 94 ° c i 1 min, följt av 30 cykler denaturering vid 98 ° c i 10 s, glödgning vid 55 ° c i 30 s och förlängning vid 72 ° c i 1 min.
Anmärkning: De specifika primers för EGFR exon 19: F: 5 ′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3 ′ R: 5 ′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3 ′, exon 20: F: 5 ′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3 ′, R: 5 ′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3 ′ och exon 21: F: 5 ′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3 ′, R: 5 ′- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3 ′. - Rena de förstärkta PCR-produkterna med hjälp av ett PCR-renings Kit (se tabell över material) och sekvensera amplicons.
- Förstärka genomisk DNA med specifika primers för EGFR exonerna 19-21. PCR-cyklingförhållandena inleds med ett initialt denatureringssteg vid 94 ° c i 1 min, följt av 30 cykler denaturering vid 98 ° c i 10 s, glödgning vid 55 ° c i 30 s och förlängning vid 72 ° c i 1 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemat för att etablera tre afatinib-resistenscellinjer från PC-9-celler med hjälp av en stegvis dos öknings procedur visas i figur 1. Figur 2 visar en minskning av cellproliferation av föräldrarnas PC-9-celler eftersom koncentrationen av afatinib ökar, vilket indikerar att PC-9-celler är känsliga för exponering av afatinib. Figur 3 visar afatinib-motståndet hos de tre cellinjer. Ingen av de tre afatinib-resistenta cellinjer, AFR1, AFR2, och AFR3, visade dämpning av cellproliferation under afatinib exponering. Figur 4 visar cell spridnings KURVOR för PC-9-, AFR1-, AFR2-och AFR3-celler. De tre afatinib-resistenta cellinjer uppvisade betydligt långsammare tillväxt än föräldrarnas PC-9-celler. Figur 5 visar uttrycksnivåerna för EGFR gDNA i PC-9 och de tre afatinib-resistenta cellerna, vilket tyder på att afatinib-resistenta celler uttryckte signifikant högre halter av EGFR gDNA än föräldrarnas PC-9-celler. Figur 6 visar proteinuttrycket av EGFR i PC-9-och afatinib-resistenta celler. Vid jämförbara gDNA-uttrycksnivåer var EGFR-proteinuttryck högre i resistenta celler än i föräldra PC-9-celler. Figur 7 visar att sekvensering resultaten av EGFR exonerna 19 och 20 i PC-9, AFR1, AFR2, och AFR3 celler. PC-9 celler visade 15 BP borttagningar i EGFR exon 19 och vildtyp EGFR i exon 20. Emellertid uppvisade AFR1 och AFR2 celler amplifiering av Wild-Type EGFR exon 19. AFR3 celler innehöll 15 BP borttagningar i EGFR exon 19 som i PC-9-celler, men punktmutation T790M observerades i EGFR exon 20.
Figur 1 : Schema för den process som används för att etablera tre afatinib-resistenta cellinjer från PC-9. Först, PC-9 celler var separerade i tre P100 rätter och utsätts för afatinib på 1/10 av IC50 värde. Därefter ökade afatinib-koncentrationerna i tillväxt mediet med stegvis dosökning till 1 μM. Efter 10-12 månader, tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer fastställdes och namngavs AFR1, AFR2, och AFR3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Föräldra PC-9-celler är känsliga för irreversibel EGFR TKI, afatinib. Celler var seedade i en 96-väl mikroplatta vid 2 x 103 celler/väl/50 μl av tillväxtmedium, och förinkuberas över natten. Cellerna behandlades med de indikerade koncentrationerna av afatinib för 96 h. En MTT-analys utfördes, OD570 -värden mättes med hjälp av en mikroplattläsare (se tabell över material) och uttrycks som en procentandel av det värde som erhålls för kontroll cellerna. Data presenteras som medelvärdet ± SEM av värden från 6-12 replikat brunnar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Etablerade celler uppvisade resistens mot irreversibel EGFR TKI, afatinib. Celler var seedade i en 96-väl mikroplatta vid 2 x 103 celler/väl/50 μl av tillväxtmedium och förinkuberas över natten. Cellerna behandlades med de indikerade koncentrationerna av afatinib för 96 h. En MTT-analys utfördes, OD570 -värden mättes med hjälp av en mikroplattläsare (se tabell över material) och uttrycks som en procentandel av det värde som erhålls för kontroll cellerna. Data presenteras som medelvärdet ± SEM av värden från 6-12 replikat brunnar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Afatinib-resistenta cellinjer visade långsammare proliferation än FÖRÄLDRARNAS PC-9-celler. Celler var seedade i 96-väl mikroplattor vid 5 x 102 celler/100 μl/brunn. MTT-analysen utfördes, och OD570 -värdena mättes på dag 0, 1, 2, 3, 5 och 7 med hjälp av en mikroplattläsare (se tabell över material) och uttrycks som en procentandel av det värde som erhålls för kontroll cellerna. Data presenteras som medelvärdet ± SEM av värden från 6-12 replikat brunnar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Gen kopians antal av EGFR höjdes i afatinib-resistenta celler. Höjden av EGFR-genkopieringsnumret mättes genom kvantitativ PCR av genomiskt DNA isolerat från PC-9-, AFR1-, AFR2-och AFR3-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Basal nivå av EGFR-protein ökade i afatinib-resistenta celler. Western blot-analys av fosho-EGFR, EGFR, HER2, HER3 och MET-uttryck i PC-9-, AFR1-, AFR2-och AFR3-celler. β-Actin användes som lastnings kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : DNA-sekvens läser i EGFR exonerna 19 och 20. Genomiskt DNA av PC-9, AFR1, AFR2, och AFR3 förstärkallades med specifika primers för EGFR exon 19 och 21, och renade för sekvensering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi en metod för att etablera tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer och karakteriserade dessa celler i jämförelse med föräldrarnas PC-9-celler. Genom stegvis dos öknings exponering förvärvade föräldra-PC-9-cellerna resistens mot afatinib under en period av 10-12 månader. Kliniskt är Resistensmekanismerna till EGFR TKIs heterogena, och därför, efter den initiala behandlingen med afatinib, var PC-9-celler indelade i tre oberoende P100-rätter och exponerade ytterligare för afatinib. Inledningsvis, celltillväxt var inte signifikant långsammare, men eftersom drogen koncentrationen närmade sig IC50 värde, cellproliferation bromsades. Detta är ett kritiskt steg för att erhålla celler med förvärvad resistens mot hämmare. Den prolifererande celler bör delas upp och överföras till nya P100 rätter på ett förhållande av 1:10 eller 1:5. När PC-9-celler var odlade i en P100 skålen, observerades viss följsamhet, men de flesta celler växte i suspension. Eftersom koncentrationen av afatinib ökades, cellerna följs till botten av vävnaden kultur behandlade rätter. Om de flesta celler är anhängare, kan de vara fristående med en cell-skrapa. Den slutliga koncentrationen av afatinib var 1 μM, vilket är ungefär 5 gånger maximal serumkoncentration (CMax)14. För att få tydliga skillnader mellan föräldra-och motstånds klonerna var den slutliga koncentrationen inställd på att vara högre än CMax.
En allvarlig oro under förfarandet är bakteriell kontaminering, även om RPMI-1640 innehåller penicillin och streptomycin. För att undvika detta, två P100 rätter som innehåller färska odlingssubstrat kan förberedas när cellerna är uppdelade. När cellerna når sub-konflytande skede, kan cellerna i en P100 skålen delas ytterligare, medan cellerna i den andra P100 skålen kan lagras vid-80 ° c i frysförvaring medium (se tabell över material) som en säkerhetskopia, så att om en linje är förorenad kan den lagrade linjen användas.
Det skulle vara svårt att helt reproducera förvärvet av afatinib resistens hos människor med hjälp av cellkultur. Uppkomsten av T790M-mutationen i EGFR exon 20 rapporterades som den dominerande orsaken till resistens mot afatinib. I vår rapport innehöll en resistent klon T790M-mutationen11. Dessutom har ökningen av Wild-Type EGFR, såsom i AFR1 och AFR2 celler, rapporterats av oss och andra grupper15,16. Förlusten av EGFR-mutationen och ökning av vild typ EGFR rapporteras också i kliniska prover från patienter med förvärvad resistens mot EGFR-tkis 17,18. Därför, in vitro-studier av vår nuvarande modell kan återspegla molekylära profiler av kliniska prover med förvärvad resistens.
Denna stegvis dosupptrappning metod anses vara den mest tillförlitliga för att erhålla förvärvade resistenta celler linjer. Emellertid, initial hög dos afatinib exponering i odlade celler skulle sannolikt bättre återspegla effekterna av afatinib behandling hos patienter med cancer, även om upprättande av resistenta celler är svårare. Inte bara flytande cellinjer, såsom PC-9 utan även anhängare cellinjer, såsom HCC827, 11-18, eller HCC4006, kan användas för denna metod. Denna stegvis dosupptrappning metod är också användbart för att fastställa kloner resistenta mot andra hämmare, med hjälp av andra cellinjer, representerar andra typer av cancer.
Exponering av föräldra celler för mutagena ämnen, såsom n-etyl-n-nitrosourea, följt av val av celler som är resistenta mot afatinib eller behandling med osimertinib har rapporterats för att möjliggöra snabbt förvärv av resistenta kloner 19 ,20. Emellertid, denna konstgjorda metod tenderar att orsaka specifika bas ersättningar, såsom GC till vid övergångar och till TA transversioner. Dessutom är EGFR TKI inte ett mutagent medel hos patienter med NSCLC. Därför är metoden för stegvis dosökning mer representativ än att använda mutagena ämnen.
Även om EGFR TKIs initialt är effektiva, utvecklar celler så småningom resistens mot sådana enda mål läkemedel, vilket gör det svårt att bota cancer. Hämmare som riktar sig mot flera molekyler är därför viktiga att utveckla. För detta ändamål är det nödvändigt att få celler med förvärvad resistens mot multi-Target-hämmare och utvärdera mekanismerna bakom läkemedelsresistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar den medlem av Advanced cancer translationella forskningsinstitut för deras tankeväckande kommentarer och Editage för deras hjälp med engelsk språk redigering. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (Grant Number: 16K09590 till T.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
