Summary
En metode for å etablere afatinib-motstand cellelinjer fra lunge adenokarsinom PC-9-celler ble utviklet, og resistente celler ble karakterisert. De resistente cellene kan brukes til å undersøke epidermal vekstfaktorreseptor tyrosin kinase hemmer-motstand mekanismer, gjelder for pasienter med ikke-liten celle lungekreft.
Abstract
Ervervet motstand mot molekylær mål hemmere er et alvorlig problem i kreft terapi. Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i de fleste land. Oppdagelsen av "kreftfremkallende driver mutasjoner", slik som epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR)-aktivering mutasjoner, og påfølgende utvikling av molekylære målrettede agenter for EGFR tyrosin kinase hemmere (TKIs) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib) har dramatisk endret lungekreft behandling de siste ti årene. Men, disse stoffene er fortsatt ikke effektive hos pasienter med ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) bærer EGFR-aktivering mutasjoner. Etter ervervet motstand, er systemisk progresjon av NSCLC fortsatt en betydelig hindring i behandling av pasienter med EGFR mutasjon-positive NSCLC. Her presenterer vi en trinnvis dose opptrapping metode for å etablere tre uavhengige ervervet afatinib-resistente cellelinjer fra NSCLC PC-9 celler harboring EGFR-aktivering mutasjoner av 15-base par slettinger i EGFR ekson 19. Metoder for karakteriserer av de tre uavhengige afatinib cellelinjene presenteres kort. De ervervet motstands mekanismene til EGFR TKIs er heterogene. Derfor må flere cellelinjer med ervervet motstand mot EGFR-TKIs undersøkes. Ti til tolv måneder er nødvendig for å oppnå cellelinjer med ervervet motstand ved hjelp av denne trinnvis dose opptrapping tilnærming. Oppdagelsen av romanen ervervet motstands mekanismer vil bidra til utvikling av mer effektive og trygge terapeutiske strategier.
Introduction
Fem tyrosin kinase hemmere, målretting epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), inkludert Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, og osimertinib er for tiden tilgjengelig for behandling av pasienter med EGFR mutasjon-positive ikke-liten celle lunge kreft (NSCLC). I løpet av det siste tiåret har behandling for slike pasienter gjennomgått dramatisk utvikling med oppdagelsen av nye potensielle EGFR-TKIs. Blant pasienter med lunge adenokarsinom, somatiske mutasjoner i EGFR er identifisert i ca 50% av asiatiske og 15% av kaukasiske pasienter1. De vanligste mutasjoner i EGFR er en L858R punkt mutasjon i EGFR ekson 21 og 15 base pair (BP) slettinger i EGFR ekson 192. I EGFR mutasjon-positive pasienter med NSCLC, EGFR-TKIs forbedre responsrater og kliniske utfall i forhold til den forrige standarden på platina doublet kjemoterapi3.
Gefitinib og erlotinib var de første godkjente små molekyl hemmere og er generelt referert til som første generasjons EGFR TKIs. Disse EGFR TKIs blokkerer tyrosin kinase aktivitet ved å konkurrere med ATP og reverserbart binding til ATP bindings områder4. Afatinib er en andre generasjons EGFR TKI som irreversibelt og covalently binder seg til tyrosin kinase domenet til EGFR og er karakterisert som en pan-menneskelig EGFR familie inhibitor5.
Til tross for Dramatical fordel for disse behandlingene hos pasienter med NSCLC, er ervervet motstand uunngåelig. Den vanligste motstands mekanismen mot første-og andre generasjons EGFR TKIs er fremveksten av den T790M mutasjonen i EGFR ekson 20, som er til stede i 50-70% av tumor prøvene6,7,8. Andre motstands mekanismer inkluderer bypass signaler (til MET, IGF1R, og HER2), transformasjon til liten celle lungekreft, og induksjon av epitel-til-mesenchymal overgang, som oppstår pre-klinisk og klinisk9. Motstands mekanismene til EGFR TKIs er heterogene. Ved å identifisere nye motstands mekanismer i prekliniske studier, kan det være mulig å utvikle nye legemiddel selskap for å overvinne motstand. Optimale sekvens terapier som maksimerer den kliniske ytelsen til pasientene må vurdere motstands mekanismer og terapeutisk mål.
Det er viktig å velge riktig foreldrenes cellelinje, som det er grunnlaget for alle de påfølgende eksperimenter. Utvalgs strategiene begynner med klinisk relevans. Det er nødvendig å velge en kjemoterapi og stråling naiv cellelinje. Tidligere kjemoterapeutiske og/eller strålingspådrivet behandling kan indusere endring av motstands veier og endringer i uttrykket av resistens markører. I denne studien, PC-9-celler, bærer 15 BP slettinger i EGFR ekson 19, er ansatt for etablering av ervervet motstand mot afatinib. Denne cellelinjen ble avledet fra en japansk NSCLC pasient, som ikke fikk tidligere kjemoterapi og stråling.
Fordi afatinib administreres oralt på daglig basis, kontinuerlig in vitro-behandling, der cellene stadig blir kultivert i nærvær av afatinib ville være klinisk relevant. Dosen av legemidler som brukes i de ulike trinnene i eksperimentet, må optimaliseres for at foreldre linjen skal være valgt. En cytotoksisitet analysen kan brukes for å bestemme en passende legemiddel område, som bør være sammenlignbare med den farmakokinetiske informasjonen i stoffet.
Gjennom hele utvelgelsesprosessen opprettholdes hele populasjonen av celler som en enkelt gruppe; kloning eller andre separasjon metoder brukes ikke. Cellene er først kontinuerlig eksponert for et lavt nivå av stoffet. Deretter, etter at cellene tilpasse seg å vokse i nærvær av stoffet, dosen av stoffet er langsomt økt til den endelige optimale dose av stoffet10,11. Alternativt kan en puls medikament administrasjon eller mutagenese brukes for å velge motstands celler, som også utføres før behandling med narkotika 12,13. Dessverre, tilfeller hvor resistens ikke klarer å utvikle er generelt ikke rapportert. Utvalget strategier er utviklet med sikte på å prøve å etterligne forholdene til kreftpasienter for ombygging klinisk relevant motstand. For å identifisere molekylære endringer knyttet til mekanismer for resistens, brukes det noen ganger en høy legemiddelkonsentrasjon. Denne modellen blir mindre klinisk relevant.
Her beskriver vi en metode for å etablere tre uavhengige afatinib cellelinjer fra PC-9-celler harboring 15 BP slettinger i EGFR ekson 19 så vel som den første karakterisering av afatinib-resistente cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. etablering av tre Independent Afatinib-resistente PC-9 Cell Lines
- Bestemmelse av den innledende afatinib eksponerings konsentrasjon for PC-9 celler ved hjelp av 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysen
- Kultur PC-9 celler i vekstmedium som inneholder fosterets storfe serum (10%), penicillin (100 U/mL), og Streptomycin (100 μg/mL) i en celle-kultur behandlet 10 cm parabol i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° c.
- Resuspend PC-9 celler ved 4 x 104 celler/ml i vekstmedium og deretter frø på 50 μL/brønn i en 96-brønn mikroplate. Den endelige konsentrasjonen av celler er 2,0 x 103 celler/50 μL/brønn. Ruge overnatter i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° c.
- Tilsett 50 μL av afatinib oppløsning ved forskjellige konsentrasjoner: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 og 20 μM til brønnene som inneholder vekst mediet (50 μL). Den endelige volum og konsentrasjoner av afatinib er 100 μL og 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 og 10 μM, henholdsvis.
- Ruge den 96-brønn platen for 96 h i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° c.
- Tilsett 15 μL av fargestoff oppløsningen (se tabell av materialer) til hver brønn og ruge for 4 timer i en 5% co2 inkubator ved 37 ° c, og tilsett deretter 100 μL av oppløseliggjøringen/stopp-løsning (se tabell over materialer) til hver brønn og ruge over natten i en 5% co < C10 > 2 inkubator ved 37 ° c.
- Mål den optiske tettheten ved 570 NM (OD570) ved hjelp av en mikroplate leser (se tabell over materialer). Forbered 6-12-replikerer og gjenta forsøkene minst tre ganger.
- Bruk statistisk programvare (se tabell over materialer) til grafisk plotte disse dataene som en semi-loggrafen og beregne IC50 verdi, som er den medikament konsentrasjon som reduserer responsen til 50% av sitt maksimum (se tabell over materialer ).
- Kontinuerlig eksponering av PC-9 celler til irreversible EGFR-TKI, afatinib, ved trinnvis dose eskalering i tre uavhengige 10 cm retter
- Kultur PC-9 celler i P100 retter som inneholder 10 mL vekstmedium. Når PC-9-cellene nå sub-confluent scenen, overføre 1 mL celle suspensjon i tre nye P100 retter, med 9 mL vekstmedium. Den 1:10 utvannet PC-9 celler blir sub-confluent i 3-4 dager, med et celle nummer på ca 4-5 x 105 celler/ml.
- På neste dag, legge til 1/10 av IC50 verdi av afatinib i hver av de tre P100 retter.
Merk: Afatinib er tilberedt i DMSO på lager konsentrasjoner av 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM og 5 mM. 1 til 10 μL av afatinib-oppløsning er lagt inn i 10 mL vekstmedium i kulturen, i henhold til de nødvendige endelige konsentrasjonene. - Når cellene i de afatinib P100 rettene blir sub-confluent, bland godt ved aspirasjon med en 1 mL pipette og tilsett 1 mL av celle suspensjonen til 9 mL fersk vekstmedium i en ny P100 parabolen. Deretter legger 10-20% høyere konsentrasjoner av afatinib til den nye kulturen.
- Øke den afatinib konsentrasjonen av 0,1 nM til 1 μM i mediet ved trinnvis dose eskalering med afatinib konsentrasjon økte med 10-20% ved hvert trinn over perioden på 10-12 måneder.
Merk: Når den afatinib konsentrasjonen nærmer seg IC50 -verdien, blir celleveksten ganske langsom. Hvis cellene er delt 1:9, kan de ikke vokse, da disse cellene blir drept av høyere konsentrasjoner av afatinib. Derfor, ved høyere afanitib konsentrasjoner, kan cellene deles i et forhold på 1:2. De mest motstandsdyktige cellene ble dyrket i afatinib medium for 3-14 dager, og mediet ble ikke endret før de resistente cellene måtte passert. - Kultur afatinib-resistente celler for 2-3 måneder i 1 μM afatinib-inneholdende vekstmedium. Ved en afatinib konsentrasjon på 1 μM er 10-12 måneder nødvendig for å utvikle resistens mot afatinib i denne modellen. Utfør MTT-analysen for å bekrefte at cellene er motstandsdyktige mot afatinib. De tre uavhengig etablerte afatinib motstands cellelinjer ble kalt AFR1, AFR2 og AFR3.
2. karakterisering av tre uavhengige Afatinib-resistente celler
- Fastsettelse av veksten kurve av foreldrenes PC-9 celler og etablering av afatinib-resistente celler
- Kultur PC-9, AFR1, AFR2, og AFR3 celler i vekstmedium i en 5% CO2 inkubator på 37 ° c.
- Resuspend cellene ved 5 x 103 celler/ml med vekstmedium, og frø 100 μL/brønn inn i en 96-brønn mikroplate, slik at den endelige konsentrasjonen av celler er 500 celler/100 μL/well.
Merk: Den MTT analysen er utført for å måle OD570 verdier på 0, 1, 2, 3, 5 og 7 dager. 6 96-brønn mikroplater kreves for hver dag. - Utfør MTT-analysen hver 24 h og deretter på dag 0, 1, 2, 3, 5 og 7. Mål OD570 verdier og forberede 6-12 replikerer; Gjenta forsøkene minst tre ganger, og plott resultatene grafisk ved hjelp av en statistisk programvare (se tabell over materialer).
- Identifisering av de genomisk DNA-endringene i EGFR av PCR i sanntid
Merk: Afatinib er et lite molekyl inhibitor som er rettet mot EGFR tyrosin kinase. EGFR uttrykks status fastsettes ved DNA-og protein nivåene.- Genomisk DNA er isolert ved hjelp av et sett med DNA-rensing (se tabell over materialer) som følger produsentens anvisninger. Mål konsentrasjonen av det isolerte genomisk DNA med en spektrofotometer (se tabell over materialer) og Juster alle genomisk DNA-prøver til 25 ng/μL.
- Forsterk 50 ng av genomisk DNA, som tilsvarer 2 μL av de 25 ng/μL bestandene, ved hjelp av en SYBR grønn Master mix (se tabell over materialer) og analysere resultatene ved hjelp av et fluorescens RT-PCR-Detection System (se tabell over materialer).
Merk: PCR sykkelforhold begynte med et innledende denaturering trinn ved 95 ° c i 20 s, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° c denaturering for 3 s, 60 ° c annealing for 30 s. Den spesifikke primer settene er som følger: EGFR F: 5 ′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3 ′, R: 5 ′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3 ′. Normalisering Gene LINE-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
- Evaluering av effekten av protein forandringer på EGFR nivå ved Western Blot analyse
- Behandle cellene med afatinib kontinuerlig før eksperimenter for 24 h. vask PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3 celler to ganger med PBS og deretter frø dem i vekst medier uten afatinib. Vask PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3 celler to ganger med 5 mL iskald PBS.
- Lyse cellene i RIPA-bufferen inneholder 1% protease inhibitor cocktail (se tabell over materialer) og fosfatase INHIBITOR cocktail II og III (se tabell over materialer) og ruge denne løsningen ved 4 ° c i 30 min. sentrifuger lysater i 10 min ved 100 x g og 4 ° c og samle inn den tomme lysater.
- Bestem protein konsentrasjoner ved hjelp av bicinchoninic yre analysen (se tabell over materialer), Juster alle protein prøver til 0,5 eller 1 μg/μL ved bruk av 4X prøve buffer (500 mm Tris (pH 6,8), 40% glyserol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromophenol blå) og Kok ved 96 ° c i 5 min. Oppbevar disse protein prøvene ved-80 ° c til Western Blot-analysen er utført.
- Skill like mengder av protein prøver, fortrinnsvis 20-30 μL, med 8% SDS-side og overføre proteiner til en Polyvinylidene fluor (PVDF) membran.
Merk: Natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) er vanligvis brukes i laboratoriet for separasjon av proteiner basert på deres molekylvekt.- Rengjør glassplater med etanol og Monter glassplaten og avstandsstykker. Forbered 8% Poly-akrylamid gels som inneholder 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% BIS-akrylamid, 10% SDS, 10% APS, og TEMED. Polymeres i 30 minutter ved romtemperatur.
- Deretter utarbeide en stabling gel inneholder 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% BIS-akrylamid, 10% SDS, 10% APS, og TEMED. Tilsett stabling gel løsningen, sett kam, og polymeres gelen for 20-30 min ved romtemperatur.
- Plasser gels i elektroforese apparater og fylle tanken med rennende buffer (0,25 M Tris, 1,92 M Glycine, og 1% SDS). Legg lik mengde protein prøver (20-30 μL) og Kjør gelen ved 180 V. stopp elektroforese når fargestoffet foran renner ut av gelen, etter ca 60 min.
- Vask gelen for 1-2 min med TBST og deretter overføre proteiner på en PVDF membran ved semi-tørr blotting (se tabell av materialer) for 1,5 h ved en konstant strøm av 300 ma.
- Blokker membraner med 5% nonfat tørr melk (se tabell over materialer) FORTYNNET med TBST-oppløsning (se tabell over materialer) for 1 time ved romtemperatur, og deretter sonde MEMBRANER med anti-EGFR, anti-fosfat-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET, og anti-utgangen antistoffer (fortynnet 1:3000 i TBST) (se tabell av materialer) ved 4 ° c over natten.
- Vask membraner med TBST tre ganger i 10 min, og deretter utsette membraner til sekundær antistoff (fortynnet 1:200 i TBST) for 1-1.5 h ved romtemperatur. Vask membraner fem ganger med TBST for 10 min ved romtemperatur, utsett dem for ECL-løsningen (se tabell over materialer), og Visualiser signalene ved hjelp av filmer.
- Analyse av EGFR mutasjoner av sekvensering
- Forsterk genomisk DNA ved hjelp av spesifikke primere for EGFR exoner 19-21. PCR sykkel forholdene begynner med et innledende denaturering trinn ved 94 ° c i 1 min, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 98 ° c i 10 s, annealing ved 55 ° c i 30 s, og utvidelse ved 72 ° c i 1 min.
Merk: Den spesifikke primere for EGFR ekson 19: F: 5 '-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3 ' R: 5 ′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3 ′, ekson 20: F: 5 ′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3 ′, R: 5 ′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3 ′, og ekson 21: F: 5 ′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3 ′, R: 5 ′- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3 ′. - Rens de forsterkede PCR-produktene ved hjelp av et PCR rensesett (se tabell over materialer) og amplicons.
- Forsterk genomisk DNA ved hjelp av spesifikke primere for EGFR exoner 19-21. PCR sykkel forholdene begynner med et innledende denaturering trinn ved 94 ° c i 1 min, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 98 ° c i 10 s, annealing ved 55 ° c i 30 s, og utvidelse ved 72 ° c i 1 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjemaet for å etablere tre afatinib-motstand cellelinjer fra PC-9-celler ved hjelp av en trinnvis dose-opptrapping prosedyre er vist i figur 1. Figur 2 viser en nedgang i celle spredning av foreldrenes PC-9-celler som konsentrasjonen av afatinib økes, noe som indikerer at PC-9-celler er følsomme for afatinib eksponering. Figur 3 viser afatinib av de tre cellelinjene. Ingen av de tre afatinib-resistente cellelinjer, AFR1, AFR2, og AFR3, viste undertrykkelse av celle spredning under afatinib eksponering. Figur 4 viser kurvene for celle SPREDNING for PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3-celler. De tre afatinib-resistente cellelinjer utstilt betydelig tregere vekst enn foreldre PC-9 celler. Figur 5 viser uttrykket nivåer av EGFR GDNA i PC-9 og de tre afatinib-resistente celler, som indikerer at afatinib-resistente celler uttrykt signifikant høyere nivåer av EGFR gDNA enn foreldrenes PC-9 celler. Figur 6 viser proteinet uttrykk for EGFR i PC-9 og afatinib-resistente celler. På sammenlignbare gDNA uttrykks nivåer, var EGFR protein uttrykk høyere i resistente celler enn i foreldrenes PC-9-celler. Figur 7 viser at sekvensering resultatene av EGFR exoner 19 og 20 i PC-9, AFR1, AFR2, og AFR3 celler. PC-9 celler viste 15 BP slettinger i EGFR ekson 19 og vill-type EGFR i ekson 20. Men AFR1 og AFR2 celler utstilt forsterkning av vill-type EGFR ekson 19. AFR3 celler inneholdt 15 BP slettinger i EGFR ekson 19 som i PC-9 celler, men poenget mutasjon T790M ble observert i EGFR ekson 20.
Figur 1 : Skjema av prosessen brukes til å etablere tre afatinib-resistente cellelinjer fra PC-9. Først PC-9 celler ble delt inn i tre P100 retter og utsatt for afatinib på 1/10 av IC50 verdi. Deretter ble afatinib konsentrasjoner i vekstmedium økt med trinnvis dose eskalering til 1 μM. Etter 10-12 måneder ble tre uavhengige afatinib cellelinjer etablert og navngitt AFR1, AFR2 og AFR3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Parental PC-9 celler er følsomme for IRREVERSIBLE EGFR TKI, afatinib. Celler ble sådd i en 96-brønn mikroplate ved 2 x 103 celler/brønn/50 μL av vekstmedium, og preincubated over natten. Cellene ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av afatinib for 96 h. En MTT-analysen ble utført, OD570 verdier ble målt ved hjelp av en mikroplate leser (se tabell over materialer) og uttrykt som en prosentandel av verdien innhentet for kontroll celler. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM av verdier fra 6-12 replikere brønner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Etablerte celler utstilt motstand mot IRREVERSIBLE EGFR TKI, afatinib. Celler ble sådd i en 96-brønn mikroplate ved 2 x 103 celler/brønn/50 μL av vekstmedium og preincubated over natten. Cellene ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av afatinib for 96 h. En MTT-analysen ble utført, OD570 verdier ble målt ved hjelp av en mikroplate leser (se tabell over materialer) og uttrykt som en prosentandel av verdien innhentet for kontroll celler. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM av verdier fra 6-12 replikere brønner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Afatinib-resistente cellelinjer viste tregere spredning enn FORELDRENES PC-9 celler. Celler ble sådd i 96-brønn mikroplater ved 5 x 102 celler/100 μL/brønn. MTT-analysen ble utført, og OD570 verdier ble målt på dager 0, 1, 2, 3, 5 og 7 ved hjelp av en mikroplate leser (se tabell over materialer) og uttrykt som en prosentandel av verdien innhentet for kontroll celler. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM av verdier fra 6-12 replikere brønner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Gene Copy antall EGFR ble forhøyet i afatinib celler. Høyden på EGFR-genet ble målt ved kvantitativ PCR av genomisk DNA isolert fra PC-9, AFR1, AFR2 og AFR3-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Basal nivå av EGFR-protein ble økt i afatinib celler. Western Blot analyse av fosfat-EGFR, EGFR, HER2, HER3, og MET uttrykk i PC-9, AFR1, AFR2, og AFR3 celler. β-utgangen ble brukt som en laste kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : DNA-sekvensen leser i EGFR exoner 19 og 20. Genomisk DNA av PC-9, AFR1, AFR2, og AFR3 ble forsterket med spesifikke primere for EGFR ekson 19 og 21, og renset for sekvensering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en metode for å etablere tre uavhengige afatinib-resistente cellelinjer og preget disse cellene i forhold til foreldrenes PC-9-celler. Ved trinnvis dose opptrapping eksponering, foreldre PC-9 celler ervervet motstand mot afatinib over en periode på 10-12 måneder. Klinisk, motstanden mekanismer til EGFR TKIs er heterogene, og derfor, etter den første behandling med afatinib, PC-9 celler ble delt inn i tre uavhengige P100 retter og eksponert videre til afatinib. Cellevekst var i utgangspunktet ikke signifikant redusert, men etter hvert som legemiddel konsentrasjonen nærmet seg IC50 -verdien, ble celle spredningen redusert. Dette er et kritisk trinn for å skaffe celler med ervervet motstand mot hemmere. De voksende cellene skal splittes og overføres til nye P100 retter i forholdet 1:10 eller 1:5. Når PC-9 celler ble kultivert i en P100 parabol, var det noen overholdelse observert, men de fleste cellene vokste i suspensjon. Ettersom konsentrasjonen av afatinib ble økt, cellene levd til bunnen av vevet kultur behandlet retter. Hvis de fleste cellene er tilhenger, kan de være løsrevet med en celle-skraper. Den endelige konsentrasjonen av afatinib var 1 μM, som er omtrent 5 ganger maksimal serumkonsentrasjon (CMax)14. For å få klare forskjeller mellom foreldre og motstand kloner, den endelige konsentrasjonen ble satt til høyere enn CMax.
En alvorlig bekymring under prosedyren er bakteriell forurensning, selv om RPMI-1640 inneholder penicillin og Streptomycin. For å unngå dette, kan to P100 retter som inneholder fersk vekstmedium være forberedt når cellene er splittet. Når cellene kommer til sub-confluent scenen, kan cellene i en P100 parabolen bli ytterligere splittet, mens cellene i den andre P100 parabolen kan lagres ved-80 ° c i kryonisk bevaring medium (se tabell av materialer) som en backup, slik at hvis en linje er forurenset , kan den lagrede linjen brukes.
Det ville være vanskelig å fullstendig reprodusere oppkjøpet av afatinib motstand hos mennesker ved hjelp av cellekultur. Fremveksten av T790M-mutasjonen i EGFR ekson 20 ble rapportert som den dominerende årsaken til resistens mot afatinib. I vår rapport inneholdt en resistent klone T790M mutasjon11. Videre har økningen i vill-type EGFR, slik som i AFR1 og AFR2 celler, blitt rapportert av oss og andre grupper15,16. Tapet av EGFR mutasjon og økning i vill type EGFR rapporteres også i kliniske prøver fra pasienter med ervervet motstand mot EGFR-TKIs 17,18. Derfor, in vitro studier av vår nåværende modell kan gjenspeile molekylære profiler av kliniske prøver med ervervet motstand.
Denne trinnvis dose opptrapping metoden regnes som den mest pålitelige for å oppnå ervervet resistente celler linjer. Men innledende høy dose afatinib eksponering i kulturperler celler vil trolig bedre gjenspeile effekten av afatinib behandling hos pasienter med kreft, selv om etablering av resistente celler er vanskeligere. Ikke bare flytende cellelinjer, for eksempel PC-9, men også tilhenger cellelinjer, for eksempel HCC827, 11-18 eller HCC4006, kan benyttes for denne metoden. Denne trinnvis dose opptrapping metoden er også nyttig for å etablere kloner motstandsdyktig mot andre hemmere, ved hjelp av andre cellelinjer, som representerer andre typer kreft.
Eksponering av foreldrenes celler til mutagent agenter, slik som N-etanol-n-nitrosourea, etterfulgt av valg av celler motstandsdyktig mot afatinib eller osimertinib behandling har blitt rapportert å muliggjøre rask oppkjøp av resistente kloner 19 ,20. Imidlertid har denne kunstige metoden en tendens til å forårsake bestemte base erstatninger, for eksempel GC til AT overganger og AT til TA transversions. Videre er EGFR TKI ikke en mutagent agent hos pasienter med NSCLC. Metoden for trinnvis dose eskalering er derfor mer representativt enn å bruke mutagent midler.
Selv EGFR TKIs er i utgangspunktet effektive, celler til slutt utvikle resistens mot slike single-Target narkotika, noe som gjør det vanskelig å kurere kreft. Hemmere som er rettet mot flere molekyler er derfor viktig å utvikle. For dette formål er det nødvendig å oppnå celler med ervervet motstand mot multi-Target hemmere og evaluere mekanismene underliggende resistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmet av Advanced Cancer translational Research Institute for deres gjennomtenkte kommentarer og Editage for deres hjelp med engelsk språk redigering. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI (Grant nummer: 16K09590 til T.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
