Summary
Her beskriver vi samlingen af RNA polymerase II (pol II) langstrakte komplekser, der kun kræver korte syntetiske DNA og RNA-oligonukleotider og renset pol II. Disse komplekser er nyttige til at studere mekanismer underliggende Co-transkriptional behandling af udskrifter i forbindelse med pol II forlængelse kompleks.
Abstract
Eukaryotic mRNA syntese er en kompleks biokemisk proces, der kræver transskription af en DNA-skabelon til en forløber RNA ved multi-subunit enzym RNA polymerase II og co-transkriptional capping og splejsning af forløberen RNA til dannelse af moden mRNA. Under mRNA syntese, RNA polymerase II forlængelse kompleks er et mål for regulering af en stor samling af transkriptionsfaktorer, der styrer sin katalytiske aktivitet, samt capping, splicing, og 3 '-Processing enzymer, der skaber den modne mRNA. På grund af den iboende kompleksitet mRNA syntese, enklere eksperimentelle systemer muliggør isolation og undersøgelse af sine forskellige co-transkriptionelle etaper har stor nytte.
I denne artikel beskriver vi et sådant simpelt eksperimentelt system, som er egnet til at undersøge Co-transkriptional RNA-capping. Dette system er baseret på definerede RNA polymerase II forlængelse komplekser samlet fra renset polymerase og kunstige transkriptionsbobler. Når disse RNA polymerase II-komplekser er immobiliseret via biotinyleret DNA, giver de et let manipulabelt værktøj til dissekering af co-transkriptional RNA-capping og-mekanismer, hvorved forlængelse af langstrakte rekrutte og regulerer capping enzym under Co-transkriptional RNA capping. Vi forventer, at dette system kan tilpasses til at studere rekruttering og/eller samling af proteiner eller protein komplekser med roller i andre stadier af mRNA modning koblet til RNA polymerase II forlængelse kompleks.
Introduction
Eukaryotic Messenger RNA (mRNA) syntese er en udførlig biokemisk proces, der involverer syntese af en ubehandlet forløber RNA ved RNA polymerase II og behandling af forløber RNA at give den modne mRNA. RNA behandling trin af capping, splicing, og polyadenylering udføres i vid udstrækning Co-transkriptivt. Pol II-elongations komplekset fungerer som et stillads, der rekruter og organiserer aktiviteterne i mange af RNA-forarbejdnings enzymerne. Derfor vil vores ultimative forståelse af, hvordan moden eukaryote mRNAs genereres, være stærkt afhængig af udviklingen af eksperimentelle systemer for at muliggøre dissektion af de biokemiske mekanismer underliggende rekruttering til forlængelse kompleks og regulering af enzymer med ansvar for Co-transkriptional capping, splicing og polyadenylering.
Ikke overraskende har det været vanskeligt at udvikle sådanne forsøgssystemer. En væsentlig hindring har været den bemærkelsesværdige kompleksitet af Pol II-transskription selv, hvor blot rekonstitution af basal transkriptionen ved pol II in vitro kræver et minimumssæt af fem generelle transskriptions Initierings faktorer: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF og TFIIH 1. Desuden kræver en rekonstituerende type reguleret pol II-transkriptionen in vitro et endnu større sæt transkriptionsfaktorer og coregulatorer. Det har således været et vigtigt mål at udvikle enklere forsøgssystemer, der muliggør rekonstitution af aktive pol II-langstrakte komplekser, der egner sig til undersøgelser af den funktionelle kobling af Pol II-transskription og RNA-behandling.
En sådan enklere metode til rekonstitution af aktive pol II-elongations komplekser har vist sig nyttig til strukturelle og biokemiske undersøgelser af langstrakt pol II og for nylig til undersøgelse af co-transkriptional RNA-behandling2,3 ,4,5. I denne artikel viser vi, hvordan pol II-elongations komplekser fremstillet af renset pol II og syntetiske transkriptions bobler kan bruges effektivt til at undersøge de mekanismer, der underliggende Co-transkriptional capping af spirende pol II-udskrifter.
Capping refererer til den kovalente tilsætning af en 5 '-guanosin "Cap" til 5 '-trifosfat enden af spirende pol II udskrifter. Hætten er vigtig for efterfølgende trin af mRNA modning, transport, oversættelse og andre processer6,7. Den fælles landbrugspolitik tilsættes sammen transkriptivt til pol II-udskrifter af et enzym, der betegnes som capping enzym. I pattedyrsceller er aktive steder, der er ansvarlige for RNA 5 '-trifosfatase-og bundne-transferase-aktiviteterne i capping-enzymet, indeholdt i et enkelt polypeptid8. Udjævnings enzymet rekrutteres til pol II-forlængelse gennem interaktioner med endnu ikke definerede overflader på pol II-kroppen og Rpb1 carboxy-Terminal Domain (CTD) fosforyleret på Ser5 af dets heptapeptid gentager5. I forlængelse af forlængelse katalyserer enzymet enzym tilsætning af en 5 '-guanosine hætte, når den spirende afskrift når en længde på mindst 18 nukleotider og er opstået fra polymerase RNA exit Channel. I det første trin af capping reaktionen hydrolyserer trifosfatase RNA 5 '-trifosfat til at give en 5 '-diphosphat. I det andet trin hydrolyseres GTP til GMP af bundne-transferase, der danner en GMP-capping enzym mellemprodukt. Endelig, bundne transferase overfører GMP til 5 '-difosfat enden af den spirende transkriptet til at producere hætten.
Et bemærkelsesværdigt træk ved udjævningen reaktion er, at co-transkriptional capping (dvs. capping af udskrifter forbundet med funktionelle pol II forlængelse komplekser) er langt mere effektiv end capping af frie RNA5,9. Således har et stort spørgsmål i marken været, hvordan denne dramatiske aktivering af capping opnås gennem interaktioner af capping enzym med pol II forlængelse kompleks. I denne protokol beskriver vi samlingen af aktive RNA polymerase II-forlængelse komplekser ved hjælp af kun renset RNA polymerase II og kunstige transkriptionsbobler. Disse metoder tillader oprettelse af RNA polymerase II forlængelse komplekser med transkriptioner af definerede længde og sekvens. I en nylig undersøgelse, vi brugte disse definerede RNA polymerase II forlængelse komplekser som en model for at undersøge aspekter af mekanismerne i RNA capping5. Især viste vi, at (i) capping af RNA associeret med disse forlængelse komplekser var mere end 100-fold mere effektiv end capping af frie RNA og (II) blev stimuleret af TFIIH-afhængige fosforylering af Pol II CTD. Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, kunne i princippet tilpasses til at generere substrater til at studere andre Co-transkriptionelle RNA-behandlingsreaktioner forbundet med pol II-forlængelse.
I afsnit 1 i denne protokol, kunstige forlængelse komplekser er skabt ved udglødning en syntetisk skabelon streng DNA oligonukleotid til en RNA oligonukleotid, der supplerer den 3 '-ende til ca 9 nukleotider af Template streng DNA. Pol II indlæses derefter på DNA: RNA duplex. Forlængelse af forlængelse-komplekset suppleres med et delvist komplementært, ikke-skabelonelt DNA-oligonukleotid, der er mærket med biotin ved 3 '-enden (figur 1 og figur 2a). RNA-oligonukleotid forlænges af Pol II i disse forlængede komplekser for at fremstille radioaktivt mærkede udskrifter af defineret længde og sekvens ved tilsætning af passende kombinationer af radioaktivt mærkede nukleotider. Hertil kommer, ved hjælp af en kombination af skyller til at fjerne uindarbejdet nukleotider og yderligere tilsætning af forskellige kombinationer af nukleotider, kan man "gå" Pol II til forskellige positioner langs DNA-skabelon og syntetisere RNA af definerede længder. RNA renses derefter og udsættes for elektroforese i denaturering af urea-side geler. I afsnit 2 i protokollen, kunstige forlængelse komplekser anvendes til at analysere Co-transkriptional RNA capping. Eksemplet præsenterede virkningen af TFIIH-afhængig fosforylering af Pol II CTD på Co-transkriptional RNA-capping. I dette eksperiment måler vi omfanget af co-transkriptionelle capping som en funktion af capping enzym koncentration (5, 15 og 45 ng pr. reaktion) og tid (1, 2 og 4 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samling af kunstige elongation komplekser og Pol II Walking
- Immobilize 1 nmol af ikke-Template DNA oligo indeholdende et 3 ' biotin molekyle på magnetiske perler.
Bemærk: følgende trin kan gøres på forhånd for at forberede sig til fremtidige eksperimenter. Alle oligo-sekvenser, der anvendes i denne protokol, er angivet i tabel 1. RNA-oligoer syntetiseres med 5 '-trifosfat modifikationer.- Tilsæt 200 μL magnetiske perler (10 mg/mL) til en lav-proteinbinding 1,5 mL rør, og derefter placere på en magnetisk rack i 2 min.
- Mens røret er på den magnetiske rack, fjerne væsken fra røret uden at forstyrre perlerne. For at vaske perlerne, Fjern røret fra stativet, tilsæt 1 mL 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, returner røret til stativet, og fjern Vaskeopløsningen efter 2 min.
- Gentag vasketiden 2 gange med 200 μL af samme buffer.
- Resuspension magnetiske perler i 400 μL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, buffer. Bland derefter med 380 μL H2O og 20 μl 10 μM ikke-skabelon biotinyleret DNA-oligo. Anbring røret på en nutator og Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask immobiliseret ikke-skabelon DNA oligo 3 gange med 200 μL af 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, og derefter 3 gange med 200 μL af 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovin serumalbumin.
- Lad røret natten over ved 4 °C for at afslutte blokering af perler med BSA.
- Den næste dag, Placer røret i magnet stativet, Fjern og kassér væsken, og resuspension perler i 200 μL af 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL kvægserum albumin og overførsel til et nyt rør. For denne DNA-skabelon er den endelige koncentration ca. 5 μM.
Bemærk: Inkubationstiden og oligo koncentrationen skal empirisk bestemmes for hver biotinyleret DNA-oligo. Denne skabelon skal give nok til 200 reaktioner og vare mindst 6 måneder, når den opbevares ved 4 °C.
- Anneal RNA og DNA Template streng oligonukleotid oligoer i et 2:1 molært forhold (henholdsvis 20 og 10 pmol) for at opnå DNA: RNA duplex.
- Indstil en 10 μl udglødning mix som beskrevet i tabel 2.
Bemærk: 10 μl udglødning mix er tilstrækkelige til 10 reaktioner. Udglødning mix kan skaleres op efter behov, hvis der skal udføres flere assays. - Udfør udglødning reaktioner i en termisk variator ved hjælp af følgende program: 5 min ved 45 °c, efterfulgt af 12 cyklusser af 2 min hver, startende ved 43 °c og faldende temperaturen 2 °c pr cyklus. Inaktiv ved 4 °C.
Bemærk: Dette er et fleksibelt tidspunkt. Udglødning er afsluttet inden for ~ 30 min, men kan efterlades ved 4 °C i en længere periode. I laboratoriet, udglødning blandinger er blevet efterladt siddende i op til 4 h uden at observere nogen nedgang i reaktions effektivitet. - Mens udglødning RNA til Template streng DNA, forberede buffere til senere trin i protokollen. De ingredienser, der er nødvendige for at tilberede hver buffer til en enkelt reaktion med hver buffer, er anført i tabel 2 til 8. Opskalere opskrifter med en faktor på [Y (X + 1) + 1] for Wash og (X + 1) for alle andre buffere. X = antal reaktioner, der skal forberedes Y = antal nødvendige vaske trin (minimum 3).
Bemærk: Forbered alle buffere frisk dagen for eksperimentet. Anbring ikke rør på is, efter at PVA er blevet føjet til buffere. Tilføj pol II eller nukleotider til buffere lige før brug.
- Indstil en 10 μl udglødning mix som beskrevet i tabel 2.
- Belastning renset RNA polymerase II på DNA: RNA hybrid.
- Bland 1 pmol (1 μL) DNA: RNA-duplex med 13 μL pol II-buffer (fra tabel 3).
- Tilsæt ~ 0,02 enheder af renset RNA pol II (1 μL) til blandingen fra trin 1.3.1 og bland ved forsigtigt pipettering op og ned og omrøring med pipet spids, uden at indføre bobler. Inkuber i 10 min ved 30 °C.
Bemærk: Mængder, der gives herfra, er til en enkelt reaktion; Skalér op efter behov for antallet af reaktioner i forsøget. RNA pol II renset fra rotte lever som beskrevet10 anvendes i dette eksempel; men RNA pol II renset fra andre kilder, herunder dyrkede pattedyrceller eller gær kan også anvendes3,4,5,11,12,13.
- Fuldfør det forlængede kompleks ved tilsætning af biotinyleret ikke-skabelondna.
- Tilsæt 5 pmol (1 μL) immobiliseret, ikke-Template DNA-oligo til 14 μL af ikke-skabelon-DNA-buffer (fra tabel 4), tilsæt til tube fra trin 1.3.2, og Inkuber i 10 min ved 37 °c.
- Prøven placeres i magnetisk rack i 2 min. vask 1x med 30 μL vaskebuffer (fra tabel 7) for at fjerne Uindarbejdet pol II og oligoer.
- Generere forlængede komplekser, der indeholder radioaktivt mærkede RNA 23mers.
- Udfør alle yderligere inkubationer ved 30 °C. Tilsæt 1 μL 15 μM ATP og 10 μCi (1 μL) af [α-32P] utp (3.000 CI/mmol) til 23 μl puls buffer, og brug denne til at resuspendere vaskede magnetiske perler.
Forsigtig: Radioaktivt materiale er farligt. Sørg for at bære passende beskyttelsesudstyr og at følge alle Lab retningslinjer for sikker brug og bortskaffelse af radioaktivt materiale.
Bemærk: Udskift radioaktivt mærket UTP med 15 μM UTP, når der ikke er brug for radioaktivt mærket RNA, såsom for Western blot eksperimenter. - Inkuber reaktionen i 10 min for at tillade syntesen af radioaktivt mærkede 23mers.
- Tilsæt 1,5 μl opløsning indeholdende 100 μM ATP og 100 μm UTP mix til 3,5 μl Chase buffer, tilsæt til rør, der indeholder præmonterede forlængelse komplekser, og Inkuber i 5 min for at jage alle spirende udskrifter til 23mers.
- Prøven placeres i magnetisk rack i 2 min., Fjern supernatanten, vask en gang med 30 μL vaskebuffer for at fjerne ikke-inkorporerede nukleotider, og Genoptag den igen i 30 μL vaskebuffer.
- Du skal enten tilføje 94 μL stop mix med proteinase K og glykogen (tabel 9) for at afbryde Reaktionerne eller fortsætte til afsnit 1,6 for at generere langstrakte komplekser med længere udskrifter eller afsnit 2 for at udføre capping assays.
- Udfør alle yderligere inkubationer ved 30 °C. Tilsæt 1 μL 15 μM ATP og 10 μCi (1 μL) af [α-32P] utp (3.000 CI/mmol) til 23 μl puls buffer, og brug denne til at resuspendere vaskede magnetiske perler.
- Valgfri Gå pol II at gøre 23, 25, og 29 nucleotid udskrifter
- Følg den procedure, der er beskrevet i trin 1.2.1 til 1.5.4, for at tilberede elongations komplekser indeholdende radioaktivt mærkede 23mers. Skala op 4-fold til at generere 120 μL vasket forlængelse komplekser, som er nok komplekser til 4 reaktioner.
- Label 3 nye rør "23mer", "25mer" og "29mer". Overfør 30 μL vaskede elongations komplekser til "23mer" rør og tilsæt 94 μL stop mix med proteinase K og glykogen.
- Røret, der indeholder de resterende 90 μL af vaskede elongations komplekser i magnet stativet, placeres i 2 min., fjernes supernatanten og resuspenderes perlerne i 90 μL BTB suppleret med 1,2 μL hver 1,5 mM ATP og 1,5 mM CTP. Inkuber i 10 min ved 30 °C.
- Efter vask én gang med 90 μL vaskebuffer og opblanding i 90 μL vaskebuffer som beskrevet i trin 1.5.4, Overfør 30 μL af elongations komplekser til "25mer" rør og tilsæt 94 μL stop mix med proteinase K og glykogen.
- Røret, der indeholder de resterende 60 μL af forlængede komplekser i magnet stativet, placeres i 2 min., fjernes supernatanten, og perlerne resuspenderes i 60 μL BTB suppleret med 0,8 μL hver 1,5 mM ATP og 1,5 mM CTP.
- Inkuber i 10 min ved 30 °C, vask en gang med 60 μL vaskebuffer som i afsnit 1.5.5, og resuspender i 60 μL vaskebuffer.
- Overfør 30 μL fra 2x prøve til "29mer" tube og enten tilsæt 94 μL stop mix med proteinase K og glykogen eller Fortsæt til afsnit 2 for at udføre capping assays.
- Fortsæt til RNA-rensning og-analyse (afsnit 3).
2. brug af kunstige forlængelse komplekser til assay Cotranskriptional capping
- Generer vasket forlængelse komplekser, der indeholder 23mers ved at opskalere proceduren beskrevet i trin 1.2.1 til 1.5.5 13-fold. Dette er nok til 12 reaktioner + 1 ekstra.
-
Pol II CTD fosforylering
- Anbring røret, der indeholder vaskede elongations komplekser i magnet stativet, i 2 minutter, Fjern supernatanten, og resuspender perlerne i 377 μL BTB suppleret med 13 μL 1,5 mM ATP.
- Forbered to nye rør, mærket + H og-H, hhv. Til røret mærket + H tilsættes 3 μL ~ 300 ng/μL TFIIH, og til røret mærket-H tilsættes 9 μL af 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovint serumalbumin.
Bemærk: Vi bruger typisk TFIIH renset fra rotte lever, men vi har opnået lignende resultater ved hjælp af ~ 0,6 μg/reaktion af kommercielt tilgængelige rekombinant Cdk7/cyclin H/MAT1 (CAK, som er kinase modul fra TFIIH). Se tabel over materialer til orientering. - Tilsæt 87 μL af de vaskede forlængelse komplekser fra trin 2.2.1 til røret mærket + H og 270 μL af vasket forlængelse komplekser til røret mærket-H. Incubate 10 min ved 30 °C.
- Placer prøve i magnetisk rack i 2 min. For at fjerne overskydende nukleotider og ubundet protein, vask aflange komplekser i + H og-H reaktioner med henholdsvis 90 μL eller 270 μL vaskebuffer.
-
RNA-capping
- Resuspension af langstrakte komplekser i røret mærket + H i 87 μL capping mix (BTB suppleret med 50 μM GTP (tabel 10). Resuspendere forlængelse komplekser i røret mærket-H i 261 μL af capping mix.
- Forbered 4 nye rør mærket 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Fortyndet capping enzym (CE) i 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovint serumalbumin til tilberedning af opløsninger indeholdende 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL eller 45 ng CE/μL og dispenserer 3 μL af den passende opløsning til hvert af de 4 rør.
- Forbered 12 nye rør med 94 μL stop buffer (2.1.1) tilføjet til hver.
- Start hver capping reaktion ved at tilføje 87 μL af forlængelse kompleks behandlet med TFIIH eller ikke til mærkede rør, der indeholder capping enzym. Inkuber ved 30 °C i en varmeblok.
- Efter 1, 2 eller 4 min., stop reaktioner ved at overføre 30 μL af hver reaktionsblanding til rør, der indeholder 94 μL stop buffer. Rense og analysere reaktionsprodukter som beskrevet i afsnit 3.
3. RNA-rensning og-analyse
- Purify RNA
- Incubate reaktionsprodukter i stop buffer i 20 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Pausepunkt. Prøverne i denne buffer er blevet opretholdt i op til 4 timer uden tab eller nedbrydning af RNA. - Ekstraktet én gang med 124 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1) og en gang med chloroform: isoamylalkohol (24:1).
Forsigtig: Phenol er ekstremt giftigt og absorberes hurtigt af huden. Bær passende beskyttelsesudstyr.
Bemærk: For at maksimere genvinding af RNA under ekstraktion, skal du bruge kommercielt tilgængelige rør, der indeholder en high-density gel, som danner en stabil barriere mellem vandige og organiske faser. Se diskussion og tabel over materialer. - Den vandige fase (øverste lag) overføres til nye rør, der indeholder 12,4 μL 3 M natriumacetat pH 5,2.
- Incubate reaktionsprodukter i stop buffer i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Ethanol nedbør
- Tilsæt 350 μL 100% ethanol og bland grundigt ved inversion.
- Inkuber mindst 10 min. på tøris.
Bemærk: Pausepunkt. For nemheds skyld kan man stoppe her og fuldføre proceduren den næste dag; Det er dog muligt at gå direkte til trin 3,3 og køre gelen samme dag. RNA kan opbevares ved-80 °C i et par dage før videre behandling, men Efterlad ikke i længere tid.
- Klargøring af RNA-prøver til gel-elektroforese
- Lad prøverne tø, blandes ved invertering 2-3 gange, og centrifugeres i 15 minutter ved 21.000 x g, 4 °c, i en bordplade centrifuge. I mellemtiden, oprette denaturering gel mix (afsnit 3.4.1).
- Fjern forsigtigt ethanol fra prøverne uden at forstyrre pellet.
- Tilsæt 500 μL 70% ethanol, vend røret et par gange for at vaske pellet, og centrifuger derefter igen ved 21.000 x g i 5 minutter ved enten stuetemperatur eller 4 °c.
- Fjern så meget ethanol som muligt og gøre en hurtig spin (5-10 s) af rørene i en bordplade centrifuge. Derefter, med en gel-loading spids, fjerne den sidste resterende volumen af ethanol.
- Luft-tør pellet i 3 min ved stuetemperatur.
- RNA opløses ved at tilsætte 4 μL H2O til toppen af hver pellet. Inkuber 5 min ved stuetemperatur.
- Tilsæt 4 μL 2x RNA-farvestof (Se tabel over materialer) til blandingen, og vortex derefter hvert rør i et par sekunder for fuldt ud at RESUSPENDERE RNA.
Bemærk: RNA-farvestof, der indeholder formamid i stedet for urinstof anbefales, da sidstnævnte udfældelse ved lave temperaturer. - Quick-spin rørene, og derefter inkuberes dem ved 70 °C i 10 min i en varmeblok.
-
Opbevar rørene på tøris, indtil de er klar til at indlæse på gel.
Bemærk: at holde RNA på tøris giver fleksibilitet til at arbejde på andre eksperimenter, mens gelen er polymeriserende. Det er ikke nødvendigt at genopvarme prøverne efter optøning. Men, RNA kan indlæses direkte efter opvarmning, hvis gelen er klar til at køre.
- Klargøring af urinstof-side gel
- For 40 mL gel mix kombineres i et 50 mL konisk rør: 16,7 g urinstof, 15 mL 40% bis: acrylamid opløsning (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumborat, 20 mM EDTA) og 8 mL H2O. Denne volumen er tilstrækkelig til en standard størrelse Gel (18 cm højde x 16 cm bredde) med 1,0 mm Spacers.
Forsigtig: Acrylamid er ekstremt giftigt. Mens der ikke er nogen inhalations risiko, når det er i opløsning, altid bære Lab frakke, handsker og sikkerhedsbriller under håndtering.
Bemærk: Denne blanding er til støbning af en denaturering 15% polyacrylamid gel, som let løser RNA mellem 15-50 NT. ændre koncentrationen af bis/acrylamid efter behov for at løse forskellige RNA-udskrifter af forskellig længde. - Anbring et lukket rør indeholdende gel mix på en nutator, indtil urinstof er helt opløst.
- Sæt gel-Casting Station med glasplader, 1 mm afstandsstykker og en 15-brønd kam.
- Arbejde hurtigt, tilsættes 40 μL af TEMED og 400 μL af 10% ammonium persulfat opløsning til gel opløsning og blandes godt. Brug et 25 mL pipet, hæld gel opløsning mellem pladerne, Indsæt kam og lad gelen polymerisere i mindst 2 timer.
Bemærk: Hvis gelen hældes mere end 2 h før brug, når den har polymeriseret dække det med fugtigt papir håndklæde (forlader kam på plads) og wrap med plast wrap for at forhindre det i at tørre ud.
- For 40 mL gel mix kombineres i et 50 mL konisk rør: 16,7 g urinstof, 15 mL 40% bis: acrylamid opløsning (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumborat, 20 mM EDTA) og 8 mL H2O. Denne volumen er tilstrækkelig til en standard størrelse Gel (18 cm højde x 16 cm bredde) med 1,0 mm Spacers.
- Denaturering gel RNA elektroforese
- Efter polymerisering, Overfør gel til rindende tank og pre-Run det på 20 mA i 1x TBE for 15-30 min.
- I mellemtiden tø prøver (hvis frosne), vortex, og spin dem i 4 min ved 2.000 x g, 4 °c.
- Når du er klar, skal du slukke for strømforsyningen og forsigtigt skylle hver brønd med 1x TBE ved hjælp af en sprøjte.
- Brug gel-læsse tips til at indlæse prøver på gelen.
- Kør gel på en konstant 20-30 mA i ca. 2 h eller indtil lavere farvestof (xylen cyanol FF) når bunden af gelen.
- Fjern gelen, Anbring den på et stykke absorberende papir, og Pak den med plastikfolie.
- Eksponerede den radioaktivt mærkede gel på en phosphorskærm.
- Scan phosphorscreen ved hjælp af en phosphorimager og analysere billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 og 3 viser repræsentative resultat reaktioner, der anvendes til at generere kunstige langstrakte komplekser, der indeholder udskrifter af forskellig længde ved at udvide eller pol II fra forskellige kilder. Figur 4 viser, hvordan disse forlængelse komplekser kan bruges til at assay Co-transkriptional CTD fosforylering-afhængige RNA capping.
Figur 2a er et diagram over DNA-og RNA-molekyler i kunstige forlængelse komplekser. Figur 2b viser udskrifter af forskellig længde genereret i reaktioner udført nøjagtigt som beskrevet i protokol 1, hvor start kunstige forlængelse komplekser blev udarbejdet ved hjælp af en syntetisk RNA oligo af 20 NT (mørkeblå i figur 2a ; RNA_20mer, tabel 1). Da vi kender start RNA længde og DNA-skabelon sekvens, kan vi bestemme delmængde af nucleotides-ATP, CTP, GTP eller UTP-nødvendigt at gå pol II til en defineret position langs skabelonen. Antallet af nyligt syntetiserede nukleotider tilsættes til startstørrelsen af RNA-oligonukleositidprimer for at bestemme den endelige forventede længde (RNA-oligo størrelse + antal nukleotider tilsat). I nærværelse af ATP og UTP, pol II kan tilføje 3 NT til 20 NT RNA oligo til at generere forlængelse komplekser indeholdende en 23mer RNA. Hvis man vasker væk uindarbejdet ATP og UTP og derefter tilføjer ATP og CTP, den 20 NT oligo forlænges med 2 NT at gøre en 25mer, og hvis man så igen skyller væk uindarbejdet nukleotider og tilføjer ATP og GTP, afskriften forlænges en yderligere 4 NT at gøre en 29mer. sin CE de nyligt genererede udskrifter svarer til den forventede RNA-størrelse, og da næsten alle de radioaktivt mærkede 23mere kan blive kvantitativt jaget ind i længere produkter, ved man, at ved hjælp af denne metode (i) er RNA-oligo korrekt placeret ved pol II exit under samlingen, og (II) radioaktivt mærkede RNAs er forbundet med aktive pol II-elongations komplekser.
Figur 2c viser en variation af protokollen, hvor start forlængelse komplekser blev udarbejdet ved hjælp af samme DNA-skabelon og ikke-Template-streng oligoer og et RNA-oligo (RNA_29mer, tabel 1), der indeholder yderligere 9 nukleotider på dens 5 '-ende, men er ellers identisk i rækkefølge til 20 NT RNA oligo. Da start-RNA-længden er 29 NT i dette tilfælde, kan der genereres langstrakte komplekser med 32mer, 34mer og 38mer udskrifter ved hjælp af de samme pol II-trin som beskrevet ovenfor.
Afhængigt af omfanget af analysen, giver denne metode fleksibilitet i kilden til pol II. I figur 3 sammenligner vi reaktioner ved hjælp af Pol II fra forskellige kilder. I reaktionerne, der blev vist i de første 4 baner, blev kunstige forlængede komplekser samlet med endogen, vildtype pol II renset fra enten rotte lever eller fissions gær og gik som beskrevet ovenfor for at generere 23mers eller 25mers. Rotte-og fissions gærpol IIs anvendt i disse reaktioner blev renset til nær homogenitet ved hjælp af flere kromatografiske trin.
Metoden kan også anvendes til at generere kunstige forlængelse komplekser, der indeholder vildtype eller mutant pol II tilberedt ved hjælp af en enkel, et-trins rensningsmetode. De sidste to baner i figuren viser assays udført ved hjælp af en mutant form af human pol II, der mangler CTD i sin Rpb1 underenhed, som ikke er nødvendig for pol II katalytisk aktivitet, men hjælper med at par transkriptionen til RNA capping. Den CTD-less pol II, der anvendes i disse assays blev renset ved anti-flag immuno-rensning fra en menneskelig cellelinje udtrykker et flag epitop Tagged version af Rpb1. Det er vigtigt at bemærke, at koncentrationen af aktiv pol II vil variere fra forberedelse til forberedelse. Det er derfor vigtigt at udføre indledende eksperimenter, hvor mængden af Pol II, der anvendes i reaktionerne, er varieret for at bestemme det beløb, der er nødvendigt for at opnå den ønskede aktivitet.
Figur 4 viser et repræsentativt eksempel på en analyse, der sammenligner capping af radioaktivt mærkede udskrifter forbundet med kunstige forlængede komplekser indeholdende pol II med enten en phosphoryleret eller UNPHOSPHORYLERET CTD. For disse assays blev der udarbejdet langstrakte komplekser indeholdende 23 nukleotidtransskriptioner med en 5 ' trifosfat-ende, som beskrevet i protokol 2.
Inkubation af forlængelse komplekser med capping enzym fører til et mobilitets skift på omkring 1 NT, hvilket indikerer tilføjelsen af en 5 ' cap14, 15. At kvantificere capping reaktioner, man bestemmer capping effektivitet, udtrykt som procent af RNA, der er udjævnet. Capping effektivitet er forholdet mellem udjævnet RNA til total RNA, divideret med den maksimale opnåelige capping. I vores assays finder vi den maksimale opnåelige capping af RNA oligonukleotider opnået fra kommercielle kilder er ~ 85%, sandsynligvis på grund af ufuldstændig trifosforylering af syntetisk RNA.
I reaktionerne, der blev vist i de første 3 baner, blev forlængede komplekser inkuberet med den generelle transkriptionsfaktor TFIIH og co-faktor ATP til fosforylat pol II CTD før capping. I disse reaktioner, nær maksimal capping blev observeret ~ 1 min efter tilsætning af 5 ng af capping enzym. Når assays blev udført ved hjælp af forlængelse komplekser, der ikke inkuberet med tfiih og dermed indeholder unphosphorylated pol II, det tog næsten 10 gange så meget capping enzym til at observere lignende niveauer af capping. De sidste to baner i figur 4 viser de produkter af reaktioner, hvor forlængelse komplekser blev inkuberet med eller uden capping enzym, i nærværelse af TFIIH. Vigtigere er, at TFIIH-afhængigheden af co-transkriptionelle capping kunstige forlængelse komplekser demonstreret i denne figur er meget lig den, der er observeret i forlængelse komplekser, der havde initieret transkriptionen hos en promotor i mere komplekse enzymsystemer 5.
Figur 1: samling af kunstige forlængelse komplekser. (A) RNA-oligo (mørkeblå) på 20 NT udglødet til en DNA-skabelon streng (grøn) gennem en komplementær sekvens på 9 NT.B) RNA-polymerase II (pol II) blandes med det glødede DNA: RNA-hybrid for at positionere RNA 3 '-enden på pol II katalytisk site. C) der tilsættes en molær overskridelse af 3 ' biotinyleret ikke-Template-streng-DNA-oligo (lyseblå) til reaktionsblandingen for at omslutte og yderligere stabilisere langstrakt komplekset. D) immobiliserede afspærring komplekser vaskes for at fjerne overskydende oligoer og inkuberet med passende kombinationer af nukleotider for at gøre det muligt for pol II at forlænge RNA-oligo til den ønskede længde. Den nyligt syntetiserede del af RNA er vist med gult. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Pol II går ved hjælp af RNA-oligoer af forskellig længde. A) diagram over kunstige elongationskomplekser,derviser nukleotider tilsat under gåture. Ikke-skabelon streng og Template-streng DNA vises i henholdsvis lyseblå og grøn. 20 NT RNA-oligo er vist i mørkeblå. Også vist er nucleotider tilsat under successive ture til at generere 23mer RNA (orange), 25mer RNA (brun), og 29mer RNA (magenta). B) Denaturerings gelelektroforese, der viser RNAs af defineret længde opnået efter at have VANDRET pol II ved hjælp af en 20 NT RNA-primer, som beskrevet i protokol 1. Nukleotider tilføjet under hvert sekventielt gåtrin i protokollen er farvekodede orange (23mer), brun (25mer) og magenta (29mer). C) pol II går i gang med en 29 NT RNA primer, men ellers nøjagtigt som vist i b. (b og C) viser dele af den samme gel, men blev adskilt med henblik på illustration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: transskriptioner syntetiseres af kunstige langstrakte komplekser, der indeholder vildtype eller mutant pol II. Kunstige forlængelse komplekser blev samlet ved hjælp af 20 NT RNA primer og meget renset endogene pol II fra rotte lever eller fission gær eller flag immunopurificeret pol II mangler Rpb1 fra Hela celler (F: Rpb1-δctd). RNA i hvert kompleks blev yderligere forlænget til 23 NT eller 25 NT. Se teksten for at få flere oplysninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: phosphorylering-afhængig aktivering af co-transkriptional RNA-capping. Kunstige langstrakte komplekser indeholdende rotte lever pol II og radioaktivt mærket 23mer RNA blev inkuberet med ATP og den generelle transkriptionsfaktor TFIIH eller buffer i 10 min til fosforylat pol II CTD. Efter vask blev forlængelse komplekser inkuberet med 5 ng, 15 ng, eller 45 ng af pattedyrs capping enzym for 1, 2 eller 4 min. de øvre og ikke-reducerede 23mers blev løst i en Denaturerings gel (top, første 12 baner), og det% dækkede RNA blev kvantificeret og plottet (nederst). Denne del af figuren blev oprindeligt udgivet i ref 5, som blev udgivet som en åben Access-artikel under en CC-by-licens. De sidste to baner, der kommer fra et separat eksperiment, illustrerer produkter af reaktioner, hvor forlængede komplekser blev inkuberet med eller uden capping enzym, i nærværelse af TFIIH. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Sekvens | Kommentarer | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifikation; SIDE & RP-HPLC renset |
| RNA_29mer | ACUCUAUGACUCUUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifikation; SIDE & RP-HPLC renset |
| Skabelon streng DNA | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA TTAAGCATCATGG |
Dobbelt side & HPLC renset |
| Ikke-skabelon streng DNA | ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG | 5» TEG-biotinyleret; HPLC renset |
Tabel 1: DNA og RNA-oligonukleotider
| Endelig koncentration | Volumen | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM * | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 μL |
| 10 μM skabelon streng DNA oligo i 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | 1 μM | 1 μL |
| 10 μM RNA-oligo i 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 μM | 2 μL |
| Vand | 4,33 μL | |
| 10 μL | ||
| * Alle Tris-HCl kommer fra DNA og RNA oligo løsninger | ||
Tabel 2: cocktail for udglødning DNA og RNA oligonukleotider
| Pol II-buffer | Endelig koncentration | Volumen/reaktion |
| Vand | 4,52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | ^ 4,67 mM | 1,40 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | ^ 23 mM | 1,40 μL |
| 300 mM KCl | * 27 mM | 1,33 μL |
| 50% glycerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 13 μl | ||
| Lige før du bruger buffer add: | ||
| Annealed skabelon streng DNA: RNA (fra tabel 1) | 1 μL | |
| RNA-polymerase II | 1 μL | |
| * Den endelige KCl-koncentration i blandingen er ~ 50 mM, og yderligere KCl kommer fra Pol II | ||
| ^ De endelige MgCl2 -og Tris HCL-koncentrationer er henholdsvis 5 mm og 25 mm, | ||
| Den ekstra MgCl2 og Tris HCL kommer fra udglødet DNA: RNA-produkt. | ||
Tabel 3: mix af Pol II
| DNA-buffer uden skabelon | Endelig koncentration | Volumen/reaktion |
| Vand | 4,48 μL | |
| 300 mM KCl | * 43,33 mM | 2,17 μL |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1,50 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1,50 μL |
| 50% glycerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 14 μL | ||
| Lige før du bruger buffer add: | ||
| 5 μM biotinyleret ikke-skabelon-DNA-oligo | 1 μL | |
| * Endelig KCl koncentration i blandingen er 50 mM, med yderligere KCl kommer fra ikke-Template DNA oligo buffer. | ||
Tabel 4: DNA-mix uden for skabelon
| Puls mærknings buffer | Endelig koncentration | Volumen/reaktion |
| Vand | 9,98 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,5 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | * 12 mM | 0,3 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 5 μL |
| 23 μL | ||
| Lige før du bruger buffer add: | ||
| 15 μM ATP | 0,6 μM | 1 μL |
| 3,3 μM [α-32P] UTP | 0,13 μM | 1 μL |
| * Final Tris HCl koncentration er 20mM, med yderligere Tris HCl kommer fra nukleotid buffer. | ||
Tabel 5: puls mærkning NTP mix
| Chase buffer | Endelig koncentration | Volumen/reaktion |
| Tris HCl, pH 7,5 | * 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| Vand | 0,6 μL | |
| 50% glycerol | 3 | 0,3 μL |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 μL |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,15 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 1 μL |
| 3,5 μL | ||
| Lige før du bruger buffer add: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP fortyndet i 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 μM | 1,5 μL |
| * Alle Tris HCl kommer fra nucleotid buffer |
Tabel 6: Chase NTP mix
| Endelig koncentration | Volumen/reaktion | |
| Vand | 24,21 μL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 10% PVA | 0,2% | 0,6 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 30 μl |
Tabel 7: vaskebuffer
| Endelig koncentration | Volumen/reaktion | |
| Vand | 14,13 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 30 μL |
Tabel 8: base Transkriptionsbuffer (BTB)
| Stop buffer | Endelig koncentration | Volumen/reaktion |
| Vand | 55,74 μL | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM | 0,6 μL |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 μL |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 μL |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 μL |
| 60 μL | ||
| Lige før du bruger buffer add: | ||
| 15 mg/mL glykogen | 2 μL | |
| 20 mg/mL proteinase K | 2 μL | |
| Vand | 30 μL | |
Tabel 9: stop mix
| Endelig koncentration | Volumen/reaktion | |
| Vand | 11,9 μL | |
| 300 mM KCl | * 53,33 mM | 5,33 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 1,5 μM GTP fortyndet i 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 μM | 1 μL |
| 100 enheder/mL uorganisk Pyrophosphatase, gær | 0,1 enheder/reaktion | 1 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | ^ 16,67 mM | 0,5 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 29 μL | ||
| Lige før du bruger buffer add: | ||
| Capping enzym | 1 μL | |
| * Endelig KCl koncentration i blandingen er ~ 60 mM, med yderligere KCl kommer fra capping enzym og pyrophosphatase | ||
| ^ Endelig Tris HCl koncentration er 20 mM, med yderligere Tris HCl kommer fra nukleotid buffer | ||
Tabel 10: blanding af capping
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser, der har til formål at dissekere hændelser koblet til pol II-forlængelse, såsom RNA-behandling og regulering af selve transskriptionen, kan i høj grad lettes ved brug af et stærkt renset enzym system. Opsætning af sådanne enzymsystemer kan være udfordrende. Promotor-afhængig transkription af Pol II kræver mindst fem generelle transkriptionsfaktorer. Det kan tage måneder at forberede og lagre disse faktorer. Derfor er den sats-begrænsende trin i denne proces er ofte blot forbereder kadre af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for at rekonstruere basal transkriptionen i test røret.
I denne artikel beskriver vi en tilpasning af tidligere udviklede metoder til generering af kunstige transkriptionselongations komplekser2,3 ved hjælp af kun renset pol II og syntetisk DNA og RNA-oligonukleotider. De resulterende forlængelse komplekser er transskriptivt aktive og er egnede til brug i undersøge koblingen af Pol II transkriptionen og RNA capping5. Det er vigtigt at bemærke, at transkriptionen og RNA-capping forekommer in vivo i forbindelse med kromatin og mange andre proteiner, der ikke findes i dette definerede enzym system; derfor forventes dette system at rekapitulere mange, men ikke alle, funktioner af reaktioner, der opstår in vivo. Den protokol, vi beskriver, bygger på tidligere metoder ved at immobilisere kunstige langstrakte komplekser gennem biotinyleret DNA bundet til magnetiske perler, så forskeren let kan ændre reaktionsbetingelser og/eller fjerne ikke-inkorporerede nukleotider i forskellige stadier af assays. Vigtigere, fordi det tag, der bruges til at imholde forlængelse komplekser er i den ene ende af ikke-skabelon streng af DNA snarere end på pol II selv eller på skabelon streng, kun de pol IIs forbundet med komplette forlængelse komplekser vil blive bevaret på perler.
Fordi spirende transkriptioner skal have en 5 '-trifosfat ende for at blive modificeret ved capping enzym, de syntetiske RNA-oligonukleotider anvendes til capping eksperimenter købes med 5 '-trifosfat Termini. Umodificerede RNA-oligoer kan dog anvendes til andre anvendelser, herunder undersøgelser af andre Co-transkriptionelle RNA-behandlings hændelser eller aktiviteter af transkriptionsfaktorer, der regulerer pol II-forlængelse. Uanset downstream-applikationen anbefaler vi at samle elongations komplekser med højt renset DNA og RNA-oligoer. Især bør biotinylerede DNA-oligoer renses af HPLC, og andre DNA-og RNA-oligoer skal renses ved polyacrylamid-gel elektroforese og/eller HPLC. Renhedsgraden af enzymatiske aktiviteter skal dog afgøres fra sag til sag og vil afhænge af omfanget af hvert eksperiment.
Tilføjelse af ikke-skabelon biotinyleret DNA-oligo i det sidste trin af samlingen bør i princippet være tilstrækkeligt til at opnå et ternære kompleks. Vi medtager dog altid mindst ét "Walking"-trin for at bekræfte, at Pol II inkorporerer det korrekte antal nukleotider: Hvis målet med forsøget er at generere substrater til bestemmelse Co-transkriptional capping eller andre RNA-behandlingstrin eller til at følge pol II forlængelse, vi har altid en 32P-mærket ribonucleotid i den indledende "Walk", således at udskriften kan visualiseres og bruge ikke-mærkede "kolde" nukleotider for efterfølgende Walking trin, så den specifikke aktivitet af udskrifter af forskellige længder forbliver konstant. Selv om den metode, der er beskrevet i denne protokol, bruger 32P-mærkede nukleotider til at visualisere spirende udskrifter, kan fluorescens baserede analyser bruges til at måle RNA-mærkning, når det ikke er muligt at arbejde med radioaktive materialer. Det er dog vigtigt at bemærke, at følsomheden af sådanne assays typisk er meget mindre end dem, der bruger radioaktive etiketter, og de normalt kræver større mængder af enzym.
Et vigtigt skridt for reproducerbare eksperimenter er god RNA opsving under phenol: chloroform: isoamyl ekstraktion og ethanol nedbør. Vi har konstateret, at ved hjælp af mikrocentrifuge glas, der indeholder high-density gels (Se tabel over materialer) for phenol: chloroform: isoamyl ekstraktion øger reproducerbarhed og udbytte af nukleinsyre fra dette trin. Desuden, brugen af farvet glykogen (Se tabel over materialer) som bærer under ethanol nedbør gør det lettere at se små nukleinsyre pellets, hvilket gør det mindre sandsynligt, at man uforvarende mister pellet ved at aspirere det under fjernelse af ethanol supernatant.
Kunstige forlængelse komplekser genereret ved hjælp af protokoller svarende til dem, vi beskriver, bør også være nyttige til måling af protein-protein eller protein-nukleinsyre interaktioner mellem pol II forlængelse kompleks og faktorer, der regulerer transkriptionen eller RNA-behandlings hændelser, som er forbundet med forlængelse. I dette tilfælde, proteiner, der forbliver bundet til kunstige forlængelse komplekser efter vask detekteres af vestlige blotting eller massespektrometri; radiolabeling RNA er ikke nødvendig, og vi gør alle transkriptionstrin med kun "kolde" nukleotider.
Endelig kan denne metode være til brug for strukturelle analyser af transkriptionskomplekser. Der er faktisk blevet anvendt beslægtede metoder i Cryo-EM-studier med gær og pattedyr enzymer til at rekonstruere capping enzym pol II-interaktioner13og interaktioner mellem pol II og andre proteiner eller protein komplekser under forlængelse12 pauser16,17, og senest, bundet til en nucleosome18. En mulig komplikation for strukturelle analyser af transkriptionskomplekser genereret ved hjælp af denne metode er behovet for at fjerne biotin/magnetiske perler fra komplekset; Men, dette kan løses ved at medtage i DNA oligonukleotider specifikke steder anerkendt af restriktionsenzymer eller ved hjælp af biotin linkers, der spaltes ud efter UV-strålebehandling19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker S. Shuman for at give den pattedyrs capping enzym cDNA. Dette arbejde blev delvist støttet af et tilskud til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelsons medicinske forskningsfond ved Greater Kansas City community Foundation. Oprindelige data underliggende dette manuskript kan tilgås fra Stowers oprindelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D.
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
