Summary
Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.
Abstract
Eukaryotische mRNA-synthese is een complex biochemisch proces dat transcriptie van een DNA-template vereist in een precursor RNA door de multi-subunit enzym RNA polymerase II en co-transcriptionele capping en splicing van de precursor RNA om de volwassen mRNA te vormen. Tijdens de mRNA-synthese is het RNA polymerase II rek complex een doelwit voor regulering door een grote verzameling van transcriptiefactoren die de katalytische werking beheersen, evenals de capping, splicing en 3 '-processing enzymen die de volwassen mRNA creëren. Vanwege de inherente complexiteit van mRNA synthese, eenvoudigere experimentele systemen waardoor isolatie en onderzoek van de verschillende co-transcriptionele stadia hebben grote nut.
In dit artikel beschrijven we een dergelijk eenvoudig experimenteel systeem dat geschikt is voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-capping. Dit systeem is gebaseerd op gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen geassembleerd van gezuiverde polymerase en kunstmatige transcriptie bubbels. Wanneer geïmmobiliseerd via biotinyleerd DNA, deze RNA polymerase II rek complexen bieden een gemakkelijk losse tool voor het ontleden van co-transcriptionele RNA capping en mechanismen waarmee de rek complex rekruteert en regelt capping enzym tijdens Co-transcriptionele RNA-capping. We verwachten dat dit systeem kan worden aangepast voor het bestuderen van werving en/of assemblage van eiwitten of eiwitcomplexen met rollen in andere stadia van mRNA-rijping gekoppeld aan het RNA polymerase II-rek complex.
Introduction
Eukaryotische boodschapper RNA (mRNA) synthese is een uitgebreid biochemisch proces waarbij synthese van een onverwerkte precursor RNA door RNA polymerase II en verwerking van de precursor RNA om de volwassen mRNA te leveren. De RNA-verwerkingsstappen van capping, splicing en polyadenylering worden grotendeels co-transcriptioneel uitgevoerd. Het Pol II rek complex fungeert als een steiger die de activiteiten van veel van de RNA-verwerkings enzymen aanwerkent en organiseert. Bijgevolg zal ons uiteindelijke begrip van hoe volwassen eukaryotische Mrna's worden gegenereerd, sterk afhangen van de ontwikkeling van experimentele systemen om een dissectie van de biochemische mechanismen die onderliggende rekrutering voor het rek complex te maken en regulatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor co-transcriptionele capping, splicing en polyadenylering.
Het is niet verrassend dat de ontwikkeling van dergelijke experimentele systemen moeilijk is geweest. Een belangrijke belemmering is de opmerkelijke complexiteit van de Pol II-transcriptie zelf, waarbij het simpelweg reconstitueren van basale transcriptie door Pol II in vitro een minimumreeks van vijf algemene transcriptie initiatie factoren vereist: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF en TFIIH 1. Bovendien vereist het reconstitueren van elke vorm van gereguleerde Pol II-transcriptie in vitro een nog grotere reeks transcriptiefactoren en coregulatoren. Zo is een belangrijk doel geweest om eenvoudigere experimentele systemen te ontwikkelen die de reconstitutie van actieve Pol II-rek complexen mogelijk maken, geschikt voor onderzoek naar de functionele koppeling van Pol II-transcriptie en RNA-verwerking.
Een dergelijke eenvoudigere methode voor het reconstitueren van actieve Pol II-rek complexen is nuttig gebleken voor structurele en biochemische studies van het verlengen van Pol II en, meer recentelijk, voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-verwerking2,3 ,4,5. In dit artikel laten we zien hoe Pol II rek complexen bereid uit gezuiverde Pol II en synthetische transcriptie bellen effectief kunnen worden gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de co-transcriptionele capping van ontluikende Pol II transcripten.
Capping verwijst naar de covalente toevoeging van een 5 '-Guanosine "dop" aan de 5 '-trifosfaat einde van ontluikende Pol II transcripten. Het GLB is belangrijk voor de volgende stappen van mRNA rijping, transport, vertaling, en andere processen6,7. Het GLB wordt co-transcriptioneel toegevoegd aan Pol II transcripten door een enzym dat "capping enzyme" wordt genoemd. In zoogdiercellen zijn actieve sites die verantwoordelijk zijn voor de RNA 5 '-trifosfatase en guanylyl transferase-activiteiten van het capping enzym opgenomen in één polypeptide8. Het capping enzym wordt gerekruteerd naar het Pol II rek complex door middel van interacties met nog te definiëren oppervlakken op het Pol II lichaam en de Rpb1 Carboxy-terminale domein (CTD) fosforyleerd op Ser5 van zijn heptapeptide herhalingen5. In het rek complex, het capping enzym katalyseert toevoeging van een 5 '-Guanosine Cap zodra de ontluikende transcriptie bereikt een lengte van ten minste 18 nucleotiden en is voortgekomen uit de polymerase RNA uitgang kanaal. In de eerste stap van de capping reactie hydrolyseert de trifosfatase het RNA 5 '-trifosfaat om een 5 '-difosfaat te leveren. In de tweede stap wordt GTP gehydrolyseerd tot GMP door de guanylyl transferase, die een GMP-capping enzym intermediair vormt. Ten slotte brengt de guanylyl transferase GMP over naar het 5 '-difosfaat einde van de ontluikende transcriptie om het GLB te produceren.
Een opmerkelijk kenmerk van de capping reactie is dat co-transcriptionele capping (d.w.z. het afdekken van transcripten geassocieerd met functionele Pol II-rek complexen) veel efficiënter is dan het afdekken van vrij RNA5,5. Zo is een belangrijke vraag in het veld geweest hoe deze dramatische activering van capping wordt bereikt via interacties van het capping-enzym met het Pol II-rekcomplex. In dit protocol beschrijven we de assemblage van actieve RNA polymerase II rek complexen met alleen gezuiverde RNA polymerase II en kunstmatige transcriptie bubbels. Deze methoden maken het creëren van RNA polymerase II rek complexen met transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie mogelijk. In een recente studie, gebruikten we deze gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen als een model voor het onderzoeken van aspecten van de mechanismen van RNA capping5. In het bijzonder toonden we aan dat (i) het afdekken van RNA in verband met deze rek complexen meer dan 100-voudig efficiënter was dan het afdekken van vrij RNA en (II) werd gestimuleerd door TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD. De hier beschreven aanpak kan in principe worden aangepast om substraten te genereren voor het bestuderen van andere co-transcriptionele RNA-verwerkings reacties die verband houden met het Pol II-rek complex.
In sectie 1 van dit protocol worden kunstmatige rek complexen gemaakt door het gloeien van een synthetisch sjabloononderdeel DNA oligonucleotide op een RNA-oligonucleotide dat complementair is aan 3 '-end tot ongeveer 9 nucleotiden van het template-strand-DNA. Pol II wordt vervolgens op het DNA: RNA duplex geladen. Het rekcomplex wordt vervolgens aangevuld door toevoeging van een gedeeltelijk aanvullend, niet-template-strand-DNA-oligonucleotide dat met biotine wordt aangeduid op 3 '-end (Figuur 1 en Figuur 2a). Het RNA-oligonucleotide wordt door Pol II in deze rek-complexen verlengd om van transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie te maken bij toevoeging van geschikte combinaties van van-nucleotiden. Bovendien, met behulp van een combinatie van wassingen te verwijderen van de rechtsgebied nucleotiden en verdere toevoeging van verschillende combinaties van nucleotiden, men kan "lopen" Pol II naar verschillende posities langs de DNA-sjabloon en synthetiseren van RNA van gedefinieerde lengtes. RNA wordt vervolgens gezuiverd en onderworpen aan elektroforese in denaturerende ureum-pagina gels. In sectie 2 van het protocol worden kunstmatige rek complexen gebruikt om co-transcriptionele RNA-capping te analyseren. Het gepresenteerde voorbeeld meet het effect van de TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD op co-transcriptionele RNA-capping. In dit experiment meten we de mate van co-transcriptionele capping als een functie van capping enzym concentratie (5, 15 en 45 ng per reactie) en tijd (1, 2 en 4 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. assemblage van kunstmatige rek complexen en Pol II Walking
- Immobiliseer 1 nmol van non-template DNA oligo met een 3 ' Biotine molecuul op magnetische kralen.
Opmerking: de volgende stappen kunnen vooraf worden uitgevoerd om u voor te bereiden op toekomstige experimenten. Alle in dit Protocol gebruikte oligo-sequenties zijn beschikbaar in tabel 1. RNA oligos worden gesynthetiseerd met 5 '-trifosfaat modificaties.- Voeg 200 μL magnetische kralen (10 mg/mL) toe aan een laag-eiwitbinding 1,5 mL buis en plaats vervolgens op een magnetisch rek voor 2 min.
- Terwijl de buis op de magnetische rek, verwijder de vloeistof uit de buis zonder verstoring van de kralen. Om de kralen te wassen, verwijder de buis uit het rek, voeg 1 mL 5 mM tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, terug de buis naar het rek, en verwijder de wasoplossing na 2 min.
- REPEAT Spost nog 2 keer aan met 200 μL van dezelfde buffer.
- Respendeer magnetische parels in 400 μL van 10 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, buffer. Meng vervolgens met 380 μl H2O en 20 μL van 10 μM niet-sjabloon biotinyleerd DNA oligo. Plaats de buis op een nutator en inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wash geïmmobiliseerde non-template DNA oligo 3 keer met 200 μL van 5 mM tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, en vervolgens 3 keer met 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine.
- Laat de buis 's nachts bij 4 °C staan om kralen met BSA af te sluiten.
- De volgende dag, plaats de buis in het magnetische rek, verwijder en gooi de vloeistof, en respenderen kralen in 200 μL van 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine en overdracht naar een nieuwe buis. Voor dit DNA-template is de uiteindelijke concentratie ongeveer 5 μM.
Opmerking: Incubatietijd en oligo-concentratie moeten voor elke biotinyleerd DNA-oligo empirisch worden bepaald. Deze sjabloon moet voldoende zijn voor 200-reacties en ten minste 6 maanden duren bij opslag bij 4 °C.
- Anneal RNA en DNA sjabloon strand oligonucleotide oligos in een 2:1 molaire verhouding (20 en 10 pmol, respectievelijk) om het DNA te verkrijgen: RNA duplex.
- Stel een gloeien mengsel van 10 μL in zoals beschreven in tabel 2.
NB: 10 μL gloeien mengsel is voldoende voor 10 reacties. De gloeien mix kan zo nodig worden opgeschaald als er meer assays moeten worden uitgevoerd. - Voer de gloeien reacties uit in een thermische cycler met behulp van het volgende programma: 5 min bij 45 °C, gevolgd door 12 cycli van elk 2 min, beginnend bij 43 °C en een verlaging van de temperatuur 2 °C per cyclus. Stationair draaien bij 4 °C.
Opmerking: Dit is een flexibel tijdpunt. Gloeien is binnen ~ 30 min afgewerkt, maar kan gedurende een langere periode bij 4 °C worden achtergelaten. In het laboratorium zijn gloeien mengsels tot 4 uur achter gelaten zonder enige afname van de reactie-efficiëntie te observeren. - Terwijl het gloeien van RNA naar het template-strand DNA, buffers voorbereiden voor latere stappen van het protocol. De ingrediënten die nodig zijn om elke buffer voor een enkele reactie met elke buffer te bereiden, staan in de tabellen 2 tot en met 8. Schaal recepten op met een factor [Y (X + 1) + 1] voor Wash en (X + 1) voor alle andere buffers. X = aantal te bereiden reacties; Y = aantal benodigde wasstappen (minimaal 3).
Opmerking: bereid alle buffers vers op de dag van het experiment. Plaats geen buizen op ijs nadat PVA aan buffers is toegevoegd. Voeg Pol II of nucleotiden toe aan buffers vlak voor gebruik.
- Stel een gloeien mengsel van 10 μL in zoals beschreven in tabel 2.
- Laad gezuiverde RNA polymerase II op het DNA: RNA Hybrid.
- Meng 1 pmol (1 μL) DNA: RNA-duplex met 13 μL Pol II-buffer (uit tabel 3).
- Voeg ~ 0,02 eenheden gezuiverde RNA Pol II (1 μL) toe aan het mengsel van stap 1.3.1 en meng door zachtjes te pipetteren op en neer en roeren met pipetpunt, zonder bubbels te introduceren. Inincuberen gedurende 10 min bij 30 °C.
Opmerking: De volumes die hier worden gegeven, zijn voor een enkele reactie; schaal omhoog naar behoefte voor het aantal reacties in het experiment. RNA Pol II gezuiverd van rat lever zoals beschreven10 wordt gebruikt in dit voorbeeld; echter, RNA Pol II gezuiverd uit andere bronnen, met inbegrip van gekweekte zoogdieren cellen of gist kan ook worden gebruikt3,4,5,11,12,13.
- Voltooi het rekcomplex door toevoeging van biotinyated niet-template DNA.
- Voeg 5 pmol (1 μL) geïmmobiliseerde non-template DNA-oligo toe aan 14 μL van een niet-template-DNA-buffer (uit tabel 4), voeg toe aan de buis uit stap 1.3.2 en incuberen gedurende 10 minuten bij 37 °c.
- Plaats het monster in magnetische rek voor 2 min. was 1x met 30 μL wasbuffer (uit tabel 7) om de plaats Pol II en oligos te verwijderen.
- Genereer rek complexen met van RNA 23mers.
- Doe alle verdere incubaties op 30 °C. Voeg 1 μL van 15 μM ATP en 10 μCi (1 μL) van [α-32P] UTP (3.000 CI/mmol) toe aan 23 μL pulsbuffer en gebruik dit om gewassen magnetische kralen te hervatten.
Let op: Radioactief materiaal is gevaarlijk. Zorg ervoor dat u de juiste beschermende uitrusting draagt en alle labrichtlijnen volgt voor veilig gebruik en verwijdering van radioactief materiaal.
Opmerking: Vervang radioolabeled UTP met 15 μM UTP wanneer van RNA niet nodig is, bijvoorbeeld voor westerse Blot-experimenten. - Incuberen de reactie gedurende 10 min om de synthese van van 23mers mogelijk te maken.
- Voeg 1,5 μL oplossing met 100 μM ATP en een UTP-mix van 100 μM toe aan 3,5 μL Chase buffer, voeg toe aan buis met voorgemonteerde rek complexen en inbroed gedurende 5 minuten om alle ontluikende transcripten in 23mers te achtervolgen.
- Plaats het monster gedurende 2 minuten in een magnetisch rek, verwijder het supernatant, was één keer met 30 μL wasbuffer om de nucleotiden uit het gebied te verwijderen en breng in 30 μL van de reinigings buffer aan.
- Voeg 94 μL stop mengsel toe met proteïnase K en glycogeen (tabel 9) om reacties te beëindigen of ga verder naar sectie 1,6 om rek complexen met langere transcripties of sectie 2 te genereren om aftop testen uit te voeren.
- Doe alle verdere incubaties op 30 °C. Voeg 1 μL van 15 μM ATP en 10 μCi (1 μL) van [α-32P] UTP (3.000 CI/mmol) toe aan 23 μL pulsbuffer en gebruik dit om gewassen magnetische kralen te hervatten.
- Optionele Walk Pol II om 23, 25 en 29 nucleotide transcripten te maken
- Volg de procedure beschreven in stap 1.2.1 tot en met 1.5.4 om rekcomplexen voor te bereiden met van 23mers. Opschalen 4-voudige voor het genereren van 120 μL van gewassen rek complexen, dat is genoeg complexen voor 4 reacties.
- Label 3 nieuwe tubes "23mer", "25mer" en "29mer". Breng 30 μl gewassen rek complexen over in de "23mer" buis en voeg 94 μL stop mengsel toe met proteïnase K en glycogeen.
- Plaats de buis met de resterende 90 μL van de gewassen rek complexen in het magnetische rek gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant en hervat de kralen in 90 μL BTB, aangevuld met 1,2 μL elk van 1,5 mM ATP en 1,5 mM CTP. Inincuberen gedurende 10 min bij 30 °C.
- Na één keer wassen met 90 μL wasbuffer en resuspenderen in 90 μL wasbuffer zoals beschreven in stap 1.5.4, breng 30 μL rek complexen over naar de "25mer"-buis en voeg 94 μL stopmix toe met proteïinase K en glycogeen.
- Plaats de buis met de resterende 60 μL rekcomplexen in het magnetische rek gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant en resteert kralen in 60 μL BTB aangevuld met 0,8 μL elk van 1,5 mM ATP en 1,5 mM CTP.
- Inbroeden gedurende 10 minuten bij 30 °C, één keer wassen met 60 μL wasbuffer zoals in punt 1.5.5, en respenderen in 60 μL wasbuffer.
- Breng 30 μl van 2x monster naar "29mer" buis en voeg 94 μL stop mengsel toe met proteïnase K en glycogeen of ga verder naar sectie 2 om capping testen uit te voeren.
- Ga verder naar RNA zuivering en analyse (rubriek 3).
2. gebruik van kunstmatige rek complexen om Cotranscriptionele capping te testen
- Genereer gewassen rek complexen met 23mers door de procedure zoals beschreven in stap 1.2.1 tot en met 1.5.5 13-voudig op te schalen. Dit is genoeg voor 12 Reacties + 1 extra.
-
Pol II CTD fosforylering
- Plaats de buis met gewassen rek complexen in het magnetische rek voor 2 min, verwijder de supernatant, en respendeer kralen in 377 μL BTB aangevuld met 13 μL 1,5 mM ATP.
- Bereid twee nieuwe buizen, met het label + H en-H, respectievelijk. Voeg aan de buis met het label + H 3 μL ~ 300 ng/μL TFIIH toe en aan de buis met het label-H 9 μL van 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine.
Opmerking: We gebruiken meestal TFIIH gezuiverd van rat lever, maar we hebben vergelijkbare resultaten verkregen met behulp van ~ 0,6 μg/reactie van commercieel verkrijgbare recombinant Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, de kinase module van TFIIH). Zie tabel met materialen voor meer informatie. - Voeg 87 μL van de gewassen rek complexen toe van stap 2.2.1 tot de buis met het label + H en 270 μL van gewassen rek-complexen aan de buis met het label-H. inbroed 10 min bij 30 °C.
- Plaats monster in magnetische rek voor 2 min. Om overtollige nucleotiden en ongebonden eiwitten te verwijderen, was de verlenging van de rek in + H-en-H-reacties met respectievelijk 90 μL of 270 μL van de reinigings buffer.
-
RNA-capping
- Respendeer de rek-complexen in de buis met het label + H in 87 μL capping mix (BTB aangevuld met 50 μM GTP (tabel 10). Respendeer de rek-complexen in de buis met het label-H in 261 μL capping mix.
- Maak 4 nieuwe tubes met label 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Verdund capping enzym (CE) in 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL boviene serumalbumine om oplossingen te bereiden die 5 ng CE/μL, 15 ng/μL of 45 ng CE/μL bevatten en doseer 3 μL van de passende oplossing in elk van de 4 buisjes.
- Bereid 12 nieuwe buisjes met 94 μL stop buffer (2.1.1) aan elk.
- Begin elke capping reactie door toevoeging van 87 μL rek complex met TFIIH of niet met gelabelde buisjes met capping enzym. Inincuberen bij 30 °C in een warmte blok.
- Na 1, 2 of 4 minuten stop reacties door het overbrengen van 30 μL van elk reactiemengsel naar buisjes met 94 μL stop buffer. Reinig en analyseer reactieproducten zoals beschreven in rubriek 3.
3. RNA zuivering en analyse
- Zuivert RNA
- Incubate reactieproducten in stop buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het pauze punt. Monsters in deze buffer zijn tot 4 uur bewaard zonder verlies of afbraak van RNA. - Eenmaal uitpakken met 124 μL fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) en eenmaal met chloroform: Isoamylalcohol (24:1).
Let op: Fenol is zeer giftig en wordt snel geabsorbeerd door de huid. Draag geschikte beschermende uitrusting.
Opmerking: Om het herstel van RNA tijdens de extractie te maximaliseren, gebruikt u in de handel verkrijgbare buizen met een gel met hoge dichtheid, die een stabiele barrière vormt tussen waterige en organische fasen. Zie discussie en tabel met materialen. - Breng de waterige fase (bovenste laag) over naar nieuwe buisjes met 12,4 μL van 3 M Natriumacetaat pH 5,2.
- Incubate reactieproducten in stop buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Ethanol precipitatie
- Voeg 350 μL 100% ethanol toe en meng grondig door inversie.
- Inincuberen gedurende ten minste 10 min op droogijs.
Opmerking: Het pauze punt. Voor het gemak kan men hier stoppen en de procedure op de volgende dag afronden; het is echter mogelijk om direct door te gaan naar stap 3,3 en de gel op dezelfde dag uit te voeren. RNA kan gedurende een paar dagen vóór de verdere verwerking bij-80 °C worden bewaard, maar laat geen langere tijd achter.
- Voorbereiding van RNA monsters voor gel elektroforese
- Laat monsters ontdooien, Meng door 2-3 keer om te keren en centrifugeer 15 min bij 21.000 x g, 4 °c, in een tafel centrifuge. Ondertussen, het opzetten van denaturering gel mix (paragraaf 3.4.1).
- Verwijder voorzichtig ethanol uit monsters zonder storende pellet.
- Voeg 500 μL 70% ethanol toe, Inverteer de buis een paar keer om pellets te wassen en centrifugeer vervolgens opnieuw bij 21.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur of 4 °c.
- Verwijder zo veel mogelijk ethanol en doe een snelle spin (5-10 s) van de buisjes in een tafelblad centrifuge. Verwijder vervolgens met een gel-loading tip het laatst overgebleven volume ethanol.
- Lucht-droge pellet voor 3 min bij kamertemperatuur.
- Los RNA op door 4 μL H2O toe te voegen aan de bovenkant van elke pellet. Inincuberen 5 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 μL van 2x RNA Dye (Zie tabel van de materialen) toe aan de mix en draai vervolgens een paar seconden door elke buis om RNA volledig te hervatten.
Opmerking: RNA-kleurstof die formamide bevat in plaats van ureum wordt aanbevolen, omdat de laatste precipiteert bij lage temperaturen. - Snel-spin de buizen, en vervolgens inbroed ze op 70 °C gedurende 10 minuten in een warmte blok.
-
Bewaar tubes op droogijs tot ze klaar zijn om te worden geladen op gel.
Opmerking: het houden van RNA op droogijs maakt de flexibiliteit mogelijk om aan andere experimenten te werken terwijl de gel polymerisatie is. Monsters hoeven na ontdooien niet opnieuw te worden verwarmd. RNA kan echter direct na het verwarmen worden geladen als de gel klaar is om te worden uitgevoerd.
- Voorbereiding van ureum-pagina gel
- Voor 40 mL gel mix, combineer in een conische buis van 50 mL: 16,7 g ureum, 15 mL 40% bis: acrylamide oplossing (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumboraat, 20 mM EDTA) en 8 mL H2O. Dit volume is voldoende voor een standaard maat gel (18 cm hoog x 16 cm breed) met 1,0 mm spacers.
Let op: Acrylamide is uiterst giftig. Hoewel er geen inhalatie risico is wanneer het in oplossing is, moet u altijd een Labcoat, handschoenen en veiligheidsbril dragen tijdens het hanteren.
Opmerking: Dit mengsel is voor het gieten van een denaturerende 15% polyacrylamidegel, die gemakkelijk herstelt RNA tussen 15-50 NT. Verander de concentratie van bis/acrylamide naar behoefte om verschillende RNA transcripten van verschillende lengtes op te lossen. - Plaats de gesloten buis met gelmix op een nutator totdat ureum volledig is opgelost.
- Set-up gel-Casting station met glazen platen, 1 mm spacers en een 15-well kam.
- Werk snel, voeg 40 μL TEMED en 400 μL van 10% ammonium persulfate oplossing toe aan de geloplossing en meng goed. Met behulp van een 25 mL Pipet, giet gel oplossing tussen platen, invoegen kam, en laat de gel polymeriseren voor ten minste 2 h.
Opmerking: Als de gel wordt gegoten meer dan 2 h voor gebruik, zodra het heeft gepolymeriseerde bedekken met vochtige papieren handdoek (het verlaten van de kam op zijn plaats) en wikkel met plastic folie om te voorkomen dat het uitdrogen.
- Voor 40 mL gel mix, combineer in een conische buis van 50 mL: 16,7 g ureum, 15 mL 40% bis: acrylamide oplossing (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumboraat, 20 mM EDTA) en 8 mL H2O. Dit volume is voldoende voor een standaard maat gel (18 cm hoog x 16 cm breed) met 1,0 mm spacers.
- Denaturing gel RNA elektroforese
- Na polymerisatie, overdracht gel naar Running tank en pre-run het op 20 mA in 1x TBE voor 15-30 min.
- Ondertussen ontdooien de monsters (indien bevroren), Vortex en draaien ze 4 min bij 2.000 x g, 4 °c.
- Wanneer u klaar bent, schakelt u de voeding uit en spoelt u voorzichtig elk goed met 1x TBE met een spuit.
- Gebruik gel-loading tips om samples op de gel te laden.
- Run gel op een constante 20-30 mA gedurende ongeveer 2 uur of tot de lagere kleurstof (xyleen cyanol FF) de bodem van de gel bereikt.
- Verwijder de gel, plaats deze op een stuk absorberend papier en wikkel met plastic folie.
- Stel de van gel bloot aan een fosforscreen.
- Scan phosphorscreen met behulp van een foshorimager en analyseer de afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuren 2 en 3 vertonen representatieve resultaat reacties die worden gebruikt om kunstmatige rek complexen te genereren met transcripties van verschillende lengtes door uitbreiding of Pol II uit verschillende bronnen. Figuur 4 toont hoe deze rek-complexen kunnen worden gebruikt om co-transcriptionele CTD-fosforylering-afhankelijke RNA-capping te testen.
Figuur 2a is een DIAGRAM van DNA-en RNA-moleculen in kunstmatige rek complexen. Figuur 2b toont transcripten van verschillende lengte die worden gegenereerd in reacties die exact worden uitgevoerd zoals beschreven in Protocol 1, waarbij de beginnende kunstmatige rek complexen werden bereid met behulp van een synthetische RNA-oligo van 20 NT (donkerblauw in Figuur 2a ; RNA_20mer, tabel 1). Omdat we de start van de RNA-lengte en DNA-template sequentie kennen, kunnen we de subset van nucleotiden (ATP, CTP, GTP of UTP) bepalen die nodig zijn om Pol II naar een gedefinieerde positie langs de template te lopen. Het aantal nieuw gesynthetiseerde nucleotiden wordt toegevoegd aan de start grootte van de RNA oligonucleotide primer om de uiteindelijke verwachte lengte te bepalen (RNA oligo grootte + aantal nucleotiden toegevoegd). In aanwezigheid van ATP en UTP kan Pol II 3 NT toevoegen aan de 20 NT RNA oligo om rek complexen te genereren die een 23mer RNA bevatten. Als men weg wegspost ATP en UTP en vervolgens ATP en CTP toevoegt, de 20 NT oligo wordt verlengd door 2 NT om een 25mer, en als een dan weer wegspost niet-plaats nucleotiden en voegt ATP en GTP, de transcriptie wordt verlengd een extra 4 NT te maken van een 29mer. Sin CE de nieuw gegenereerde transcripten corresponderen met de verwachte RNA grootte en aangezien bijna alle van 23mers kwantitatief kunnen worden achtervolgd in langere producten, weet men dat het gebruik van deze methode (i) de RNA oligo correct gepositioneerd is bij de uitgang Pol II kanaal tijdens de montage en (II) van rna's worden geassocieerd met actieve Pol II rek complexen.
Afbeelding 2c toont een variatie van het Protocol, waarin de begin-rek complexen werden bereid met behulp van dezelfde DNA-template en niet-template strand oligos en een RNA oligo (RNA_29mer, tabel 1) die bevat een extra 9 nucleotiden op zijn 5 '-end, maar is anders identiek in volgorde van de 20 NT RNA oligo. Omdat de begin-RNA-lengte in dit geval 29 NT is, kunnen rek-complexen met 32mer-, 34mer-en 38mer-transcripten worden gegenereerd met dezelfde Pol II-loop stappen als hierboven beschreven.
Afhankelijk van de reikwijdte van de analyse, biedt deze methode flexibiliteit in de bron van Pol II. In Figuur 3 vergelijken we reacties met behulp van Pol II uit verschillende bronnen. In de reacties getoond in de eerste 4 rijstroken werden kunstmatige rek complexen geassembleerd met endogene, wild type Pol II gezuiverd van ofwel rat lever of fissie gist en liep zoals hierboven beschreven om 23mers of 25mers te genereren. De rat en splijtings gist Pol IIs die in deze reacties werden gebruikt, werden met behulp van meerdere chromatografische stappen gezuiverd tot in de buurt van homogeniteit.
De methode kan ook worden gebruikt voor het genereren van kunstmatige rek complexen met wild type of Mutant Pol II bereid met behulp van een eenvoudige, één-stap zuiveringsmethode. De laatste twee rijstroken in de figuur tonen assays uitgevoerd met behulp van een gemuteerde vorm van Human Pol II die de CTD mist in zijn Rpb1 subeenheid, die niet vereist is voor de katalytische activiteit van Pol II, maar helpt bij het koppel van transcriptie naar RNA capping. De CTD-less Pol II gebruikt in deze assays werd gezuiverd door Anti-Flag immuno-zuivering van een menselijke cel lijn uitdrukken van een vlag epitoop tagged versie van Rpb1. Het is belangrijk op te merken dat de concentratie van actieve Pol II zal variëren van voorbereiding tot bereiding. Het is dus essentieel om initiële experimenten uit te voeren waarbij de hoeveelheid Pol II die in reacties wordt gebruikt, wordt gevarieerd om het bedrag te bepalen dat nodig is om de gewenste activiteit te verkrijgen.
Figuur 4 toont een representatief voorbeeld van een vergelijking van het afdekken van radioolabeled transcripten geassocieerd met kunstmatige rek-complexen die Pol II bevatten, met ofwel een gefosforyleerd of ONGEFOSFORYLEERD CTD. Voor deze tests werden rek complexen met 23 nucleotide transcripten met een 5 '-trifosfaat uiteinde bereid zoals beschreven in Protocol 2.
Incubatie van rek complexen met capping enzym leidt tot een mobiliteits verschuiving van ongeveer 1 NT, met vermelding van de toevoeging van een 5 ' Cap14, 15. Om capping reacties te kwantificen, bepaalt men de capping-efficiëntie, uitgedrukt als percentage van RNA dat is afgedekt. Capping efficiëntie is de verhouding van het afgetopte RNA tot het totale RNA, gedeeld door de maximaal verkrijgbare capping. In onze assays vinden we de maximaal verkrijgbare capping van RNA oligos verkregen uit commerciële bronnen is ~ 85%, waarschijnlijk als gevolg van onvolledige trifosforylering van synthetisch RNA.
In de reacties getoond in de eerste 3 rijstroken werden rek complexen geïnineerd met de algemene transcriptiefactor TFIIH en de co-factor ATP tot fosforylaat de Pol II CTD vóór capping. In deze reacties werd in de buurt van maximale capping waargenomen ~ 1 min na toevoeging van 5 ng van het capping enzym. Wanneer assays werden uitgevoerd met behulp van rek complexen die niet zijn geïnineerd met TFIIH en dus ongefosforyleerd Pol II bevatten, duurde het bijna 10 keer zoveel capping enzym om vergelijkbare niveaus van capping te observeren. De laatste twee rijstroken van Figuur 4 tonen de producten van reacties waarin rek complexen werden geïnineerd met of zonder capping enzym, in aanwezigheid van TFIIH. Belangrijk is dat de TFIIH-afhankelijkheid van co-transcriptionele capping van kunstmatige rek complexen die in dit cijfer worden gedemonstreerd, zeer vergelijkbaar is met die waargenomen in rek complexen die transcriptie hadden geïnitieerd bij een promotor in complexere enzym systemen 5.
Figuur 1: assemblage van kunstmatige rek complexen. A) RNA-oligo (donkerblauw) van 20 NT wordt gegloeid tot een DNA-sjabloon strand (groen) door middel van een complementaire sequentie van 9 NT.B) RNA polymerase II (Pol II) wordt vermengd met het gegloeide DNA: RNA Hybrid om het RNA 3 '-end op de katalytische site van Pol II te positioneren. C) een molaire overmaat van 3 "biotinyleerd non-template strand DNA oligo (licht blauw) wordt toegevoegd aan de reactiemix om het rek complex te omsluiten en verder te stabiliseren. D) geïmmobiliseerde rek complexen worden gewassen om overtollige oligo's te verwijderen en geïnfiltreerd met geschikte combinaties van nucleotiden om Pol II in staat te stellen de RNA-oligo uit te breiden tot de gewenste lengte. Het nieuw gesynthetiseerde deel van het RNA wordt geel weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Pol II walking met behulp van RNA oligo's van verschillende lengtes. (A) diagram van kunstmatige rek complexen, tonen nucleotiden toegevoegd tijdens wandelingen. Niet-sjabloononderdeel en sjabloononderdeel DNA worden respectievelijk weergegeven in licht blauw en groen. De 20 NT RNA oligo wordt in donkerblauw weergegeven. Ook zijn nucleotiden toegevoegd tijdens opeenvolgende wandelingen om 23mer RNA (oranje), 25mer RNA (bruin) en 29mer RNA (magenta) te genereren. B) denaturerende gel-elektroforese met rna's van gedefinieerde lengte verkregen na het lopen van Pol II met behulp van een 20 NT RNA-primer, zoals beschreven in Protocol 1. Nucleotiden die tijdens elke opeenvolgende wandel stap van het protocol zijn toegevoegd, zijn kleurcodering oranje (23mer), bruin (25mer) en magenta (29mer). (C) Pol II lopen beginnend met een 29 NT RNA primer, maar anders precies zoals aangegeven in b. (b en C) tonen delen van dezelfde gel, maar werden gescheiden voor illustratiedoeleinden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: transcripten gesynthetiseerd door kunstmatige rek complexen die wild type of Mutant Pol II bevatten. Kunstmatige rek complexen werden geassembleerd met behulp van de 20 NT RNA primer en zeer gezuiverde endogene Pol II van rat lever of fissie gist of vlag immunopurified Pol II ontbreekt de Rpb1 uit HeLa cellen (F: Rpb1-ΔCTD). RNA in elk complex werd verder uitgebreid tot 23 NT of 25 NT. Zie tekst voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: fosforylering-afhankelijke activering van co-transcriptionele RNA-capping. Kunstmatige rek complexen met rat lever Pol II en van 23mer RNA werden geïnfiltreerd met ATP en de algemene transcriptiefactor tfiih of buffer voor 10 min voor fosforylaat de Pol II CTD. Na het wassen werden de rek complexen geïnpoleerd met 5 ng, 15 ng, of 45 ng van het zoogdier capping enzym gedurende 1, 2 of 4 min. afgetopte en niet-afgetopte 23mers werden opgelost in een denaturerende gel (boven, eerste 12 rijstroken) en het% afgetopte RNA werd gekwantificeerd en uitgezet (onder). Dit gedeelte van het cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in ref 5, dat werd gepubliceerd als een Open Access-artikel onder een CC-by-licentie. De laatste twee rijstroken, die afkomstig zijn van een afzonderlijk experiment, illustreren de producten van reacties waarin rek complexen werden geïnineerd met of zonder capping enzym, in aanwezigheid van TFIIH. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Volgorde | Opmerkingen | |
| RNA_20mer | Geijkte bloem | 5 ' trifosfaat modificatie; PAGINA & RP-HPLC gezuiverde |
| RNA_29mer | EEN van de meest GEIJKTE | 5 ' trifosfaat modificatie; PAGINA & RP-HPLC gezuiverde |
| Sjabloon strand DNA | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA TTAAGCATCATGG |
Dual PAGE & HPLC gezuiverde |
| Non-template strand DNA | Een van de meest GEACC... | 5 ' TEG-biotinylated; HPLC gezuiverde |
Tabel 1: DNA en RNA oligonucleotiden
| Eindconcentratie | Volume | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM * | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 μL |
| 10 μM sjabloon strand DNA oligo in 100 mM tris-HCl pH 7,5 | 1 μM | 1 μL |
| 10 μM RNA oligo in 10 mM tris-HCl pH 7,5 |
2 μM | 2 μL |
| Water | 4,33 μL | |
| 10 μL | ||
| * Alle tris-HCl is afkomstig van DNA en RNA oligo-oplossingen | ||
Tabel 2: cocktail voor gloeien van DNA en RNA oligos
| Pol II-buffer | Eindconcentratie | Volume/reactie |
| Water | 4,52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | ↑ 4,67 mM | 1,40 μL |
| 250 mM tris HCl, pH 7,5 | ↑ 23 mM | 1,40 μL |
| 300 mM KCl | * 27 mM | 1,33 μL |
| 50% glycerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 13 μl | ||
| Vlak voordat u buffer toevoegen: | ||
| Gegloeid sjabloononderdeel DNA: RNA (uit tabel 1) | 1 μL | |
| RNA-polymerase II | 1 μL | |
| * Uiteindelijke KCl-concentratie in de mix is ~ 50 mM, met extra KCl afkomstig van Pol II | ||
| De laatste MgCl2 -en tris HCl-concentraties zijn respectievelijk 5 mm en 25 mm, | ||
| De extra MgCl2 en tris HCl zijn afkomstig van gegloeid DNA: RNA-product. | ||
Tabel 3: Pol II mix
| Niet-template DNA-buffer | Eindconcentratie | Volume/reactie |
| Water | 4,48 μL | |
| 300 mM KCl | * 43,33 mM | 2,17 μL |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1,50 μL |
| 250 mM tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1,50 μL |
| 50% glycerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 14 μL | ||
| Vlak voordat u buffer toevoegen: | ||
| 5 μM Biotinylated non-template DNA oligo | 1 μL | |
| * Uiteindelijke KCl-concentratie in de mix is 50 mM, met extra KCl afkomstig van niet-template DNA oligo-buffer. | ||
Tabel 4: non-template DNA mix
| Pulse labeling buffer | Eindconcentratie | Volume/reactie |
| Water | 9,98 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,5 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | * 12 mM | 0,3 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 5 μL |
| 23 μL | ||
| Vlak voordat u buffer toevoegen: | ||
| 15 μM ATP | 0,6 μM | 1 μL |
| 3,3 μM [α-32P] UTP | 0,13 μM | 1 μL |
| * De uiteindelijke tris HCl-concentratie is 20mM, met extra tris HCl afkomstig van nucleotide-buffer. | ||
Tabel 5: Pulslabeling NTP mix
| Chase buffer | Eindconcentratie | Volume/reactie |
| Tris HCl, pH 7,5 | * 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| Water | 0,6 μL | |
| 50% glycerol | 3 | 0,3 μL |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 μL |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,15 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 1 μL |
| 3,5 μL | ||
| Vlak voordat u buffer toevoegen: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP verdund in 100 mM tris-HCl, pH 7,5 | 5 μM | 1,5 μL |
| * Alle tris HCl is afkomstig van nucleotide-buffer |
Tabel 6: Chase NTP mix
| Eindconcentratie | Volume/reactie | |
| Water | 24,21 μL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 10% PVA | 0,2% | 0,6 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 30 μl |
Tabel 7: Wasbuffer
| Eindconcentratie | Volume/reactie | |
| Water | 14,13 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 30 μL |
Tabel 8: basis transcriptie buffer (BTB)
| Stop buffer | Eindconcentratie | Volume/reactie |
| Water | 55,74 μL | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM | 0,6 μL |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 μL |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 μL |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 μL |
| 60 μL | ||
| Vlak voordat u buffer toevoegen: | ||
| 15 mg/mL glycogeen | 2 μL | |
| 20 mg/mL proteinase K | 2 μL | |
| Water | 30 μL | |
Tabel 9: stop mix
| Eindconcentratie | Volume/reactie | |
| Water | 11,9 μL | |
| 300 mM KCl | * 53,33 mM | 5,33 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 1,5 μM GTP verdund in 100 mM tris HCl, pH 7,5 | 50 μM | 1 μL |
| 100 eenheden/mL anorganische Pyrofosfatase, gist | 0,1 eenheden/reactie | 1 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | ↑ 16,67 mM | 0,5 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 29 μL | ||
| Vlak voordat u buffer toevoegen: | ||
| Capping enzym | 1 μL | |
| * Uiteindelijke KCl-concentratie in de mix is ~ 60 mM, met extra KCl afkomstig van capping enzym en pyrofosfatase | ||
| ^ De uiteindelijke tris HCl-concentratie is 20 mM, met extra tris HCl afkomstig van nucleotide-buffer | ||
Tabel 10: capping mix
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studies die zijn gericht op het ontleden van gebeurtenissen gekoppeld aan het Pol II rekcomplex zoals RNA verwerking en regulatie van de transcriptie verlenging zelf kunnen sterk worden vergemakkelijkt door het gebruik van een zeer gezuiverd enzymsysteem. Het opzetten van dergelijke enzym systemen kan een uitdaging zijn. Door de organisator afhankelijke transcriptie van Pol II zijn ten minste vijf algemene transcriptiefactoren vereist. Voorbereiding en inventarisatie van deze factoren kan maanden duren; Vandaar dat de snelheids begrenzings stap in dit proces vaak gewoon het cadre voorbereidt van transcriptiefactoren die nodig zijn om basale transcriptie in de reageerbuis te reconstitueren.
In dit artikel beschrijven we een aanpassing van de eerder ontwikkelde methoden voor het genereren van kunstmatige transcriptie rekwerk complexen2,3 met alleen gezuiverde Pol II en synthetische DNA en RNA oligonucleotiden. De resulterende rek complexen zijn transcriptioneel actief en zijn geschikt voor gebruik bij het onderzoeken van de koppeling van Pol II transcriptie en RNA capping5. Het is belangrijk op te merken dat transcriptie en RNA-capping optreden in vivo in de context van chromatine en vele andere eiwitten die niet aanwezig zijn in dit gedefinieerde enzymsysteem; Vandaar, dit systeem wordt verwacht te recapituleren veel, maar niet alle, kenmerken van reacties die in vivo optreden. Het protocol dat we beschrijven bouwt voort op eerdere methoden door het immobiliseren van kunstmatige rek complexen door biotinyleerd DNA gebonden aan magnetische kralen, waardoor de onderzoeker gemakkelijk te veranderen reactieomstandigheden en/of verwijderen van de grond nucleotiden tijdens verschillende stadia van de assays. Belangrijk is dat, omdat de tag die wordt gebruikt om rek-complexen te immobiliseren, zich aan het ene uiteinde van het niet-sjabloononderdeel van DNA bevindt, in plaats van op Pol II zelf of op het sjabloononderdeel, alleen die Pol IIs die is gekoppeld aan volledige rek complexen zullen worden bewaard op kralen.
Omdat ontluikende transcripties een 5 '-trifosfaat uiteinde moeten hebben om te worden gewijzigd door capping enzym, worden de synthetische RNA oligonucleotiden die worden gebruikt voor het afdekken van experimenten gekocht met 5 '-trifosfaat Termini. Niet-gemodificeerde RNA oligos kunnen echter worden gebruikt voor andere toepassingen, waaronder studies van andere co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen of de activiteiten van transcriptiefactoren die Pol II-rek reguleren. Ongeacht de downstream toepassing, raden wij aan om rek complexen te monteren met sterk gezuiverde DNA en RNA oligos. In het bijzonder moeten biotinyleerd DNA-oligos worden gezuiverd met HPLC, en andere DNA-en RNA-oligo's moeten worden gezuiverd door polyacrylamidegel elektroforese en/of HPLC. De zuiverheid van de enzymatische activiteiten zal echter per geval moeten worden bepaald en zal afhangen van de reikwijdte van elk experiment.
Het toevoegen van de niet-sjabloon biotinyleerd DNA oligo in de laatste stap van de assemblage moet in principe voldoende zijn om een ternaire complex te verkrijgen. We nemen echter altijd ten minste één "wandelende" stap om te bevestigen dat Pol II het juiste aantal nucleotiden bevat: als het doel van het experiment is om substraten te genereren voor het aszeggen van co-transcriptionele capping of andere RNA-verwerkingsstappen of om Pol II te volgen rek bevatten we altijd een 32P-gelabeld ribonucleotide in de eerste "Walk", zodat de transcriptie kan worden gevisualiseerd en zonder label "Cold" nucleotiden voor daaropvolgende loop stappen wordt gebruikt, zodat de specifieke activiteit van transcripten van verschillende lengtes blijft constant. Hoewel de in dit protocol beschreven methode 32P-gelabelde nucleotiden gebruikt om ontluikende transcripten te visualiseren, kan fluorescentie gebaseerde assays worden gebruikt om RNA-labeling te meten wanneer het niet mogelijk is om met radioactieve materialen te werken. Echter, het is belangrijk op te merken dat de gevoeligheid van dergelijke assays is meestal veel minder dan die met behulp van radioactieve labels, en ze meestal vereisen grotere hoeveelheden enzym.
Een belangrijke stap voor reproduceerbare experimenten is goed RNA-herstel tijdens Phenol: chloroform: isoamyl-extractie en ethanol precipitatie. We hebben ontdekt dat het gebruik van micro centrifugebuizen met high-density gels (Zie tabel van materialen) voor fenol: chloroform: isoamyl extractie verhoogt de reproduceerbaarheid en opbrengst van nucleïnezuur uit deze stap. Bovendien maakt het gebruik van gekleurde glycogeen (Zie tabel van materialen) als drager tijdens de neerslag van ethanol het gemakkelijker om kleine nucleïne zure pellets te zien, waardoor het minder waarschijnlijk is dat men onbedoeld de pellet verliest door het te aspireren tijdens het verwijderen van de ethanol supernatant.
Kunstmatige rek complexen gegenereerd met behulp van protocollen vergelijkbaar met die we beschrijven moeten ook nuttig zijn voor het meten van eiwit-eiwit of eiwit-nucleïnezuur interacties tussen de Pol II rek complex en factoren die transcriptie reguleren verlengings-of RNA-verwerkings gebeurtenissen gekoppeld aan rek. In dit geval, eiwitten die gebonden blijven aan kunstmatige rek complexen na het wassen worden gedetecteerd door Western blotting of massaspectrometrie; radiolabeling RNA is niet nodig en we doen alle transcriptie stappen met alleen "koude" nucleotiden.
Tot slot, deze methode kan worden gebruikt voor structurele analyses van transcriptie complexen. Er zijn inderdaad verwante methoden gebruikt in Cryo-EM-onderzoeken met gist en zoogdier enzymen om de capping enzym-Pol II-interacties13en interacties van Pol II met andere eiwitten of eiwitcomplexen tijdens rek12te reconstitueren, het onderbreken van16,17, en meest recent, gebonden aan een nucleosome18. Een mogelijke complicatie voor structurele analyses van transcriptie complexen die met deze methode worden gegenereerd, is de noodzaak om de Biotine/magnetische kralen uit het complex te verwijderen; Dit kan echter worden opgelost door in DNA-oligos specifieke sites te gebruiken die worden herkend door restrictie enzymen of door gebruik te maken van biotine-linkers die na UV-straal behandeling19zijn gespleten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken S. Shuman voor het leveren van het zoogdier capping enzym cDNA. Dit werk werd deels gesteund door een subsidie aan het Stowers Institute for Medical Research van het Helen Nelson Medical Research Fund bij de Greater Kansas City Community Foundation. Originele gegevens die aan dit manuscript zijn gelinkt, kunnen worden geraadpleegd vanuit de Stowers Original data repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D.
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
