Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Nous décrivons ici l’ex vivo expansion des cellules souches hématopoïétiques CD34+ cellules provenant du sang de cordon ombilical traitement avec une combinaison d’un cocktail de cytokine et l’APV. Cette méthode conduit à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif des deux cliniques ou les applications de laboratoire.

Abstract

Unités de sang (UCB) cordon ombilical offrent une autre source de cellules souches hématopoïétiques humaines (CSH) pour les patients qui ont besoin de transplantation allogénique de moelle osseuse. Alors que l’UCB a plusieurs avantages uniques, le nombre limité de GPX au sein de chaque unité UCB limite leur utilisation en médecine régénératrice et greffe de csh chez l’adulte. Expansion efficace de csh humaine fonctionnelle peut être réalisée par ex vivo cultivant des CD34+ des cellules isolées d’UCB et traités avec un inhibiteur de la désacétylase, acide valproïque (VPA). Le protocole détaillé ici décrit les conditions de culture et de la méthodologie d’isoler rapidement CD34+ des cellules et l’étendre à un haut degré un pool de csh primitif. Le csh élargi est capables d’établir la prise de greffe à court et à long terme et peuvent donner lieu à tous les types de cellules hématopoïétiques différenciées. Cette méthode aussi détient potentielle d’application clinique dans la thérapie génique csh autologue et fournit une approche intéressante pour surmonter la perte de csh fonctionnelle associée à la modification des gènes.

Introduction

Expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de sang de cordon ombilical unités (UCB) est très prometteur pour les applications de HSC en médecine régénératrice et de thérapie de la transplantation. Transplantation avec des unités de l’UCB a plusieurs avantages uniques telles que la collecte facile, haute disponibilité, un risque minime d’infection, le faible risque de rechute de la maladie et de basse fréquence de graft-versus maladie l’hôte (GVH). Toutefois, les principaux inconvénients de leur utilisation dans des milieux cliniques sont du nombre limité de csh présents au sein de chaque unité UCB1. Le nombre insuffisant de csh provoque retard prise de greffe et reprise hématopoïétique, risque de rejet du greffon et de reconstitution immunitaire aberrante.

Actuellement, les différentes méthodes et stratégies ont été développés pour ex vivo, élargir le nombre limité de csh de l’UCB. Combinaisons de différentes cytokines cocktails avec petites molécules ou des composés en ex vivo résultat de cultures à des degrés divers de l’expansion du HSC numéros2,3,4,5,6, 7,8. Ce qui est important, ex vivo culture conditions induisent stress, menant à la prolifération cellulaire rapide, une activité métabolique accrue et la perte des caractéristiques primitives qui définissent les CSH primaire. Par conséquent, les protocoles en développement qui conduisent à l’expansion d’un grand nombre de csh fonctionnelle avec des caractéristiques qui ressemblent étroitement aux primaires autorenouveler primitif sont nécessaires.

Des cultures sans sérum de CD34+ cellules isolées d’UCB et traités avec le résultat de (APV) acide valproïque dans l’expansion d’un grand nombre de primitives autorenouveler4,9,10. L’expansion de HSC n’est pas uniquement due à la prolifération de la csh existantes dérivées de l’UCB. Au lieu de cela, cette expansion est attribuable à l’acquisition d’un phénotype primitif associé à un nombre limité de divisions cellulaires et prolifération9. Dans le première 24 à 48 h d’incubation avec une combinaison de cytokines et VPA, CD34+ cellules acquièrent une transcriptomique et profil phénotypique qui caractérisent les CSH à long terme. L’augmentation significative du pourcentage de csh est accompagnée d’une augmentation rapide du nombre de csh (augmentation de 63 fois dans les 24 h de traitement de l’APV)9. Notamment, la stratégie d’expansion APV-ex vivo s’étend des CSH avec faible activité métabolique, ce qui souligne encore leurs caractères primitifs.

La méthode décrite ici fournit des affections et les traitements qui conduisent à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif pour soit clinique ou les applications de laboratoire. Cette ex vivo stratégie d’expansion utilise un cocktail de cytokine, combiné avec le traitement de l’APV. VPA est un médicament approuvé par la FDA pour le traitement des troubles bipolaires et autres maladies neurologiques. L’expansion de HSC avec APV est rapide et se produit dans les 7 jours, réduisant au minimum la durée de la manipulation et le risque de contamination. Ce qui est important, ce protocole permet l’acquisition de longue durées marqueurs phénotypiques HSC comme CD90 et CD49f sous 24-48 h après traitement avec APV9. Greffes de csh élargis créés avec ce protocole ont la capacité de régénérer le système hématopoïétique, car elles peuvent se différencier en toutes les lignées de cellules hématopoïétiques et établir la greffe à long terme suite à une transplantation chez la souris myeloablated NSG les modèles4. De plus, ce protocole est hautement reproductible et permet une isolation efficace et rapide de CD34 viable+ les cellules de l’UCB, ce qui est essentiel pour l’industrialisation de cette procédure.

L’APV ex vivo protocole d’expansion a également le potentiel pour surmonter la perte importante de csh, qui se produit pendant le gène édition11. Gène montage exige une exposition aux cytokines, qui sont nécessaires pour les cellules cyclisme et l’activation des mécanismes de réparation de l’ADN. En raison des effets rapides de traitement de l’APV, cette méthode peut être bénéfique pour la génération d’un nombre plus élevé de cellules génétiquement modifiées dans un délai qui est pertinente pour actuellement utilisé des protocoles de modification génétique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le HSC ex vivo protocole d’expansion suit les directives de la Commission d’éthique de recherche au Mount Sinai School of Medicine.

1. tampon et la préparation des médias

  1. Préparer le tampon de séparation 24 h avant l’isolement du CD34+ cellules de canettes usagées en ajoutant 2 mL de 0,5 M éthylène Diamine tétra-acétique (EDTA) et 33 mL de 7,5 % albumine sérique Bovine (BSA) à 465 mL tamponné physiologique (solution de 1 PBS x). Mélanger doucement et maintenir le tampon durant la nuit à 4 ° C.
  2. Médias chauds à température ambiante le jour de la purification.

2. isolement de cellules Mononuclées (PTM) de l’unité de l’UCB

  1. Distribuer l’ensemble de l’UCB dans une fiole de2 75 cm. Diluer et mélanger doucement l’UCB avec un volume égal de PBS à température ambiante.
  2. Déterminer le nombre de tubes nécessaires pour le traitement de l’ensemble UCB (un tube conique de 50 mL peut être utilisé pour traiter 35 mL d’UCB dilué). Ajouter 15 mL de média de gradient de densité (voir Table des matières) dans chaque tube et répartir l’UCB dilué sur le dessus de la média de gradient de densité créant deux couches.
    Remarque : Distribuer l’UCB dilué très lentement en les tenant à un angle de 45° pour empêcher le mélange de la couche de médias de gradient de densité avec l’UCB.
  3. Centrifuger à 400 g pendant 30 minutes à un faible taux d’accélération et de décélération. Après centrifugation, multinationales localiser dans la couche blanche (couche leuco-plaquettaire) entre la couche de plasma et de densité médias dégradé.
  4. Aspirer doucement 2/3 du plasma sans déranger la couche de la couche leuco-plaquettaire. Transvaser avec soin la couche leuco dans un nouveau tube de 50 mL. Collecter toutes les multinationales de la même unité UCB dans un tube de 50 mL jusqu'à 25 mL. Utilisez un nouveau tube si le volume des multinationales collectées dépasse 25 mL.
  5. Ajouter 25 mL de PBS froid dans le tube contenant 25 mL de multinationales et bien mélanger. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque : PBS froid est important pour prévenir le bouchage des anticorps à la surface des cellules et réduire non spécifiques d’étiquetage.
  6. Aspirer soigneusement le surnageant et doucement resuspendre le culot dans 50 mL de PBS froid.
  7. Retirez 20 μL de la suspension cellulaire pour le comptage. Compter le nombre de cellules coloré avec l’iodure de l’acridine orange/propidium coloration à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Calculer le nombre total des multinationales.
    Remarque : Le nombre d’éléments peut être également effectué par la méthode d’exclusion bleu trypan utilisant un hémocytomètre.
  8. Centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    Remarque : Si ne pas requis immédiatement, multinationales peuvent être congelés à ce stade.

3. isolement de CD34+ les cellules de l’UCB

  1. Préparer le CD34+ anticorps couplé à la solution de billes magnétiques pour l’isolement de CD34+ cellules de PTM. Mix 300 µL de tampon de séparation avec 100 µL d’IgG humaine humaines FcR (réactif de blocage) et 100 µL de CD34 billes magnétiques pour l’isolement de CD34 + des cellules de chaque 10 multinationales de8 . Pour l’isolation d’un plus grand nombre de CD34+ cellules de (> 108) MNC, intensifier les réactifs en conséquence.
  2. Soigneusement aspirer le surnageant du tube centrifugé à étape 2.8. Resuspendre le culot dans la solution de billes magnétiques CD34 préparée à l’étape 3.1 (utiliser 500 µL de solution par 108 cellules).
  3. Mélanger doucement et laisser incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    Remarque : Préparer le dispositif séparateur de cellule (voir Table des matières) au cours de la période d’incubation. Remplacer la solution de stockage avec le tampon de travail comme indiqué par le fabricant et exécuter un programme de lavage suivi d’un programme de rinçage.
  4. Ajouter un séparateur de cellule glaciale tampon en cours d’exécution dans le tube contenant le mélange de la cellule jusqu'à ce que le tube est complètement rempli. Centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  5. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans le séparateur de cellule glaciale tampon (2 mL/108 cellules). Transférer le 2 mL du mélange de suspension cellulaire dans des tubes de 15 mL.
  6. Jeux de charges 3 tubes de 15 mL dans le rack de séparateur de cellule prérefroidies à 4 ° C. Un ensemble de tubes contient des multinationales, la deuxième série de tubes serviront à recueillir la fraction de négative et le troisième ensemble de tubes serviront à recueillir CD34 purifiée+ cellules.
  7. Charger le panier dans le dispositif de séparateur de cellule et exécutez le programme préétabli de posseld2 .
    Remarque : Une autre méthode qui utilise le séparateur magnétique manuel peut servir à remplacer la cellule de dispositif séparateur12 .
  8. Tubes à centrifuger avec la fraction positive à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le CD34 purifiée+ cellules dans 1 mL de sérum.
  9. Compter les cellules colorées avec l’iodure de l’acridine orange/propidium à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.
    Remarque : Si ne pas requis immédiatement, purifié CD34+ cellules peuvent être congelés à ce stade.

4. APV Ex Vivo Expansion de purifiée cellules UCB-CD34+

  1. Préparer un volume suffisant de médias pour le CD34 purifiée sur plaque+ des cellules à une densité de 3,3 x 104 cellules/mL. La composition de milieux de culture est le milieu de culture sans sérum (voir Table des matières) additionné de 10 µL/mL stylo/strep, 150 ng/mL facteur de cellules souches (SCF), 100 ng/mL fms-like tyrosine kinase du récepteur 3 (ligand FLT3), 100 ng/mL thrombopoïétine (TPO), et 50 ng/mL interleukine 3 (IL-3).
  2. Plaque purifiée CD34+ des cellules dans une plaque de 12 puits (5 x 104 CD34+ cellules / 1,5 mL de médias / bien) et de la culture à 37 ° C dans une étuve humide de2 CO 5 %.
  3. Évaluer la pureté du CD34 isolé+ des cellules et la composition cellulaire par analyse des FACS comme décrit ci-dessous dans l’étape 6.3.
  4. Ajouter APV à une concentration finale de 1 mM dans les cultures de cellules traitées pendant 16 h avec cocktail de cytokine.
  5. Les cellules de la culture pour une période supplémentaire de 7 jours à 37 ° C dans une étuve humide de2 CO 5 %.
    Remarque : Médias reste inchangé pendant toute la durée de l’ex vivo expansion.

5. les anticorps coloration pour l’analyse en cytométrie en flux

  1. Préparer la solution de coloration à l’anticorps pour souiller 2 x 104-6 x 104 cellules et isotype solution pour déterminer des FACS gating stratégie et déterminer le degré de liaison non spécifique. Diluer les anticorps (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) et les isotypes respectifs dans 50 µL de tampon de séparation (composition du tampon de séparation est définie à l’étape 1.1).
    Remarque : Effectuer la coloration unique des cellules avec chacun des anticorps pour un AFS gating stratégie. Kit de billes anticorps total compensation (voir Table des matières) peut être utilisé pour l’installation de compensation.
  2. Homogénéiser la culture cellulaire en pipettant également plusieurs fois. Compter les cellules et pipette 5 x 104 cellules dans un tube de 1,5 mL.
  3. Ajouter 1 mL de tampon de séparation et centrifuger à 400 x g pendant 15 min à température ambiante.
  4. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 50 µL de la solution colorante. Incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante.
  5. Ajouter 450 µL de tampon de séparation et centrifuger à 400 x g pendant 15 min à température ambiante.
  6. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 100 µL de tampon de séparation. Conservez les cellules sur la glace pendant au moins 5 min jusqu'à effectuer des analyses de FACS. Ajouter 1 µL de 7-AAD à la porte des cellules viables.
  7. Charger l’échantillon de cellules colorées sur la machine de FACS et d’acquérir des cellules au débit le plus bas.
  8. Pour chaque fluorophore, analyser l’isotype contrôles et les cellules colorées unique de mettre en place le blocage pour FITC (CD90), APC (CD34) et PerCP/Cy5.5 (7-AAD) coloration.
  9. PerCP/Cy5.5 négatifs fraction et intrigue APC vs FITC pour déterminer le pourcentage de CD34 viable la porte+, CD90+et CD34+CD90+ cellules qui définit la population HSPC/HSC dans la culture.

6. les anticorps coloration pour écoulement Cytometry cellule tri

  1. Remettre en suspension les cellules élargis en pipettant également plusieurs fois. Compter le nombre de cellules et de transférer toute la culture dans un tube de 15 mL ou 50 mL.
  2. Remplir le tube avec le tampon de séparation froid
  3. Centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  4. Préparer la solution de coloration à l’anticorps sur la tache de 5 x 105– 2 x 106 cellules et isotype solution pour souiller 1 x 105 cellules et déterminer le blocage des FACS. Diluer 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) les anticorps et les isotypes correspondante dans 500 µL de séparation tampon par chaque État.
  5. Préparer les commandes de compensation couleur unique à l’aide d’un kit de billes anticorps total compensation conformément aux instructions du fabricant.
  6. Transférer le surnageant de l’étape 5.2 dans un nouveau tube et le maintenir à 37 ° C. Ce support de culture seront réutilisé pour la culture des cellules triées.
  7. Resuspendre le culot dans le tampon de séparation froid pour obtenir une concentration de 5 x 105 cellules / mL. Transférer 1 x 105 cellules dans des tubes de 1,5 mL pour la coloration d’isotype et les cellules restantes qui seront triés dans les autres tubes de 1,5 mL.
  8. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  9. Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules des cellules dans l’isotype coloration solution et le culot de cellules qui sera trié dans l’anticorps solution de coloration.
  10. Incuber 30 min à 4 ° C.
  11. Ajouter 450 µL de tampon de séparation et centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  12. Remettre en suspension les pellets avec 2 mL de tampon de séparation froid.
  13. Pour empêcher les sabots, filtrer les échantillons par un 40 μm cellule crépine et lieu sur la glace jusqu'à FACS.
  14. Trieur de cellules de mise en place de tri avec les paramètres corrects.
  15. Exécuter les exemples d’isotype pour régler la tension et de gain pour la marche avant et de diffusion latérale et d’identifier les populations de fluorescence négative.
  16. Contrôles d’exécution unicolores de définir les coefficients de compensation et d’appliquer compensée paramètre de protocole de collecte.
  17. Exécutez une petite aliquote de l’échantillon (Ab) (~ 50 000 événements) pour établir la stratégie de blocage.
  18. Mettre en place des décisions de la sorte pour recueillir le CD34+ CD90 fraction cellulaire– .
  19. Cellules de tri dans les tubes de prélèvement couchés avec 2 mL de tampon de séparation.
  20. Après le tri, racontent les cellules et les centrifuger à 400 g pendant 15 min à 4 ° C.
  21. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans les médias récupérés à l’étape 5.5 pour atteindre une concentration finale de 3 x 104 cellules/mL.
  22. Plaque CD34+ CD90– purifiée cellules dans des boîtes de 12 puits avec 1,5 mL moyen/puits (5 x 104 CD34+ CD90– cellules/1.5 mL de médias/puits).
  23. Évaluer la pureté par analyse de FACS en utilisant 50 µL de cellules contenant de médias.
  24. Traiter les cultures de CD34+CD90– cellules avec APV à concentration finale de 1mM.
  25. Incuber à 37 ° C dans une étuve humide de2 CO 5 %.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L’ex vivo protocole décrit ici augmente le nombre de primitives GPX générés par CD34+ cellules isolées de l’UCB (Figure 1). Amorçage du CD34+ cellules pendant 16 h avec une cytokine cocktail, suivi du traitement par APV supplémentaires 7 jours, conduit à une grande expansion de HSC. Fait remarquable, le pool de cellules élargis est hautement enrichi pour csh, qui est phénotypiquement défini par CD34+CD90+ marqueurs. Le nombre total de cellules nucléées (STN) dans les cultures traitées avec la cytokine cocktail seul est significativement plus élevé que le nombre de cellules observées dans les cultures traitées avec le cocktail de cytokine et l’APV (Figure 2 a). Malgré l’augmentation du nombre des sociétés transnationales, le nombre de csh dans les cultures recevant la cytokine cocktail seul reste faible pendant la période d’expansion ensemble par rapport aux cultures traitées avec le cocktail de cytokine et l’APV (Figure 2 b). Le plus grand nombre de csh est généré dans les cultures traitées avec une combinaison de la cytokine cocktail et APV (Figure 2 b). En particulier, la plus grande expansion du nombre de csh est atteinte au bout de 5 à 7 jours après le traitement d’APV (Figure 2 b). L’augmentation du nombre de csh est corrélée avec une rapide augmentation du pourcentage de csh, qui est remarquable dans les 24 h de traitement de l’APV (Figure 2). Alors que l’augmentation du pourcentage de csh est élevé et entretenu au cours des 4 premiers jours des ex vivo la culture, elle diminue progressivement après 5 à 7 jours de traitement avec APV (Figure 2). Toutefois, cette diminution est inversement corrélée à une augmentation du nombre absolu de csh.

Ce qui est important, l’augmentation rapide du pourcentage des CSH observées dans les cultures de l’APV traité est attribuable à l’acquisition du phénotype CD90. CD34+ les cellules exprimant le CD90 phénotypique marqueur atteint presque 40 % à 45 % de cellules élargi en ex vivo cultures traitées avec l’APV et le cocktail de cytokine pendant 4 jours (Figure 2,D). L’acquisition du phénotype CD90 est en outre confirmée par expansion ex vivo de la CD34 hautement purifiée+ cellules que manque l’expression du marqueur CD90. Moins de 24 h de traitement de l’APV, près de 75 % de l’ex vivo élargi des cellules en culture initiée avec le CD34 trié+CD90– cellules expriment CD90 contre 0 % des cellules dans des cultures contenant la cytokine cocktail seul (Figure 2E). Ce qui est important, le phénotype CD90 est hautement conservé pendant les 4 premiers jours en ex vivo cultures traitées avec APV (Figure 2E).

Figure 1
Figure 1 : Présentation schématique des ex vivo la culture extension. Purifiée CD34+ cellules d’UCB sont amorcées pendant 16 h en ex vivo culture additionnée d’une combinaison des cytokines indiquées. Les cultures sont traitées avec APV (1mM) pour une période supplémentaire de 7 jours. L’ex vivo élargi de cellules peuvent ensuite être repiquées en pleine myoablated souris NSG. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : traitement de l’APV déclenche l’acquisition du CD90 ayant pour résultat l’expansion d’un grand nombre de csh. (A) le nombre absolu de totales cellules nucléées viables élargi en ex vivo cultures9. Purifiée CD34+ cellules d’UCB visées à l’article 3 traité par cytokine cocktail seul ou une combinaison de cytokine cocktail et APV tel que décrit à l’article 4 ont été dénombrés par l’acridine orange/propidium iodure coloration (n = 16). Les chiffres correspondent aux jours de traitement avec APV, tandis que PC désigne le CD34 inculte primaire+ cellules isolées de l’UCB. (B, C) Nombre et pourcentage de CD34+CD90+ élargis pendant 7 jours chez les ex vivo cultures des cellules traitées avec cocktail de cytokine seul ou une combinaison de cytokine cocktail et APV (n = 21). Pourcentage de CD34+CD90+ les cellules est déterminée par analyse en cytométrie en flux de cellules colorées comme décrit dans la section 4. (D) analyse phénotypique de CD34 trié les cellules de+ d’UCB (étape 5.3) élargi en ex vivo cultures traitées comme indiqué pendant 4 jours. Panneau de gauche indique la stratégie de blocage en utilisant isotype coloration alors que les autres panneaux indiquent étendu de cellules colorées dans des cultures contenant des cytokines cocktail seul ou une combinaison de cytokine cocktail avec APV. Les chiffres indiquent le pourcentage de CD34–CD90+ , les cellules CD34+CD90 CD34 et cellules– +CD90+ cellules. (E) pourcentage de CD34+CD90+ élargis dans les cultures avec des cellules triées CD34+CD90– cellules de canettes usagées et traités avec le cocktail de cytokine seul ou une combinaison de cytokine cocktail et APV pour la jours indiqués. Pourcentage est déterminé par l’analyse en cytométrie en flux (n = 4). N: nombre de réplicats biologiques. Barres d’erreur avec SEM ; p ≤ 0,0001 tel que déterminé par la négative-binomial modèles A et B, modèles Beta pour D et 2-way ANOVA pour panneau E. panneaux de A à C et E ont été modifiés du Papa et coll.9s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ici, nous présentons un protocole visant à développer rapidement de manière significative le nombre de csh humaine fonctionnelle de l’UCB. Les études pilotes et cinétiques utilisant ce protocole indiquent que l’ex vivo cellules élargies rapidement acquérir et conserver l’expression de plusieurs marqueurs phénotypiques HSC CD90 ainsi que primitive HSC caractéristiques métaboliques9.

Ex vivo protocole d’expansion est relativement simple et fiable. Purification de CD34+ des cellules avec le dispositif séparateur de cellule (voir Table des matières) est hautement reproductible et rapide, permettant une récupération rapide des cellules isolées. Cette méthode se traduit par un rendement élevé de CD34 purifiée+ cellules (> 90 %) par opposition à une séparation immunomagnétique manuelle. En outre, cela ex vivo protocole d’expansion ne nécessite pas de dispositifs spéciaux et complexes ou des systèmes de culture fed-batch nécessitant un approvisionnement continu de gros volumes de supports neufs additionnés de cytokines3,13. Par conséquent, cette méthode limite les coûts. Ce qui est important, ce protocole permet l’expansion de la piscine HSC dans un bref délai, qui est un facteur limitant pour la fréquence de contamination.

Plusieurs points sont à considérer pour atteindre autorenouveler primitif de CD34+ cellules utilisant ce protocole. CD34+ élargis pendant 4 jours dans les cultures des cellules traitées avec le cocktail de cytokine et plomb APV à la génération d’un bassin de GPX à long terme primitif. Ces csh se caractérisent non seulement par les niveaux d’expression élevée de CD34, CD90 et CD49f, mais aussi par un profil métabolique très primitif, qui s’appuie principalement sur la glycolyse9. Durant l’incubation plus longue avec APV pendant 7 jours, cultures élargis toutefois sont plus hétérogènes et contiennent un plus grand nombre des deux à long terme et à court terme ainsi que des cellules par opposition aux cellules élargis pendant 4 jours différenciées. Ce résultat est principalement due à l’épuisement de l’APV dans la culture et l’augmentation du nombre de divisions cellulaires9. Ainsi, le présent protocole peut être utilisé pour réaliser l’expansion de deux populations différentes de cellules : cellules élargis de 4 jours et 7 jours. L’appareil d’extension de 7 jours peut servir pour greffe de csh allogénique où plus rapide prise de greffe multilignée ainsi plus soutenue est nécessaire. Le protocole d’extension de 4 jours est peut-être plus adapté pour des stratégies de modification génétique qui ciblent les cellules de repeuplement à long terme. Il est également probable que cette combinaison de l’APV et cocktail de cytokine peut élargir le vivier de csh de CD34+ cellules au même degré ou plus lors de l’utilisation de supports autres que les médias (voir la Table des matières) utilisés dans le présent protocole.

Procédures actuelles d’édition gène sont associées à une perte importante de csh, qui limitent leur application clinique. Le grand nombre de primitives autorenouveler atteint en 2 à 4 jours de traitement APV en ex vivo cultures a le potentiel pour surmonter cette perte en nombre HSC. Ainsi, ce protocole pourrait être bénéfique pour améliorer le gène existant, modification des protocoles et activer la correction de mutations génétiques dans les thérapies à base de transplantation HSC pour β-thalassémie et la drépanocytose. En outre, il peut être appliqué afin de maintenir un grand nombre de csh lors des manipulations de gène pour études axées sur l’élucidation des fonctions des gènes en GPX et dans l’hématopoïèse.

En conclusion, la méthode décrite ici peut être utilisée pour expansion ex vivo de csh humaines et murines et peut être adaptée aux cliniques des applications spécifiques aussi bien quant à un large éventail d’enquêtes dans la recherche fondamentale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par NYSTEM accorder C030136 à R.H. Nous tenons à remercier Bartek Jablonski pour ses commentaires et la révision du manuscrit

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

Tags

Sang de cordon ombilical numéro 146 la médecine CD34+ cellules ex vivo culture APV csh ex vivo expansion transplantation la thérapie génique
Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain<sup>+</sup> des cellules à l’aide de l’acide valproïque
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter