Summary
在这里, 我们描述了从脐带血中提取的 CD34+细胞的造血干细胞的体外扩增, 该细胞因子鸡尾酒和 vpa 结合治疗。这种方法可显著扩大原始 Hsc 的体内扩张, 用于临床或实验室应用。
Abstract
脐带血 (UCB) 单元为需要异基因骨髓移植的患者提供了人类造血干细胞 (Hsc) 的替代来源。虽然 UCB 有几个独特的优势, 但每个 UCB 单元内的 Hsc 数量有限, 限制了它们在成人再生医学和 HSC 移植中的使用。通过对从 Ucb 分离并使用去乙酰化酶抑制剂丙戊酸 (VPA) 处理的 CD34+细胞进行体外培养, 可以实现功能人类 Hsc 的有效扩增。这里详细介绍的协议描述了快速分离 CD34 + 细胞并在很大程度上扩展原始 Hsc池的培养条件和方法。扩展的 Hsc 能够建立短期和长期的雕刻, 并能够产生所有类型的分化造血细胞。该方法在自体 HSC 基因治疗中具有临床应用潜力, 为克服基因编辑相关功能性 Hsc 的丧失提供了一种有吸引力的方法。
Introduction
脐带血 (UCB) 单位造血干细胞 (Hsc) 的体外扩增, 为造血干细胞在再生医学和移植治疗中的应用带来了巨大的希望。使用 UCB 单元的移植具有多种独特的优势, 如易于收集、高可用性、感染风险最小、疾病复发风险低、移植物与宿主病的发病率低 (GVHD)。然而, 它们在临床环境中使用的主要缺点是每个 UCB 单元1中的 Hsc 数量有限。Hsc 数量不足会导致移植和造血恢复延迟、移植排斥的风险和异常的免疫重建。
目前, 已经制定了各种方法和战略, 以在体内扩大来自 Ucb 的有限的 Hsc 数量。不同细胞因子鸡尾酒与体内培养物中的小分子或化合物的结合会导致 hsc数2、3、4、5、6、 7,8。重要的是, 体外培养条件会诱发压力, 导致细胞快速增殖, 增加代谢活性, 并失去定义原发性 Hsc 的原始特征。因此, 需要开发协议, 从而扩展大量具有与初级原始 Hsc 非常相似的功能 Hsc 的功能 Hsc。
从 ucb 中分离出并经丙戊酸 (vpa) 处理的 cd34+细胞的无血清培养导致大量原始 hsc4、9、10的扩展。HSC 的扩展不仅仅是由于来自 Ucb 的现有 Hsc 的扩散。相反, 这种扩张是由于获得了一个原始的表型, 加上有限数量的细胞分裂和增殖9.在最初的24-48小时内, CD34 + 细胞结合细胞因子和 VPA, 获得了具有长期 Hsc特征的转录和表型特征。在 Hsc 比例大幅上升的同时, Hsc 的数量也在迅速增加 (在 VPA 治疗的24小时内增加 63倍)9。值得注意的是, Vpa-ex-ex-femal 扩增策略可扩展代谢活性低的 Hsc, 这进一步突出了其原始特征。
这里描述的方法提供了条件和治疗方法, 导致原始 Hsc 在体内的显著扩展, 用于临床或实验室应用。这种体外扩张策略使用细胞因子鸡尾酒与 VPA 治疗相结合。VPA 是 FDA 批准的治疗双相情感障碍和其他神经疾病的药物。使用 VPA 的 HSC 扩展是及时的, 并且在7天内发生, 最大限度地减少了操作时间和污染风险。重要的是, 该协议允许在 VPA 9 治疗后24-48 内获取长期的 HSC 表型标记, 如 CD90 和 CD49f.使用该方案创建的扩展 HSC 移植具有再生造血系统的能力, 因为它们可以分化为所有造血细胞谱系, 并在移植到清髓性 NSG 小鼠后建立长期的移植型号4。此外, 该协议具有很高的重现性, 可以从 Ucb 中高效、快速地分离出可行的 CD34+细胞, 这对该程序的产业化至关重要。
VPA 体外扩增协议也有可能克服在基因编辑期间发生的 Hsc 的重大损失11。基因编辑需要接触细胞因子, 而细胞因子是循环细胞和激活 dna 修复机制所必需的。由于 VPA 治疗的迅速效果, 这种方法可能有利于在一段时间内产生更多的转基因细胞, 这与目前使用的基因修饰协议有关。
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Protocol
HSC 体外扩大协议遵循西奈山医学院研究伦理委员会的指导原则。
1. 缓冲器和介质准备
- 在从 Ubc 中分离 CD34+细胞前24小时准备分离缓冲液, 加入2毫升 0.5 ml 乙烯胺二胺四乙酸 (edta) 和 3Ml 7.5% 的牛血清白蛋白 (bsa) 至 465 ml 缓冲盐水 (1X pbs)。轻轻混合, 将缓冲液保持在4°C 过夜。
- 净化当天在室温下加热介质。
2. 从 UCB 单元中分离单个核细胞 (Mnc)
- 将整个 UCB 单元分配到一个75厘米2瓶中。在室温下, 将 UCB 与等量的 PBS 混合均匀。
- 确定加工整个 UCB 单元所需的管数 (一个50毫升锥形管可用于加工35毫升的稀释 UCB)。在每个管中添加15毫升密度梯度介质 (见材料表), 并在密度梯度介质的顶部分配稀释的 ucb, 从而创建两层。
请注意:在45°角按住管的同时, 非常缓慢地分配稀释后的 UCB, 以防止密度梯度介质层与 UCB 混合。 - 在低加速和减速速率下, 以 400 x g 离心30分钟。离心后, Mnc 位于等离子体和密度梯度介质层之间的白色层 (蓬松涂层)。
- 慢慢吸气 2/血浆, 而不会干扰蓬松的涂层。小心地将蓬松的涂层转移到新的50毫升管中。将同一 UCB 单元中的所有 Mnc 收集到50毫升管中, 直到达到25毫升。如果收集到的 Mnc 的体积超过25毫升, 请使用新的管。
- 在含有25毫升 Mnc 的管内加入25毫升的冷 PBS, 搅拌均匀。在4°C 下, 以 400 x g 离心10分钟。
请注意:冷 PBS 对于防止抗体在细胞表面封盖和减少非特异性标记非常重要。 - 小心吸气上清液, 轻轻地将细胞颗粒重新悬浮在50毫升的冷 PBS 中。
- 取出细胞悬浮液的20Μl 进行计数。使用自动细胞计数器计数用肌酸酯/碘化物染色染色的细胞数量。计算跨国公司的总数。
请注意:细胞计数也可以通过色氨酸蓝色排除方法使用血细胞计执行。 - 在4°C 下, 以 400 x g 离心15分钟。
请注意:如果不立即要求, 跨国公司可在此阶段冻结。
3. 从 Ucb 中分离 CD34+细胞
- 准备 CD34+抗体与磁珠溶液相结合, 从 mnc 中分离 cd34 + 细胞. 将300Μl 分离缓冲液与100μl 的人 fcr 人 igg (阻滞剂) 和100ΜL 的 cd34 磁珠混合, 用于分离 CD34 +每个10个mnc 的细胞。为了从 (& gt;108) mnc 中分离出更多的 CD34+细胞, 相应地扩大试剂。
- 小心地从在第2.8 步离心的管中吸气上清液。在步骤3.1 中制备的 CD34 磁珠溶液中重新注入颗粒 (每 10个8个细胞使用500Μl 溶液)。
- 轻轻混合, 在4°c 孵育30分钟。
请注意:在潜伏期准备细胞分离器装置 (见材料表)。按照制造商的说明, 将存储解决方案替换为工作缓冲区, 然后运行洗涤程序, 然后运行冲洗程序。 - 在含有电池混合物的管内加入冷细胞分离器运行缓冲液, 直到管子完全填充。在4°C 下, 以 400 x g 离心15分钟。
- 在冷细胞分离器中吸气, 并重新悬浮细胞颗粒 (2 mL/10 8 细胞).将2毫升的细胞悬浮液转移到15毫升管中。
- 将3台15毫升管加载到电池分离器架中, 在4°c 预冷。一组管包含 Mnc, 第二套管将用于收集负分数, 第三套管将用于收集纯化的 CD34+细胞。
- 将机架加载到单元分离器设备中, 然后运行posseld2预设程序。
请注意:另一种使用手动磁选器的方法可用于替换单元分离器装置12 。 - 离心管的正分数为 400 x g, 在 4°c 下15分钟。在1毫升无血清介质中吸吸上清液并重新悬浮纯化的 CD34+细胞。
- 使用自动细胞计数器计数用肌酸腺苷/碘化物染色的细胞。
请注意:如果不立即需要, 纯化后的 CD34+细胞可在此阶段冷冻。
4. 纯化 UCB-CD34 + 细胞的 VPA前活体扩张
- 准备足够数量的培养基, 以 3.3 x10 4 细胞的密度对纯化后的 CD34 +细胞进行平板。培养基组成是血清游离培养基 (见材料表) 补充 10μlml pen 链丝, 150 ngml 干细胞因子 (scf)、100 ngml fms-fms-fms 样酪氨酸激酶受体 3 (FLT3 配体)、100 ngml 血小板生成素 (tpo) 和50 ngml 白细胞介素 3 (IL-3)。
- 在12井板 (5 x10 4 cd34 + 培养基/半井 1.5 ml) 中纯化 cd34 + 细胞, 并在 5% co2 加湿孵化器中在37°c 培养.
- 通过流式细胞仪分析评估分离 CD34+细胞的纯度和细胞组成, 如步骤6.3 所述。
- 在最后浓度为 1 mM 的情况下, 将 VPA 添加到用细胞因子鸡尾酒处理了16小时的细胞培养中。
- 在 5% CO2 加湿孵化器中, 在37°c 下再培养细胞 7天 。
请注意:在体外扩张期间, 培养基保持不变。
5. 流式细胞术分析用抗体染色
- 准备抗体染色溶液染色 2 x104–6 x10 4个细胞和异型溶液, 以确定流式细胞袋的门控策略, 并确定非特异性结合的水平。稀释抗体 (半 APC 抗 CD34, 半 FITC 抗 cd90) 和各自的等表型成50Μl 的分离缓冲液 (分离缓冲液的组成在步骤1.1 中定义)。
请注意:对每个抗体的细胞进行一次染色, 以实现 FMO 门控策略。总抗体补偿珠试剂盒 (见材料表) 可用于补偿设置。 - 通过多次移液使细胞培养同质化。将细胞和管道 5 x10 4个细胞计数为 1.5 ml 管。
- 在室温下, 在 400 x g处添加1毫升分离缓冲液和离心机15分钟。
- 吸入上清液, 并在50Μl 的染色溶液中重新悬浮颗粒。在室温下将细胞孵化30分钟。
- 在室温下, 以 400 x g 的速度添加450微米的分离缓冲液和离心机, 时间为15分钟。
- 在100μl 的分离缓冲液中吸吸上清液并重新悬浮颗粒。将细胞保持在冰上至少 5分钟, 直到执行流式细胞仪分析。加入1μl 的7-AAD 来培养有活力的细胞。
- 将染色细胞样品装入流式细胞系统的机器上, 以最低的流速获取细胞。
- 对于每个荧光体, 分析同型对照和单片细胞, 为 FITC (CD90)、APC (CD34) 和 Percpcy5.5 (7-AAD) 染色设置门控。
- 门每个周期 Cy5.5 负分数和绘图 APC 与 FITC, 以确定活性 CD34+、cd90+和 cd34 + cd90+细胞的百分比, 这些细胞定义了培养中的 hspc\ hsc种群。
6. 流式细胞仪分选抗体染色
- 通过多次移液重新填充展开的单元格。计数细胞号, 并将整个培养体转移到一个15毫升或50毫升管。
- 用冷分离缓冲液填充管
- 在4°C 下, 以 400 x g 离心15分钟。
- 准备抗体染色溶液染色 5 x105-2 x10 6细胞和异型溶液染色 1 x 10 5 细胞, 并确定流式细胞仪门控。稀释半 (APC 抗 CD34), 半 (FIT-CD90) 抗体和相应的等表成500μl 分离缓冲液每个条件。
- 根据制造商的说明, 使用总抗体补偿珠试剂盒准备单色补偿控制。
- 将上清液从步骤5.2 转移到新管中, 并将其保持在37°c。这种培养基将被重新用于培养已排序的细胞。
- 在冷分离缓冲液中重新杀灭细胞颗粒, 得到 5 x10 5 细胞/ml 的浓度。在 1.5 mL 管中转移 1 x 10 5 细胞进行等型染色, 并将剩余的细胞分为其他 1.5 ml 管。
- 在4°C 条件下, 以 400 x g离心管15分钟。
- 在同型染色溶液中丢弃上清液和重新悬浮细胞颗粒, 并在抗体染色溶液中对细胞颗粒进行分类。
- 在4°C 下孵化30分钟。
- 在4°C 下, 在 400 x g处添加450Μl 分离缓冲液和离心机15分钟。
- 用2毫升冷分离缓冲液重新填充颗粒。
- 为了防止堵塞, 通过40μm 的电池过滤器过滤样品, 并将其放置在冰上, 直到流式细胞仪。
- 设置单元分清器, 使用正确的参数进行排序。
- 运行等表样本, 以设置前向散射和侧向散射的电压和增益, 并识别负荧光种群。
- 运行单色控件以设置补偿系数, 并将补偿参数应用于收集协议。
- 运行一个小的 (Ab) 样本 (~ 50, 000个事件) 来建立门控策略。
- 设置排序决策以收集 CD34+ cd90细胞分数。
- 将细胞分类到涂有2毫升分离缓冲液的收集管中。
- 分类后, 在4°c 下, 以 400 x g的速度重新计算细胞并离心15分钟。
- 丢弃上清液并在步骤5.5 中回收的介质中重新悬浮颗粒, 以达到 3 x10 4 cellsl 的最终浓度。
- 板 CD34+ cd90-纯化细胞在12孔板与 1.5 ml medium/well (5 x 10 4 cd34 + cd90-细胞/1.5 毫升的 media 井).
- 利用50μl 的含介质细胞进行流式细胞仪分析, 评估纯度。
- 在 1 Mm 的最终浓度下, 用 VPA 治疗 cd34 + cd90细胞的培养。
- 在37°c 时在 5% CO2 加湿孵化器中孵育。
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Representative Results
这里描述的体外协议增加了从 Ucb分离出的 CD34 + 细胞产生的原始 Hsc 的数量 (图 1)。用细胞因子鸡尾酒启动 CD34+细胞 16小时, 然后用 vpa 进行7天的治疗, 可导致 hsc 的大程度扩张。值得注意的是, 扩展细胞池对于 Hsc 具有高度富集, hsc 是由 CD34+cd90+标记的表型定义的。仅用细胞因子鸡尾酒处理的培养物中的有核细胞总数明显高于在使用细胞因子鸡尾酒和 VPA 处理的培养中观察到的细胞数量 (图 2a)。尽管跨国公司数量较多, 但在整个扩张期间, 仅接受细胞因子鸡尾酒的文化中, Hsc 的数量仍然很少, 而使用细胞因子鸡尾酒和 VPA 治疗的文化 (图 2 b)。Hsc 的数量最多的是在细胞因子鸡尾酒和 VPA 相结合处理的培养物中产生的 (图 2b)。特别是, HSC 的数量在 VPA 处理后5-7天达到最大的扩展范围 (图 2b)。Hsc 数量的增加与 Hsc 的比例迅速增加有关, 这在 VPA 治疗的24小时内是显著的 (图 2c)。虽然 Hsc 的百分比增加很高, 并在体外培养的头4天保持, 但在使用 VPA 治疗5-7天后, hsc 的百分比会逐渐下降 (图 2c)。然而, 这种减少与 Hsc 绝对数量的增加成反比。
重要的是, 在接受 VPA 处理的培养物中观察到的 Hsc 比例的迅速增加是由于获得了 CD90 表型。表达 CD90 表型标记的 CD34+细胞在使用细胞因子鸡尾酒和 vpa 处理4天的体外培养中扩张的细胞达到近 40%-45% (图 2c,d)。高度纯化的 CD34 + 细胞缺乏 cd90 标记表达, 进一步证实了 CD90表型的获取。在 VPA 治疗的24小时内, 近75% 的体外扩张细胞在由分类 CD34+cd90-细胞引发的培养中表达 cd90, 而仅含有细胞因子鸡尾酒的培养物中, 只有0% 的细胞表达 Cd90 (图 2e)。重要的是, CD90 表型在 VPA 处理的体外培养的前4天中被高度保留 (图 2e)。
图 1: 体外扩增培养的示意图.从 Ucb 中纯化的 CD34+细胞在体外培养中被培养为 16h, 并辅以指示的细胞因子的组合。文化用 VPA (1 毫米) 再治疗7天。然后, 体外扩大细胞可移植到肌消融的 NSG 小鼠体内。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: vpa 处理触发 CD90 的获取, 导致大量 Hsc 的扩张.(A) 在体外培养中扩张的活核细胞总数的绝对数量9。用第3节所述的 Ucb 纯化的 CD34+细胞, 单独用细胞因子鸡尾酒或第4节所述的细胞因子鸡尾酒和 vpa 的组合, 用碘化腺的阿得林或钠-十二烷染色 (n = 16) 进行计数。数字表示使用 VPA 处理的天数, 而 PC 表示从 Ucb 中分离出的原代未培养的 CD34+细胞。(B、C)仅用细胞因子鸡尾酒或细胞因子鸡尾酒和 vpa (n = 21) 联合处理的外体内培养中, cd34 + cd90+细胞的绝对数量和百分比在7天内扩大。CD34+cd90+细胞的百分比是通过流式细胞仪分析染色第4节所述的。(D) 对从 ucb (步骤 5.3) 中分离的 CD34+细胞进行表型分析, 按照所述的方法进行4天的外培养。左侧面板表示使用同型染色的门控策略, 而其他面板表示染色细胞在单独含有细胞因子鸡尾酒或细胞因子鸡尾酒与 VPA 的组合培养中扩张。数字表示CD34-cd90+ 细胞、cd34+CD90细胞和 cd34+cd90+细胞的百分比。(E) cd34+cd90+细胞在培养中扩张的百分比, 这些细胞是用 cd34 + Cd90 分类的培养体----来自 ubc 的细胞, 单独用细胞因子鸡尾酒或细胞因子鸡尾酒和 vpa 的组合进行治疗。表示的天。百分比是通过流式细胞术分析确定的 (n = 4)。N: 生物复制的数量。使用 SEM 的错误栏;p≤0.0001 由 a 和 B 的负二项式模型、D 的贝塔模型和面板 e 的双向方差模型从 Papa 等9修改后,请点击此处查看此图的更大版本.
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Discussion
在此, 我们提出了一项议定书, 以在很大程度上迅速扩大来自 Ucb 的功能性人的 Hsc 数量。使用该协议的试点和动力学研究表明, 体外扩增细胞迅速获得并保留包括 CD90 在内的几种 HSC 表型标记的表达以及原始的 HSC 代谢特征9。
这种体外扩增协议相对简单可靠。使用细胞分离器设备 (见材料表) 纯化 cd34+细胞具有高度的重现性和快速性, 从而可以快速恢复分离的细胞。该方法可获得较高的纯化 CD34+细胞 (gt;90%)而不是人工免疫磁分离。此外, 这种体外扩增协议不需要特殊和复杂的设备或饲料批量生产系统, 这些设备或系统需要连续供应大量新鲜介质, 并辅以细胞因子3,13。因此, 这种方法限制了成本。重要的是, 该协议允许在短时间内扩展 HSC 池, 这是污染频率的一个关键限制因素。
使用该协议从 CD34 + 细胞中实现原始 Hsc应考虑几点。CD34+细胞在使用细胞因子鸡尾酒和 vpa 处理的培养中扩张 4天, 从而产生了一批原始的长期 Hsc。这些 Hsc 的特点不仅是 CD34、CD90 和 CD49f 的高表达水平, 而且还有一个非常原始的代谢特征, 主要依靠糖酵解9。在更长时间的 VPA 孵育7天期间, 扩张的培养物更加异质, 含有更多的长期和短期以及分化细胞, 而不是扩大4天的细胞。这一结果主要是由于在培养过程中 VPA 耗尽和细胞分裂9的数量增加。因此, 该协议可用于实现两个不同单元池的扩展: 4天和7天的扩展单元。7天扩张产品可用于同种异体 HSC 移植, 在这种移植中需要更快、更持续的多系植入。4天扩张协议可能最适合针对长期再种群细胞的基因改造策略。在使用本协议中使用的介质 (见材料表) 时, 这种 VPA 和细胞因子鸡尾酒的组合也有可能在相同程度或更高的程度上扩大 cd34 + 细胞的 hsc 池。
目前的基因编辑程序与 Hsc 的重大损失有关, 这限制了它们的临床应用。在体外培养物中 VPA 治疗的2-4天内实现的大量原始 Hsc 有可能克服 HSC 数量的这一损失。因此, 该方案可能有助于改进现有的基因编辑协议, 并使基因突变的遗传突变的 HSC 移植治疗β-地中海贫血和镰状细胞病。此外, 它还可用于在基因操纵过程中维持大量的 Hsc, 用于阐明 Hsc 和造血中的基因功能的研究。
总之, 这里描述的方法可用于人类和小鼠 Hsc 的体外扩增, 并可针对特定的临床应用以及基础研究中的广泛研究进行定制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了纽约科技秘书处向相对湿度授予 C030136 的赠款的支持。我们要感谢巴特克·贾布隆斯基对手稿的反馈和修改
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
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