Summary
Här beskriver vi sammansättningen av RNA-polymeras II (pol II) förlängning komplex som endast kräver korta syntetiska DNA och RNA oligonukleotides och renas pol II. Dessa komplex är användbara för att studera mekanismer bakom Co-transkriptionell behandling av utskrifter i samband med pol II-förlängningen komplex.
Abstract
Eukaryotisk mRNA syntes är en komplex biokemisk process som kräver transkription av en DNA-mall till en föregångare RNA av multi-subunit enzymet RNA-polymeras II och co-transkriptionella tak och skarvning av föregångaren RNA för att bilda den mogna mRNA. Under mRNA syntes, RNA-polymeras II töjning Complex är ett mål för reglering av en stor samling av transkriptionsfaktorer som kontrollerar dess katalytiska aktivitet, samt capping, skarvning, och 3 '-bearbetning enzymer som skapar den mogna mRNA. På grund av den inneboende komplexiteten i mRNA syntes, enklare experimentella system som möjliggör isolering och utredning av dess olika Co-transkriptionella stadier har stor nytta.
I den här artikeln beskriver vi ett sådant enkelt experimentellt system som lämpar sig för att undersöka Co-transcriptional RNA-capping. Detta system förlitar sig på definierade RNA-polymeras II förlängning komplex sammansatta från renad polymeras och konstgjorda transkription bubblor. När immobiliserade via en DNA, dessa RNA-polymeras II förlängning komplex ger ett lätt manipulerbara verktyg för dissekera Co-transkriptionella RNA tak och mekanismer genom vilka förlängningen komplexa rekryterar och reglerar tak enzym under Co-transkriptionella RNA-capping. Vi räknar med att detta system kan anpassas för att studera rekrytering och/eller montering av proteiner eller proteinkomplex med roller i andra stadier av mRNA mognad kopplad till RNA-polymeras II förlängning komplex.
Introduction
Eukaryotic Messenger RNA (mRNA) syntes är en utarbetad biokemisk process som innebär syntes av en obearbetad prekursor RNA av RNA-polymeras II och bearbetning av föregångaren RNA för att ge den mogna mRNA. RNA bearbetning steg av capping, skarvning, och polyadenylering utförs i stort sett Co-transkriptionellt. Pol II töjning Complex fungerar som en byggnadsställning som rekryterar och Iscensätt verksamheten i många av RNA-bearbetning enzymer. Följaktligen kommer vår ultimata förståelse för hur mogna eukaryota mRNAs genereras starkt beroende av utvecklingen av experimentella system för att tillåta dissektion av de biokemiska mekanismerna bakom rekryteringen till förlängningen komplex och reglering av enzymer som ansvarar för samtidig transkriptionell capping, skarvning och polyadenylering.
Inte överraskande har utvecklingen av sådana experimentella system varit svår. Ett stort hinder har varit den anmärkningsvärda komplexiteten i själva transkriptionen av pol II, där en enkel beredning av basal transkription av pol II in vitro kräver ett minimum av fem generella faktorer för initiering av transkription: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF och TFIIH 1. Dessutom krävs en ännu större uppsättning transkriptionsfaktorer och samregleringsmyndigheter för att rekonstituera någon form av reglerad pol II-transkription in vitro. Därför har ett stort mål varit att utveckla enklare experimentella system som möjliggör rekonstitution av aktiva pol II-förlängnings komplex som lämpar sig för utredningar av funktionell koppling av pol II transkription och RNA-bearbetning.
En sådan enklare metod för att återuppbygga aktiva pol II-förlängnings komplex har visat sig användbar för strukturella och biokemiska studier av vid förlängning pol II och, på senare tid, för undersökning av co-transkriptionella RNA-bearbetning2,3 ,4,5. I denna artikel visar vi hur pol II förlängnings komplex som framställts av renade pol II och syntetiska transkriptionsbubblor kan användas effektivt för att undersöka mekanismerna bakom Co-transkriptionella tak för begynnande pol II-utskrifter.
Capping hänvisar till kovalenta tillägg av en 5 '-guanosin "mössa" till 5 '-trifosfat slutet av begynnande pol II avskrifter. Locket är viktigt för efterföljande steg av mRNA mognad, transport, översättning, och andra processer6,7. GJP tillsätts Co-transkriptionellt till pol II-utskrifter av ett enzym som kallas för tak enzym. I däggdjursceller finns aktiva områden som ansvarar för RNA 5 '-trifosfatas och guanylyl transferas verksamhet av det tak enzym som ingår i en enda polypeptid8. Ett tak enzym rekryteras till pol II-förlängningen genom interaktioner med ännu inte definierade ytor på pol II-kroppen och Rpb1 karboxy-terminaldomänen (CTD) fosforyleras på Ser5 av dess heptapeptid upprepar5. I förlängningen komplex, det tak enzymet katalyserar tillsats av en 5 '-guanosin mössa när den begynnande avskriften når en längd av minst 18 nukleotider och har uppstått ur polymeras RNA Exit kanal. I det första steget av tak reaktionen hydrolyserar triphosphatase RNA 5 '-trifosfat att ge en 5 '-difosfat. I det andra steget hydrolyseras GTP till GMP av guanylyl transferase, som bildar ett GMP-tak enzym mellanliggande. Slutligen överför guanylyl transferas GMP till 5 '-difosfat slutet av den begynnande avskriften för att producera den gemensamma jordbrukspolitiken.
Ett anmärkningsvärt inslag i tak reaktionen är att co-transkriptionella tak (dvs., tak av utskrifter i samband med funktionella pol II förlängning komplex) är mycket effektivare än tak av fria RNA5,9. Således har en stor fråga på området varit hur denna dramatiska aktivering av tak uppnås via interaktioner av tak enzymet med pol II förlängning komplex. I detta protokoll beskriver vi monteringen av aktiva RNA-polymeras II-förlängnings komplex med endast renat RNA-polymeras II och konstgjorda transkribering bubblor. Dessa metoder möjliggör skapandet av RNA-polymeras II-förlängning komplex med utskrifter av definierad längd och sekvens. I en nyligen studie, vi använde dessa definierade RNA-polymeras II förlängning komplex som en modell för att undersöka aspekter av mekanismerna i RNA tak5. I synnerhet visade vi att (i) tak av RNA i samband med dessa förlängning komplex var mer än 100-faldig effektivare än tak av fritt RNA och (II) stimulerades av tfiih-beroende fosforylering av pol II CTD. Den metod som beskrivs här skulle i princip kunna anpassas för att generera substrat för att studera andra co-transkriptionella RNA-behandlingsreaktioner kopplade till pol II-förlängningen.
I avsnitt 1 i detta protokoll skapas konstgjorda förlängning komplex genom glödgning en syntetisk mall strand DNA oligonukleotid till en RNA-oligonukleotid som kompletterar vid dess 3 '-End till cirka 9 nukleotider av mallen strand DNA. Pol II lastas sedan på DNA: RNA duplex. Förlängningen är sedan avslutad genom tillsats av en delvis komplementär, icke-mall strand DNA oligonukleotid som är märkt med biotin vid dess 3 '-slut (figur 1 och figur 2A). RNA-oligonukleotiden förlängs av pol II i dessa förlängning komplex för att göra radiomärkta utskrifter av definierad längd och sekvens vid tillsättning av lämpliga kombinationer av radiomärkta nucleotides. Dessutom, med hjälp av en kombination av tvättar för att ta bort icke-inkorporerade nukleotider och ytterligare tillägg av olika kombinationer av nukleotider, kan man "Walk" pol II till olika positioner längs DNA-mall och syntetisera RNA av definierade längder. RNA renas sedan och utsätts för elektrofores i denaturering urea-PAGE Gels. I avsnitt 2 i protokollet används konstgjorda förlängnings komplex för att analysera Co-transkriptionella RNA-tak. Det exempel som presenteras mäter effekten av TFIIH-beroende fosforylering av pol II CTD på Co-transkriptionella RNA-capping. I detta experiment mäter vi omfattningen av co-transkriptionella tak som en funktion av tak enzym koncentration (5, 15 och 45 ng per reaktion) och tid (1, 2 och 4 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. montering av konstgjorda förlängnings komplex och pol II Walking
- Immobilize 1 nmol av icke-mall DNA oligo som innehåller en 3 ' biotin molekyl på magnetiska pärlor.
ANMÄRKNINGAR: följande steg kan göras i förväg för att förbereda för framtida experiment. Alla oligo-sekvenser som används i detta protokoll finns i tabell 1. RNA oligos syntetiseras med 5 '-trifosfat modifieringar.- Tillsätt 200 μL av de magnetiska pärlorna (10 mg/mL) till en 1,5 mL tub med låg proteinbindnings del och placera sedan på ett magnetiskt rack i 2 minuter.
- Medan röret är på magnet rack, ta bort vätskan från röret utan att störa pärlorna. För att tvätta pärlorna, ta bort röret från racket, tillsätt 1 mL 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, returnera röret till racket och ta bort tvättlösningen efter 2 min.
- REPEAT tvättar ytterligare 2 gånger med 200 μL av samma buffert.
- Omsuspendera magnetiska pärlor i 400 μL av 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, buffert. Blanda sedan med 380 μL av H2O och 20 μl 10 μm icke-mall biotinylerat DNA oligo. Placera röret på en nutator och inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta immobiliserade icke-Template DNA oligo 3 gånger med 200 μL av 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, och sedan 3 gånger med 200 μL av 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovint serum albumin.
- Lämna röret över natten vid 4 ° c för att avsluta blockerande pärlor med BSA.
- Nästa dag, placera röret i magnet rack, ta bort och kassera vätskan, och Omsuspendera pärlor i 200 μL av 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovint serum albumin och överföring till ett nytt rör. För denna DNA-mall är den slutliga koncentrationen cirka 5 μM.
Anmärkning: Inkubationstiden och oligo-koncentrationen måste bestämmas empiriskt för varje biotinylerat DNA oligo. Denna mall bör ge tillräckligt för 200 reaktioner, och pågå i minst 6 månader vid förvaring vid 4 ° c.
- Anneal RNA och DNA-mall strand oligonukleotidoligos i en 2:1 molar förhållande (20 och 10 pmol, respektive) för att få DNA: RNA duplex.
- Ställ in en 10 μL glödgningsblandning enligt beskrivningen i tabell 2.
10 μl glödgnings blandning räcker till 10 reaktioner. Glödgning blandningen kan skalas upp vid behov om fler analyser ska utföras. - Utför glödgningreaktioner i en termisk apparat med hjälp av följande program: 5 min vid 45 ° c, följt av 12 cykler av 2 min vardera, med början vid 43 ° c och minska temperaturen 2 ° c per cykel. Tomgång vid 4 ° c.
Anmärkning: Detta är en flexibel timepoint. Glödgning är klar inom ~ 30 min men kan lämnas vid 4 ° c under en längre tid. I labbet, glödgning blandningar har lämnats sittande för upp till 4 h utan att iaktta någon minskning av reaktions effektiviteten. - Medan glödgning RNA till mallen programområde DNA, förbereda buffertar för senare steg i protokollet. De ingredienser som behövs för att förbereda varje buffert för en enda reaktion med varje buffert listas i tabellerna 2 till 8. Skala upp recept med faktorn [Y (X + 1) + 1] för tvätt och (X + 1) för alla andra buffertar. X = antal reaktioner som skall beredas; Y = antal tvätts steg som behövs (minimum 3).
Observera: Förbered alla buffertar färskt dagen för experimentet. Placera inte rören på isen efter att PVA har lagts till buffertar. Lägg till pol II eller nukleotider till buffertar precis innan du använder.
- Ställ in en 10 μL glödgningsblandning enligt beskrivningen i tabell 2.
- Lasta renat RNA-polymeras II på DNA: RNA-hybrid.
- Blanda 1 pmol (1 μL) DNA: RNA Duplex med 13 μL pol II buffert (från tabell 3).
- Tillsätt ~ 0,02 enheter av renat RNA-pol II (1 μL) till blandningen från steg 1.3.1 och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ner och omrörning med Pipettera spets, utan att införa bubblor. Inkubera i 10 minuter vid 30 ° c.
Anmärkning: Volymer som ges härifrån är för en enda reaktion; skala upp efter behov för antalet reaktioner i experimentet. RNA-pol II renat från rått levern enligt beskrivningen10 används i detta exempel; RNA-pol II som renas från andra källor, inklusive odlade däggdjursceller eller jäst kan också användas3,4,5,11,12,13.
- Komplettera förlängningen komplex genom tillsats av en icke-Template DNA.
- Tillsätt 5 pmol (1 μL) immobiliserat icke-MALLSDNA oligo till 14 μL icke-mallsdna-buffert (från tabell 4), Lägg i röret från steg 1.3.2 och inkubera i 10 min vid 37 ° c.
- Placera provet i magnet rack i 2 min. Tvätta 1x med 30 μL tvättbuffert (från tabell 7) för att avlägsna icke inkorporerade pol II och oligos.
- Generera förlängnings komplex som innehåller radioaktivt märkt RNA 23mers.
- Utför alla ytterligare inkuberingar vid 30 ° c. Tillsätt 1 μL av 15 μM ATP och 10 μCi (1 μL) av [α-32P] UTP (3 000 CI/mmol) till 23 μl pulsbuffert och Använd detta för att Omsuspendera tvättade magnetiska pärlor.
Försiktighet: Radioaktivt material är farligt. Se till att använda lämplig skyddsutrustning och att följa alla labb riktlinjer för säker användning och bortskaffande av radioaktivt material.
Anmärkning: Ersätt radioaktivt märkt UTP med 15 μm UTP när radioaktivt märkt RNA inte behövs, till exempel för västerländska blot experiment. - Inkubera reaktionen i 10 minuter för att möjliggöra syntesen av radioaktivt märkt 23mers.
- Tillsätt 1,5 μL lösning innehållande 100 μM ATP och 100 μM UTP mix till 3,5 μL av Chase buffert, Lägg till röret innehåller förmonterade tupp komplex, och inkubera i 5 min att jaga alla begynnande utskrifter i 23mers.
- Placera provet i magnetiskt rack i 2 min, ta bort supernatanten, tvätta en gång med 30 μL tvättbuffert för att avlägsna icke-inkorporerade nukleotider och Omsuspendera i 30 μL tvättbuffert.
- Antingen tillsätt 94 μl av stopp blandningen med proteinas K och glykogen (tabell 9) för att avsluta reaktioner eller gå vidare till avsnitt 1,6 för att generera förlängnings komplex med längre utskrifter eller avsnitt 2 för att utföra tak-analyser.
- Utför alla ytterligare inkuberingar vid 30 ° c. Tillsätt 1 μL av 15 μM ATP och 10 μCi (1 μL) av [α-32P] UTP (3 000 CI/mmol) till 23 μl pulsbuffert och Använd detta för att Omsuspendera tvättade magnetiska pärlor.
- Valfritt Walk pol II för att göra 23, 25 och 29 nukleotidavskrifter
- Följ proceduren som beskrivs i steg 1.2.1 till 1.5.4 för att förbereda förlängnings komplex som innehåller radiomärkade 23mers. Skala upp 4-faldigt för att generera 120 μL av tvättade förlängning komplex, vilket är tillräckligt komplex för 4 reaktioner.
- Etikett 3 nya tuber "23mer", "25mer" och "29mer". Överför 30 μL av de tvättade förlängnings komplexen till "23mer"-röret och tillsätt 94 μL stopp blandning med proteinas K och glykogen.
- Placera röret som innehåller de återstående 90 μL av tvättade förlängning komplex i magnet rack för 2 min, ta bort supernatanten, och Omsuspendera pärlor i 90 μL BTB kompletterat med 1,2 μL vardera av 1,5 mM ATP och 1,5 mM CTP. Inkubera i 10 minuter vid 30 ° c.
- Efter tvättning en gång med 90 μL av tvättbuffert och resuspenering i 90 μL av tvättbuffert enligt beskrivningen i steg 1.5.4, överför 30 μL av förlängnings komplexen till "25mer"-röret och tillsätt 94 μL stopp blandning med proteinas K och glykogen.
- Placera röret som innehåller de återstående 60 μL av förlängning komplex i magnet rack för 2 min, ta bort supernatanten, och Omsuspendera pärlor i 60 μL BTB kompletterat med 0,8 μL vardera av 1,5 mM ATP och 1,5 mM CTP.
- Inkubera i 10 min vid 30 ° c, tvätta en gång med 60 μL tvättbuffert enligt avsnitt 1.5.5 och Omsuspendera i 60 μL tvättbuffert.
- Överför 30 μl från 2x provet till "29mer"-röret och tillsätt antingen 94 μl stopp blandning med proteinas K och glykogen eller Fortsätt till avsnitt 2 för att utföra tak-analyser.
- Fortsätt till RNA-rening och-analys (avsnitt 3).
2. använda konstgjorda förlängning komplex till assay Cotranscriptional capping
- Generera tvättade förlängnings komplex som innehåller 23mers genom att skala upp proceduren som beskrivs i steg 1.2.1 till 1.5.5 13-faldigt. Detta är tillräckligt för 12 reaktioner + 1 extra.
-
Pol II CTD fosforylering
- Placera röret som innehåller tvättade förlängning komplex i magnet rack för 2 min, ta bort supernatanten, och Omsuspendera pärlor i 377 μL av BTB kompletteras med 13 μL av 1,5 mM ATP.
- Förbered två nya rör, märkt + H och-H, respektive. Till röret märkt + H tillsätt 3 μL av ~ 300 ng/μL TFIIH, och till röret märkt-H tillsätt 9 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovint serum albumin.
Anmärkning: Vi använder vanligtvis tfiih renas från råtta lever, men vi har fått liknande resultat med ~ 0,6 μg/reaktion av kommersiellt tillgängliga rekombinant Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, som är Kinas modul från tfiih). Se tabell över material för information. - Tillsätt 87 μL av de tvättade förlängnings komplexen från steg 2.2.1 till röret märkt + H och 270 μL av tvättade förlängnings komplex till röret märkt-H. Inkubera 10 min vid 30 ° c.
- Placera provet i magnet rack i 2 min. För att avlägsna överskott av nukleotider och obundet protein, tvätta förlängnings komplex i + H och-H reaktioner med 90 μL eller 270 μL av tvättbuffert, respektive.
-
RNA-tak
- Omsuspendera förlängnings komplex i röret märkt + H i 87 μl av tak mix (BTB kompletteras med 50 μm GTP (tabell 10). Omsuspendera förlängnings komplex i röret märkt-H i 261 μl av tak blandning.
- Förbered 4 nya tuber märkta 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Späd tak enzym (CE) i 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL bovint serum albumin för beredning av lösningar som innehåller 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL, eller 45 ng CE/μL och dispensera 3 μL av lämplig lösning i vardera av de 4 rören.
- Bered 12 nya tuber med 94 μL stoppbuffert (2.1.1) som tillsätts varje.
- Börja varje tak reaktion genom att tillsätta 87 μl av förlängning komplex behandlas med tfiih eller inte märkta rör som innehåller tak enzym. Inkubera vid 30 ° c i ett värmeblock.
- Efter 1, 2 eller 4 min, Avbryt reaktionerna genom att överföra 30 μL av varje reaktionsblandning till rör som innehåller 94 μL stoppbuffert. Rena och analysera reaktionsprodukter enligt beskrivningen i avsnitt 3.
3. RNA rening och analys
- Rena RNA
- Inkubera reaktionsprodukter i stoppbuffert i 20 minuter vid rumstemperatur.
Anmärkning: Pausar punkt. Proverna i denna buffert har bibehållits i upp till 4 timmar utan förlust eller försämring av RNA. - Extrahera en gång med 124 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1) och en gång med kloroform: isoamylalkohol (24:1).
Försiktighet: Fenol är extremt giftigt och absorberas snabbt av huden. Använd lämplig skyddsutrustning.
Anmärkning: För att maximera återhämtningen av RNA under utvinning, använda kommersiellt tillgängliga rör som innehåller en hög densitet gel, som bildar en stabil barriär mellan vatten-och organiska faser. Se diskussion och tabell över material. - Överför vattenfasen (översta lagret) till nya rör som innehåller 12,4 μL 3 M natriumacetat pH 5,2.
- Inkubera reaktionsprodukter i stoppbuffert i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Etanol nederbörd
- Tillsätt 350 μL 100% etanol och blanda noggrant med inversion.
- Inkubera i minst 10 minuter på torris.
Anmärkning: Pausar punkt. För enkelhetens skull, kan man stanna här och slutföra förfarandet på nästa dag; Det är dock möjligt att gå direkt till steg 3,3 och köra gelen på samma dag. RNA kan hållas vid-80 ° c för ett par dagar innan vidare bearbetning, men inte lämna för längre tid.
- Förbereda RNA prover för gel elektrofores
- Tillåt prover att Tina, blanda genom att invertera 2-3 gånger, och centrifugera för 15 min vid 21 000 x g, 4 ° c, i en bordsskiva centrifug. Under tiden, inrätta denaturerande gel mix (avsnitt 3.4.1).
- Ta försiktigt bort etanol från prover utan att störa pelleten.
- Tillsätt 500 μL 70% etanol, Invertera röret ett par gånger för att tvätta pellets, och sedan Centrifugera igen vid 21 000 x g i 5 min vid antingen rumstemperatur eller 4 ° c.
- Ta bort så mycket etanol som möjligt och gör en snabb spinn (5-10 s) av rören i en bordsskiva centrifug. Sedan, med en gel-loading spets, ta bort den sista kvarvarande volymen av etanol.
- Lufttorka pelleten i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Lös upp RNA genom att tillsätta 4 μL H2O överst på varje pellet. Inkubera 5 minuter i rumstemperatur.
- Tillsätt 4 μL 2x RNA-färg (se tabell över material) till mixen, och sedan Vortex varje rör i ett par sekunder för att helt Omsuspendera RNA.
Anmärkning: RNA-färg som innehåller formamid istället för urea rekommenderas, eftersom den senare fälls ut vid låga temperaturer. - Quick-snurra rören, och sedan Inkubera dem vid 70 ° c i 10 min i ett värmeblock.
-
Förvara rören på torris tills de är redo att lasta på gelen.
Notera: att hålla RNA på torris tillåter flexibiliteten att arbeta med andra experiment medan gelen är polymeriserande. Proverna behöver inte värmas upp efter upptinning. Men, RNA kan laddas direkt efter upphettning om gelen är redo att köra.
- Förbereda urea-PAGE gel
- För 40 mL gel mix, kombinera i en 50 mL koniskt rör: 16,7 g urea, 15 mL av 40% BIS: akrylamidlösning (19:1 ratio), 4 mL 10X TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumborat, 20 mM EDTA), och 8 mL H2O. Denna volym är tillräcklig för en standardstorlek gel (18 cm höjd x 16 cm Bredd) med 1,0 mm distaner.
Försiktighet: Akrylamid är extremt giftigt. Även om det inte finns någon inhalations risk när den är i lösning, Använd alltid labbrock, handskar och skyddsglasögon vid hantering.
Anmärkning: Denna blandning är för gjutning en denaturering 15% polyakrylamidgel, som lätt löser RNA mellan 15-50 NT. ändra koncentrationen av BIS/akrylamid som behövs för att lösa olika RNA-utskrifter av olika längder. - Placera slutet rör som innehåller gel mix på en nutator tills urea är helt upplöst.
- Ställ upp gel-gjutning station med glasplattor, 1 mm distaner och en 15-brunn kam.
- Arbeta snabbt, tillsätt 40 μL TEMED och 400 μL av 10% ammoniumpersulfatlösning till gel lösning och blanda väl. Med hjälp av en 25 mL pipet, häll gel lösning mellan plattorna, infoga kam, och låt gelen att polymerisera i minst 2 h.
Anmärkning: Om gelen hälls mer än 2 h före användning, när den har polymeriserat täcka den med fuktig pappershandduk (lämnar kam på plats) och Linda med plastfolie för att förhindra att den torkar ut.
- För 40 mL gel mix, kombinera i en 50 mL koniskt rör: 16,7 g urea, 15 mL av 40% BIS: akrylamidlösning (19:1 ratio), 4 mL 10X TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natriumborat, 20 mM EDTA), och 8 mL H2O. Denna volym är tillräcklig för en standardstorlek gel (18 cm höjd x 16 cm Bredd) med 1,0 mm distaner.
- Denaturering gel RNA elektrofores
- Efter polymerisation, överföra gel till rinnande tank och Pre-Run det på 20 mA i 1x TBE för 15-30 min.
- Under tiden, Tina prover (om fryst), Vortex, och snurra dem för 4 min vid 2 000 x g, 4 ° c.
- När du är klar, Stäng av strömförsörjningen och skölj noggrant varje brunn med 1x TBE med en spruta.
- Använd gel-loading tips för att ladda prover på gelen.
- Kör gel vid en konstant 20-30 mA för ca 2 h eller tills lägre färg (xylen cyanol FF) når botten av gelen.
- Ta bort gelen, placera den på en bit av absorberande papper och Linda med plastfolie.
- Exponera den radiomärkade gelen till en fosforscreen.
- Skanna fosforscreen med hjälp av en phosphorimager och analysera bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurerna 2 och 3 visar representativa resultat reaktioner som används för att generera konstgjorda förlängnings komplex som innehåller utskrifter av olika längder genom att utvidga eller pol II från olika källor. Figur 4 visar hur dessa förlängning komplex kan användas för att analysen Co-transkriptionella CTD fosforylering-beroende RNA-tak.
Figur 2A är ett diagram över DNA-och RNA-molekyler i konstgjorda förlängnings komplex. Figur 2b visar utskrifter av olika längd som genereras i reaktioner utförda exakt som beskrivs i protokoll 1, där de inledande konstgjorda tånande komplexen bereddes med hjälp av ett syntetiskt RNA oligo på 20 NT (mörkblå i figur 2A ; RNA_20mer, tabell 1). Eftersom vi vet start RNA längd och DNA-mall sekvens, kan vi bestämma delmängd av nukleotider-ATP, CTP, GTP, eller UTP-nödvändigt att gå pol II till en definierad position längs mallen. Antalet nyligen syntetiserade nukleotider läggs till Start storleken av RNA oligonukleo tid primer för att bestämma den slutliga förväntade längden (RNA oligo storlek + antal nukleotider till). I närvaro av ATP och UTP, kan pol II lägga till 3 NT till 20 NT RNA oligo att generera förlängning komplex som innehåller en 23mer RNA. Om man tvättar bort oinkorporerade ATP och UTP och sedan lägger ATP och CTP, den 20 NT oligo förlängs med 2 NT för att göra en 25mer, och om man sedan igen tvättar bort oinkorporerade nukleotider och tillägger ATP och GTP, är avskriften utvidgas ytterligare 4 NT att göra en 29mer. synd CE de nygenererade utskrifter motsvarar den förväntade RNA-storlek och eftersom nästan alla av radioaktivt märkt 23mers kan kvantitativt jagade in längre produkter, vet man att använda denna metod (i) RNA oligo är korrekt placerad vid pol II utgång kanal under monteringen och (II) radiomärkta RNAs är förknippade med aktiva pol II-förlängnings komplex.
I figur 2C visas en variant av protokollet, där start förlängnings komplexen bereds med hjälp av samma DNA-mall och icke-mall-programområde oligos och ett RNA oligo (RNA_29mer, tabell 1) som innehåller ytterligare 9 nukleotider vid dess 5 '-End men är i övrigt identisk i sekvens med 20 NT RNA oligo. Eftersom start-RNA-längden är 29 NT i detta fall, kan förlängnings komplex som innehåller 32mer, 34mer och 38mer-utskrifter genereras med samma pol II-gångsteg som beskrivs ovan.
Beroende på analyens omfattning medger denna metod flexibilitet i källan till pol II. I figur 3 jämför vi reaktionerna med hjälp av pol II från olika källor. I de reaktioner som visas i de första 4 körfält, konstgjorda förlängning komplex var sammansatta med endogena, vild typ pol II renas från antingen råtta lever eller fission jäst och gick som beskrivs ovan för att generera 23mers eller 25mers. Råtta och fission jäst pol IIs används i dessa reaktioner renades till nära homogenitet med hjälp av flera kromatografiska steg.
Metoden kan också användas för att generera konstgjorda förlängnings komplex som innehåller vildtyp eller mutant pol II förberett med en enkel reningsmetod i ett steg. De två sista körfält i figuren visar analyser utförs med hjälp av en mutant form av Human pol II som saknar CTD i sin Rpb1 subunit, som inte krävs för pol II katalytisk aktivitet men hjälper till par transkription till RNA-tak. Den CTD-less pol II används i dessa analyser renades av anti-flagga Immuno-rening från en mänsklig cellinjer som uttrycker en flagga epitop taggade version av Rpb1. Det är viktigt att notera att koncentrationen av aktiv pol II kommer att variera från förberedelse till beredning. Det är därför viktigt att utföra initiala experiment där mängden pol II som används i reaktionerna varierar för att bestämma det belopp som behövs för att uppnå önskad aktivitet.
Figur 4 visar ett representativt exempel på en analys som jämför tak av radioaktivt märkta utskrifter i samband med konstgjorda förlängnings komplex som innehåller pol II med antingen en fosforylerad eller ofosforylerad CTD. För dessa analyser utarbetades förlängnings komplex som innehåller 23 nukleotidtranskriptioner med en 5-trifosfat-ände enligt beskrivningen i protokoll 2.
Inkubation av förlängning komplex med tak enzym leder till en rörlighet förskjutning av ca 1 NT, vilket indikerar tillsats av en 5 ' Cap14, 15. För att kvantifiera tak reaktioner, en bestämmer tak effektivitet, uttryckt som procent av RNA som är maximerad. Capping effektivitet är förhållandet mellan utjämnat RNA till totalt RNA, dividerat med maximalt erhållas capping. I våra analyser finner vi den maximala erhållas tak av RNA oligos erhålls från kommersiella källor är ~ 85%, sannolikt på grund av ofullständig trifosforylering av syntetiskt RNA.
I de reaktioner som visas i de första 3 körfält, var förlängning komplex inkuberas med den allmänna transkriptionsfaktorn TFIIH och co-Factor ATP att fosforylera pol II CTD före capping. I dessa reaktioner, nära maximal tak observerades ~ 1 min efter tillsats av 5 ng av tak enzym. När analyser utfördes med hjälp av förlängning komplex som inte inkuberas med tfiih och därmed innehåller unphospforylated pol II, det tog nästan 10 gånger så mycket tak enzym att iaktta liknande nivåer av tak. De sista två körfält i figur 4 visar de produkter av reaktioner där förlängning komplex inkuberas med eller utan tak enzym, i närvaro av tfiih. Viktigt, TFIIH-beroendet av co-transkriptionella tak konstgjorda förlängning komplex visat i denna siffra är mycket lik den som observerats i förlängning komplex som hade inlett transkription vid en promotor i mer komplexa enzymsystem 5.
Figur 1: montering av konstgjorda förlängnings komplex. (A) RNA oligo (mörkblå) av 20 NT glödgas till en DNA-mall (grön) genom en kompletterande sekvens av 9 NT.BRNA-polymeras II (pol II) blandas med glödgat DNA: RNA-hybrid för att placera RNA 3-änden vid pol II-katalytisk plats. C) ett molar överskott av 3 ' biotinylerad icke-MALLSDEL-DNA oligo (ljusblå) tillsätts till reaktionsblandningen för att omsluta och ytterligare stabilisera förlängnings komplexet. D) immobiliserade förlängnings komplex tvättas för att avlägsna överskott av oligos och inkuberas med lämpliga kombinationer av nukleotider för att ge pol II möjlighet att förlänga RNA-öligo till önskad längd. Den nyligen syntetiserade delen av RNA visas i gult. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Pol II Walking använder RNA oligos av olika längder. (A) diagram över konstgjorda förlängnings komplex, som visar nukleotider som tillkommit under promenader. Icke-mall strand och mall programområde DNA visas i ljusblå respektive grön. 20 NT RNA oligo visas i mörkblått. Också visat är nukleotider läggas till under successiva promenader för att generera 23mer RNA (orange), 25mer RNA (brun), och 29mer RNA (magenta). B) denaturerande gel-elektrofores som visar rnas av definierad längd som erhålls efter Walking pol II med hjälp av en 20 NT RNA-primer, enligt beskrivningen i protokoll 1. Nukleotider som tillsätts under varje sekventiell gång steg i protokollet är färgkodade orange (23mer), brun (25mer) och magenta (29mer). C) pol II-gång som börjar med en 29 NT RNA-primer, men i övrigt exakt som den som visas i b. (b och C) visar delar av samma gel men separerades i illustrativt syfte. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: transkriptioner som syntetiseras av konstgjorda förlängnings komplex som innehåller vildtyp eller mutant pol II. Konstgjorda förlängnings komplex monteras med hjälp av 20 NT RNA-primer och höggradigt renade endogena pol II från råttlever eller fission jäst eller flagga immunopurified pol II saknar Rpb1 från HeLa celler (F: Rpb1-ΔCTD). RNA i varje komplex förlängdes ytterligare till 23 NT eller 25 NT. Se text för mer information. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fosforylering-beroende aktivering av co-transkriptionella RNA-capping. Konstgjorda förlängning komplex som innehåller råtta lever pol II och radioaktivt märkt 23mer RNA inkuberades med ATP och den allmänna transkriptionsfaktorn TFIIH eller buffert för 10 min att fosforylera pol II CTD. Efter tvättning, töjning komplex inkuberades med 5 ng, 15 ng, eller 45 ng av däggdjurs tak enzym för 1, 2 eller 4 min. utjämnade och icke-utjämnade 23mers löstes i en denaturerande gel (topp, första 12 banor) och% utjämnade RNA kvantifierades och plottas (botten). Denna del av figuren publicerades ursprungligen i ref 5, som publicerades som en Open Access-artikel under en CC-by-licens. De två sista körfält, som kommer från ett separat experiment, illustrerar produkter av reaktioner där förlängning komplex inkuberas med eller utan tak enzym, i närvaro av tfiih. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sekvens | Kommentarer | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifiering; SIDA & RP-HPLC renat |
| RNA_29mer | ACUCUAUGACUCUUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifiering; SIDA & RP-HPLC renat |
| Mall programområde DNA | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA TTAAGCATCATGG |
Dual PAGE & HPLC renat |
| Icke-mall programområde DNA | ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG | 5 ' TEG-biotinylated; HPLC renat |
Tabell 1: DNA-och RNA-oligonukleotider
| Slutliga koncentrationen | Volym | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM * | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 μL |
| 10 μM malldel DNA oligo i 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | 1 μM | 1 μL |
| 10 μM RNA oligo i 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 μM | 2 μL |
| Vatten | 4,33 μL | |
| 10 μL | ||
| * Alla Tris-HCl kommer från DNA och RNA oligo Solutions | ||
Tabell 2: cocktail för glödgning av DNA och RNA oligos
| Pol II-buffert | Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion |
| Vatten | 4,52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | ^ 4,67 mM | 1,40 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | ^ 23 mM | 1,40 μL |
| 300 mM KCl | * 27 mM | 1,33 μL |
| 50% glycerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 13 μl | ||
| Precis innan du använder buffert tillägga: | ||
| Glödgad mall strand DNA: RNA (från tabell 1) | 1 μL | |
| RNA-polymeras II | 1 μL | |
| * Final KCl koncentration i mixen är ~ 50 mM, med ytterligare KCl kommer från pol II | ||
| ^ De slutliga koncentrationerna av MgCl2 och Tris HCl är 5 mm respektive 25 mm. | ||
| Ytterligare MgCl2 och Tris HCl kommer från GLÖDGAD DNA: RNA produkt. | ||
Tabell 3: Pol II-blandning
| Icke-mall DNA-buffert | Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion |
| Vatten | 4,48 μL | |
| 300 mM KCl | * 43,33 mM | 2,17 μL |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1,50 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1,50 μL |
| 50% glycerol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 14 μL | ||
| Precis innan du använder buffert tillägga: | ||
| 5 μM Biotinylerat icke-mall-DNA oligo | 1 μL | |
| * Slutlig KCl koncentration i mixen är 50 mM, med ytterligare KCl kommer från icke-mall DNA oligo buffert. | ||
Tabell 4: icke-mall-DNA-blandning
| Puls märkning buffert | Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion |
| Vatten | 9,98 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,5 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | * 12 mM | 0,3 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 5 μL |
| 23 μL | ||
| Precis innan du använder buffert tillägga: | ||
| 15 μM ATP | 0,6 μM | 1 μL |
| 3,3 μM [α-32P] UTP | 0,13 μM | 1 μL |
| * Slutlig Tris HCl koncentration är 20mM, med ytterligare Tris HCl kommer från nukleotidbuffert. | ||
Tabell 5: puls märkning av NTP-mix
| Chase buffert | Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion |
| Tris HCl, pH 7,5 | * 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| Vatten | 0,6 μL | |
| 50% glycerol | 3 | 0,3 μL |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 μL |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,15 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 1 μL |
| 3,5 μL | ||
| Precis innan du använder buffert tillägga: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP utspädd i 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 μM | 1,5 μL |
| * Alla Tris HCl kommer från nukleotidbuffert |
Tabell 6: jaga NTP-mix
| Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion | |
| Vatten | 24,21 μL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 10% PVA | 0,2% | 0,6 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 30 μl |
Tabell 7: tvättbuffert
| Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion | |
| Vatten | 14,13 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 30 μL |
Tabell 8: grundläggande transkription buffert (BTB)
| Stoppbuffert | Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion |
| Vatten | 55,74 μL | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM | 0,6 μL |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 μL |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 μL |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 μL |
| 60 μL | ||
| Precis innan du använder buffert tillägga: | ||
| 15 mg/mL glykogen | 2 μL | |
| 20 mg/mL Proteinase K | 2 μL | |
| Vatten | 30 μL | |
Tabell 9: sluta blanda
| Slutliga koncentrationen | Volym/reaktion | |
| Vatten | 11,9 μL | |
| 300 mM KCl | * 53,33 mM | 5,33 μL |
| 50% glycerol | 3 | 1,8 μL |
| 1,5 μM GTP utspädd i 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 μM | 1 μL |
| 100 enheter/mL oorganiskt Pyrofosfatas, jäst | 0,1 enheter/reaktion | 1 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | ^ 16,67 mM | 0,5 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 μL |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 29 μL | ||
| Precis innan du använder buffert tillägga: | ||
| Capping enzym | 1 μL | |
| * Slutlig KCL koncentration i mixen är ~ 60 mm, med ytterligare KCL kommer från tak enzym och pyrofosfatas | ||
| ^ Slutlig Tris HCl koncentration är 20 mM, med ytterligare Tris HCl kommer från nukleotidbuffert | ||
Tabell 10: capping blandning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier som syftar till att dissekera händelser kopplade till pol II förlängning komplex såsom RNA-bearbetning och reglering av avskriften förlängning kan i hög grad underlättas genom användning av ett mycket renat enzymsystem. Att inrätta sådana enzymsystem kan vara utmanande. Promotorn-beroende transkription av pol II kräver minst fem generella transkriptionsfaktorer. Förbereda och lagra dessa faktorer kan ta månader; Därför är det hastighetsbegränsande steget i denna process ofta helt enkelt förbereder Kader av transkriptionsfaktorer som behövs för att återuppbygga basal transkription i provröret.
I denna artikel beskriver vi en anpassning av tidigare utvecklade metoder för att generera konstgjorda transkriptionsförlängning komplex2,3 med endast renad pol II och syntetiska DNA och RNA oligonukleotides. De resulterande förlängningen komplexen är transkriptionellt aktiva och är lämpliga för användning vid utredning av kopplingen av pol II transkription och RNA-tak5. Det är viktigt att notera att transkription och RNA-tak förekommer in vivo i samband med kromatin och många andra proteiner som inte finns i detta definierade enzymsystem; Därför är detta system förväntas recapitulate många, men inte alla, funktioner av reaktioner som sker in vivo. Det protokoll som vi beskriver bygger på tidigare metoder genom att immobilisera konstgjorda förlängnings komplex genom en DNA bundet till magnetiska pärlor, vilket gör det möjligt för forskaren lätt att ändra reaktions förhållanden och/eller ta bort icke inkorporerade nukleotider under olika stadier av analyser. Viktigt, eftersom taggen används för att immobilisera förlängning komplex är i ena änden av den icke-mall sträng av DNA snarare än på pol II själv eller på mallen strand, endast de Pol IIs i samband med fullständig förlängning komplex kommer att behållas på pärlor.
Eftersom begynnande avskrifter måste ha en 5 '-trifosfat-ände för att kunna modifieras med ett tak enzym, köps de syntetiska RNA-oligonukleotiderna som används för att cappera experiment med 5 '-trifosfat Termini. Men oförändrade RNA-oligos kan användas för andra tillämpningar, inklusive studier av andra co-transkriptionella RNA-behandling händelser eller verksamhet transkriptionsfaktorer som reglerar pol II förlängning. Oavsett nedströmsapplikationen rekommenderar vi att man monterar förlängnings komplex med höggradigt renat DNA och RNA-oligos. Framför allt bör biotinylerade DNA-oligos renas med HPLC, och andra DNA-och RNA-oligos bör renas genom polyakrylamidgelelektrofores och/eller HPLC. Den enzymatiska verksamhetens renhet måste dock bestämmas från fall till fall och bero på omfattningen av varje experiment.
Att lägga till icke-mall en DNA oligo i det sista steget i monteringen bör i princip vara tillräckligt för att få en ternära komplex. Vi har dock alltid minst en "Walking" steg för att bekräfta pol II innehåller rätt antal nukleotider: om målet med experimentet är att generera substrat för testmetoder Co-transkriptionella tak eller andra RNA bearbetning steg eller att följa pol II förlängning, vi inkluderar alltid en 32P-märkt ribonucleotiden i den initiala "Walk" så att avskriften kan visualiseras och använda omärkta "kalla" nukleotider för efterföljande gång steg så den specifika aktiviteten av utskrifter av olika längder förblir konstant. Även om den metod som beskrivs i detta protokoll använder 32P-märkta nukleotider för att visualisera begynnande utskrifter, kan fluorescensbaserade analyser användas för att mäta RNA-märkning när det inte är möjligt att arbeta med radioaktiva material. Emellertid, det är viktigt att notera att känsligheten hos sådana analyser är typiskt mycket mindre än de som använder radioaktiva etiketter, och de brukar kräva större mängder av enzym.
Ett avgörande steg för reproducerbara experiment är bra RNA återhämtning under fenol: kloroform: isoamylextraktion och etanol nederbörd. Vi har funnit att använda microcentrifug rör som innehåller hög densitet geler (se tabell över material) för fenol: kloroform: isoamyl utvinning ökar reproducerbarhet och avkastning av nukleinsyra från detta steg. Dessutom, användningen av färgade glykogen (se tabell över material) som bärare under etanol nederbörd gör det lättare att se små nukleinsyra pellets, vilket gör det mindre troligt att en oavsiktligt förlorar pelleten av aspirera det under avlägsnande av etanol supernatanten.
Konstgjorda förlängning komplex som genereras med hjälp av protokoll som liknar dem som vi beskriver bör också vara användbara för att mäta protein-protein eller protein-nukleinsyra interaktioner mellan pol II förlängning komplex och faktorer som reglerar avskrift förlängning eller RNA-bearbetning händelser kopplade till förlängning. I detta fall, proteiner som förblir bundna till konstgjorda förlängning komplex efter tvättning upptäcks genom Western blotting eller masspektrometri; radiolabeling RNA är inte nödvändigt och vi gör alla transkription steg med endast "kalla" nukleotider.
Slutligen skulle denna metod kunna användas för strukturella analyser av transkriptionskomplexen. Relaterade metoder har faktiskt använts i Cryo-EM-studier med jäst och däggdjurs enzymer för att bereda tak för enzym-pol II-interaktioner13, och interaktioner mellan pol II och andra proteiner eller proteinkomplex under förlängningen12. pausar16,17, och senast, bunden till en nukleosome18. En möjlig komplikation för strukturella analyser av transkriptionskomplex som genererats med denna metod är behovet av att avlägsna de biotin/magnetiska pärlorna från komplexet. emellertid, detta kan lösas genom att inkludera i DNA oligos specifika platser som erkänts av restriktionsenzymer eller genom att använda biotin Linkers som är klyvs av efter UV-behandling19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar S. Shuman för att tillhandahålla däggdjurs tak enzymet cDNA. Detta arbete stöddes delvis av ett bidrag till Stowers Institute för medicinsk forskning från Helen Nelson medicinska forskningsfonden vid Greater Kansas City gemenskapen Foundation. Ursprungliga data bakom detta manuskript kan nås från Stowers ursprungliga dataarkivet på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D.
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
