Summary
Hier beschrijven we de ex vivo expansie van hematopoietische stamcellen uit CD34+ cellen afgeleid van navelstrengbloed behandeld met een combinatie van een cytokine cocktail en de VPA. Deze methode leidt tot een aanzienlijke mate van ex vivo uitbreiding van de primitieve HSCs voor hetzij klinische of laboratorium toepassingen.
Abstract
Navelstreng bloed (UCB) eenheden bieden een alternatieve bron van menselijke hematopoietische stamcellen (HSCs) voor patiënten die behoefte hebben aan allogene beenmergtransplantatie. Terwijl UCB heeft een aantal unieke voordelen, beperkt de beperkte oplage van HSCs binnen elke UCB-eenheid hun gebruik in de regeneratieve geneeskunde en HSC-transplantatie bij volwassenen. Efficiënte uitbreiding van functionele menselijke HSCs kan worden bereikt door ex vivo kweken van CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs en behandeld met een deacetylase-remmer, valproic zuur (VPA). Het protocol hier gedetailleerde beschrijving van de kweekomstandigheden en methodologie te snel isoleren CD34+ cellen en uit te breiden tot een hoge mate een pool van primitieve HSCs. De uitgebreide HSCs kunnen zowel op korte als op lange termijn engraftment tot stand te brengen en kunnen aanleiding geven tot alle soorten gedifferentieerde hematopoietische cellen. Deze methode ook potentiële voor klinische toepassing houdt in autologe HSC gentherapie en biedt een aantrekkelijke aanpak om te overwinnen van het verlies van functionele HSCs gene bewerken is gekoppeld.
Introduction
Ex vivo expansie van hematopoietische stamcellen (HSCs) uit het navelstrengbloed (UCB) eenheden houdt grote belofte voor HSC toepassingen in de regeneratieve geneeskunde en transplantatie therapie. Transplantatie met UCB eenheden heeft een aantal unieke voordelen zoals easy collectie, hoge beschikbaarheid, minimale risico van infectie, laag risico van ziekte herval, en lage frequentie van graft-versus-host ziekte (GVGH). De belangrijkste nadelen van hun gebruik in klinische instellingen zijn echter een beperkt aantal HSCs aanwezig binnen elke UCB reactor1. Het ontoereikende aantal HSCs leidt tot vertraagde engraftment en hematopoietische herstel, risico van graft afwijzing en afwijkende immuunsysteem reconstitutie.
Op dit moment zijn diverse methoden en strategieën ontwikkeld om uit te breiden het beperkte aantal HSCs van de UCBs ex vivo. Combinaties van verschillende cytokine cocktails met kleine moleculen of verbindingen in ex vivo culturen resulteren in verschillende graden van de expansie in HSC getallen2,3,4,5,,6, 7,8. Bovenal ex vivo cultuur veroorzaken voorwaarden stress, wat leidt tot snelle celproliferatie, grotere metabole activiteit en verlies van de primitieve kenmerken waaraan een primaire HSCs. Daarom zijn ontwikkelen protocollen die leiden tot uitbreiding van een groot aantal functioneel HSCs met kenmerken die sterk gelijken op primaire primitieve HSCs nodig.
Serumvrij culturen van CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs en behandeld met valproic zuur (VPA) resultaat in de uitbreiding van de grote aantallen van primitieve HSCs4,-9,10. De HSC-uitbreiding is niet uitsluitend te wijten aan de verspreiding van de bestaande HSCs, afgeleid van UCBs. In plaats daarvan, deze uitbreiding is te wijten aan de verwerving van een primitieve fenotype gecombineerd met een beperkt aantal celdelingen en proliferatie9. Binnen de eerste 24-48 uur incubatie met een combinatie van cytokines en VPA, CD34+ cellen verwerven een transcriptomic en fenotypische profiel die kenmerkend zijn voor langdurige HSCs. De aanzienlijke toename van het percentage van de HSCs wordt begeleid door een snelle toename van het aantal HSCs (63-voudige toename binnen de 24u van VPA behandeling)9. Met name breidt de uitbreidingsstrategie van de VPA-ex vivo HSCs met lage metabolische activiteit, die verdere hun primitieve kenmerken hoogtepunten.
De hier beschreven methode biedt voorwaarden en behandelingen die tot een aanzienlijke mate van ex vivo uitbreiding van de primitieve HSCs voor hetzij leiden klinische of laboratorium toepassingen. Deze ex vivo expansiestrategie maakt gebruik van een cocktail van de cytokine, gecombineerd met VPA behandeling. VPA is een FDA goedgekeurd geneesmiddel voor de behandeling van bipolaire wanorde en andere neurologische ziekten. De uitbreiding van de HSC met VPA zit prompt en treedt op binnen de 7 dagen, minimaliseren van de tijd van manipulatie en het risico van besmetting. Nog belangrijker is, kan dit protocol voor de verwerving van langdurige HSC fenotypische markeringen zoals CD90 en CD49f binnen 24-48 h na behandeling met VPA9. Uitgebreide HSC transplantaten gemaakt met dit protocol hebben de capaciteit om te regenereren van het hematopoietische systeem aangezien zij kunnen in alle geslachten van hematopoietische cel onderscheiden en op de lange termijn engraftment na transplantatie in myeloablated NSG muizen modellen4. Dit protocol is bovendien zeer reproduceerbaar en zorgt voor de efficiënte en snelle isolatie van levensvatbare CD34+ cellen van UCBs, die is van cruciaal belang voor de industrialisering van deze procedure.
De VPA ex vivo uitbreiding protocol heeft ook het potentieel om te overwinnen van het verlies aan HSCs die optreedt tijdens de gene11bewerken. Gene bewerken vereist blootstelling aan cytokines, die nodig voor fietsen cellen en activering van DNA-reparatie mechanismen zijn. Als gevolg van de snelle effecten van VPA behandeling, kan deze methode voordelig zijn voor de generatie van een hoger aantal genetisch gemodificeerde cellen binnen een termijn die relevant is voor momenteel gene wijziging protocollen gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het HSC ex vivo uitbreiding protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van onderzoek aan Mount Sinai School of Medicine.
1. de buffer en de voorbereiding van de Media
- Bereiden van scheiding buffer 24 h vóór Isolatievan CD34+ cellen van UBCs door toevoeging van 2 mL 0,5 M ethyleendiamine Tetra-azijnzuur (EDTA) en 33 mL 7,5% bovien serumalbumine (BSA) 465 mL gebufferde zoutoplossing (1 x PBS). Meng voorzichtig en handhaven van de buffer's nachts bij 4 ° C.
- Warme media bij kamertemperatuur op de dag van zuivering.
2. isolatie van mononucleaire cellen (MDL) van UCB eenheid
- Het geheel van UCB afzien in een maatkolf van 75 cm2 . Verdun en meng voorzichtig de UCB met een gelijk volume van PBS bij kamertemperatuur.
- Bepaal het aantal buisjes vereist voor de verwerking van het geheel van UCB (een tube van 50 mL conische kan worden gebruikt voor het verwerken van 35 mL verdunde UCB). Voeg toe 15 mL dichtheid kleurovergang media (Zie Tabel van materialen) aan elke buis en afzien van de verdunde UCB op de bovenkant van de dichtheid kleurovergang media maken twee lagen.
Opmerking: Afzien van de verdunde UCB heel langzaam terwijl de buis in een hoek van 45° ter voorkoming van de vermenging van de dichtheid kleurovergang media laag met de UCB. - Centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten in een lage versnelling en vertraging tempo. Na het centrifugeren Zoek MDL in de witte laag (buffy coat) tussen het plasma en dichtheid kleurovergang media-laag.
- Langzaam gecombineerd 2/3 van het plasma zonder verstoring van de buffy coat laag. Breng zorgvuldig de buffy coat-laag in een nieuwe tube van 50 mL. Alle MDL van dezelfde UCB eenheid verzamelen in een tube van 50 mL tot het bereiken van 25 mL. Gebruik een nieuwe tube als de hoeveelheid verzamelde multinationals groter is dan 25 mL.
- Voeg 25 mL koude PBS in de buis met 25 mL van multinationals en meng goed. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Koude PBS is belangrijk ter voorkoming aftopping van antilichamen op het celoppervlak en vermindering van de niet-specifieke etikettering. - Zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd en zachtjes resuspendeer de pellet cel in 50 mL koude PBS.
- Verwijder 20 μL van de celsuspensie om te tellen. Graaf het celaantal gekleurd met acridine oranje/propidium jodide kleuring met behulp van een geautomatiseerde cel teller. Bereken het totale aantal multinationals.
Opmerking: De telling van de cel kan ook worden uitgevoerd door de trypan blauwe uitsluiting methode met behulp van een hemocytometer. - Centrifugeer bij 400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
Opmerking: Indien niet onmiddellijk nodig kunnen mediterrane derde landen worden bevroren in dit stadium.
3. isolatie van in CD34+ cellen van UCBs
- Voorbereiden van de CD34+ antilichaam gekoppeld met magnetische kralen oplossing voor isolatie van CD34+ cellen van MDL. Mix 300 µL van scheiding buffer met 100 µL van menselijke FcR menselijke IgG (blokkerende reagens) en 100 µL van de magnetische kralen CD34 voor isolatie van CD34 + cellen uit elke 108 -multinationals. Voor het isoleren van een hoger aantal CD34+ cellen uit (> 108) MDL, opschalen reagentia dienovereenkomstig.
- Zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof uit de tube gecentrifugeerd bij stap 2.8. Resuspendeer de pellet in de CD34 magnetische kralen oplossing bereid in stap 3.1 (gebruik 500 µL van oplossing per 108 cellen).
- Meng voorzichtig en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
Opmerking: Voorbereiden van de cel scheidingsteken apparaat (Zie Tabel van materialen) tijdens de incubatieperiode. De opslagoplossing vervangen met de werkende buffer, zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant en een wassen programma gevolgd door een spoeldouche programma uitvoert. - Koude cel scheidingslijn loopt buffer naar de buis met het mengsel van de cel totdat de buis wordt volledig gevuld toevoegen. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in koude cel scheidingsteken met buffer (2 mL/108 cellen). Breng de 2 mL van cel schorsing mengsel in 15 mL tubes.
- 3 sets van 15 mL tubes laden in de cel scheidingsteken rack prechilled bij 4 ° C. Een set van buizen bevat multinationals, de tweede reeks van buizen worden gebruikt voor het verzamelen van de negatieve breuk en de derde set van buizen worden gebruikt voor het verzamelen van gezuiverde CD34+ cellen.
- Het rek in de cel scheidingsteken apparaat laden en het vooraf ingestelde programma van posseld2 uitgevoerd.
Opmerking: Een alternatieve methode die gebruikmaakt van handmatige magnetische scheidingsteken kan worden gebruikt ter vervanging van de cel scheidingsteken apparaat12 . - Centrifuge buizen met de positieve breuk bij 400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer gezuiverde CD34+ cellen in 1 mL serum-vrije media.
- Gekleurd met acridine oranje/propidium jodide met behulp van een geautomatiseerde cel counter cellen tellen.
Opmerking: Indien niet onmiddellijk nodig, gezuiverd CD34+ cellen kunnen worden bevroren in dit stadium.
4. VPA Ex Vivo uitbreiding van gezuiverde UCB-CD34+ cellen
- Bereiden van voldoende volume van media om de plaat van het gezuiverde CD34+ cellen bij een dichtheid van 3.3 x 104 cellen/mL. De samenstelling van cultuurmedia is serum kweekmedium gratis (Zie Tabel van materialen) aangevuld met 10 µL/mL pen/strep, 150 ng/mL stamcel factor (SCF), 100 ng/mL fms-achtige tyrosine kinase receptor 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), en 50 ng/mL Interleukine (IL-3) 3.
- Plaat gezuiverd CD34+ cellen in een 12-well bord (5 x 104 CD34+ cellen / 1,5 mL media / goed) en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Beoordelen van de zuiverheid van geïsoleerde CD34+ cellen en de samenstelling van de cel FACS analyse zoals hieronder beschreven in stap 6.3.
- VPA op een eindconcentratie van 1 mM in de culturen van cellen die zijn behandeld voor 16 h met cytokine cocktail toevoegen.
- Cultuur van de cellen voor een extra 7 dagen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
Opmerking: Media blijft ongewijzigd tijdens de duur van de ex vivo expansie.
5. antilichaam kleuring Stroom Cytometry p.a.
- Antilichaam-kleuring vlekken 2 x 104–6 x 104 cellen en isotype oplossing voor FACS gating strategie bepalen en bepalen van het niveau van niet-specifieke binding oplossing voor te bereiden. Verdun antilichamen (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) en de respectieve isotypes in 50 µL van scheiding buffer (samenstelling van scheiding buffer wordt gedefinieerd in stap 1.1).
Opmerking: Uitvoeren interne kleuring van cellen met elke antilichaam voor een FMO gating strategie. Totale antilichaam compensatie parelkit kan (Zie Tabel van materialen) worden gebruikt voor de installatie van de compensatie. - Meng de celcultuur waarbij meerdere keren. Cellen en Pipetteer 5 x 104 cellen tellen in een 1,5 mL-buis.
- Voeg 1 mL scheiding buffer en centrifuge bij 400 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 µL van de kleurstofoplossing. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 450 µL van scheiding buffer en centrifuge bij 400 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 µL van scheiding buffer. Houd cellen op ijs gedurende ten minste 5 minuten tot het uitvoeren van FACS analyses. Voeg 1 µL van 7-AAD aan de poort van levensvatbare cellen.
- Het monster van gekleurde cel op de machine FACS laden en het verwerven van cellen bij het laagste debiet.
- Voor elke fluorophore, door de isotype besturingselementen en één gekleurd cellen instellen voor FITC (CD90), APC (CD34) en PerCP/Cy5.5 (7-AAD) kleuring gating te analyseren.
- Poort van PerCP/Cy5.5 negatieve breuk en plot APC vs FITC om te bepalen van het percentage van levensvatbare CD34+, CD90+, en CD34+CD90+ cellen waarin de HSPC/HSC-bevolking in de cultuur.
6. antilichaam kleuring voor stroom Cytometry cel sorteren
- Resuspendeer de uitgebreide cellen waarbij meerdere keren. Het aantal cellen tellen en breng de hele cultuur in een buis 15 mL of 50 mL.
- Opvullen van de buis met koude scheiding buffer
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Antilichaam-kleuring oplossing om vlek van 5 x 105– 2 x 106 cellen en isotype oplossing vlek 1 x 105 cellen en bepalen FACS gating voorbereiden. Verdund 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) antilichamen en de bijbehorende isotypes in 500 µL van scheiding buffer per elke voorwaarde.
- De besturingselementen voor het compensatie van één kleur met behulp van een totale antilichaam compensatie parelkit volgens de instructies van de fabrikant voor te bereiden.
- Het supernatant van stap 5.2 overboeken naar een nieuwe buis en houd het bij 37 ° C. Deze cultuur media zal opnieuw worden gebruikt voor de cultuur van de gesorteerde cellen.
- Resuspendeer de pellet cel in koude scheiding buffer te verkrijgen van een concentratie van 5 x 10-5 cellen / mL. Pipetteer 1 x 105 cellen in 1,5 mL tubes voor isotype kleuring en de resterende cellen die zullen worden gesorteerd in andere 1,5 mL tubes.
- Centrifugeer de buizen bij 400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer pellets van cellen in isotype kleuring van de oplossing en de pellet van cellen die wordt gesorteerd in het antilichaam kleurstofoplossing.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 450 µL van scheiding buffer en centrifuge bij 400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellets met 2 mL koude scheiding buffer.
- Filteren om te voorkomen klompen, de monsters door een 40 μm cel zeef en op ijs tot FACS.
- Set-up cel sorter voor sorteren met de juiste parameters.
- Isotype voorbeelden voor het instellen van de spanning en winst voor forward en kant scatter en identificeren van negatieve fluorescentie populaties uitvoeren.
- Besturingselementen voor stormloop één kleur compensatie coëfficiënten instellen en toepassen gecompenseerd parameter collectie protocol.
- Een kleine hoeveelheid van het monster (Ab) (~ 50.000 evenementen) om de gating strategie uitvoeren.
- Instellen van soort besluiten voor het verzamelen van de CD34+ CD90- cel breuk.
- Soort cellen in collectie buizen bekleed met 2 mL scheiding buffer.
- Na sortering, vertellen de cellen samen en centrifugeer ze bij 400 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in de media hersteld in stap 5.5 te bereiken een eindconcentratie van 3 x 104 cellen/mL.
- Plaat CD34+ CD90- cellen in 12-Wells-platen met 1,5 mL medium/goed gezuiverd (5 x 104 CD34+ CD90- cellen/1,5 mL media per putje).
- Beoordelen de zuiverheid door FACS analyse met behulp van 50 µL van media met cellen.
- Behandelen van de culturen van CD34+CD90 cellen van de- met VPA bij eindconcentratie van 1mM.
- Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ex vivo protocol beschreven hier verhoogt het aantal primitieve HSCs gegenereerd op basis van CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs (Figuur 1). Priming van CD34+ cellen voor 16 h met een cytokine cocktail, gevolgd door behandeling met VPA voor een extra 7 dagen, leidt op voor een grote mate van HSC expansie. Opmerkelijk is de pool van uitgebreide cellen is hoogverrijkt voor HSCs, die zijn fenotypische gedefinieerd door CD34+CD90+ markeringen. Het totale aantal genucleëerde cellen (TNCs) in culturen de cytokine cocktail alleen behandeld is aanzienlijk hoger is dan het aantal cellen waargenomen in culturen met de cytokine cocktail en VPA (figuur 2A) behandeld. Ondanks het hogere aantal TNCs, het nummer van HSCs in de culturen ontvangen de cytokine cocktail alleen laag blijft gedurende de hele uitbreiding ten opzichte van culturen behandeld met de cytokine cocktail en VPA (figuur 2B). Het grootste aantal HSCs wordt gegenereerd in culturen, behandeld met een combinatie van de cytokine cocktail en VPA (figuur 2B). In het bijzonder, wordt de grootste uitbreiding van het aantal HSCs bereikt na 5-7 dagen na de behandeling van de VPA (figuur 2B). Het toegenomen aantal HSCs correleert met een snelle stijging van het percentage van de HSCs, die is opmerkelijk binnen de 24u van VPA behandeling (figuur 2C). Terwijl de stijging van het percentage van de HSCs hoog en onderhouden tijdens de eerste 4 dagen van ex vivo cultuur is, neemt het geleidelijk na 5 – 7 dagen van behandeling met VPA (figuur 2C). Deze daling is echter omgekeerd gecorreleerd met een toename van het absolute aantal HSCs.
Nog belangrijker is, is de snelle stijging van het percentage van de HSCs waargenomen in VPA behandeld culturen als gevolg van de overname van de CD90 fenotype. CD34+ cellen uiten de CD90 fenotypische marker bereikt bijna 40% – 45% van de cellen in ex vivo culturen voor 4 dagen (figuur 2C,D) met de cytokine cocktail en de VPA behandeld uitgebreid. De overname van de CD90 fenotype is verder bevestigd door ex vivo expansie van de hoogst gezuiverde CD34+ cellen die ontbreken uitdrukking van de CD90 markering. Binnen de 24u van VPA behandeling, bijna 75% van de ex vivo uitgebreid cellen in culturen gestart met gesorteerde CD34+CD90- cellen express CD90 in tegenstelling tot 0% van de cellen in culturen met de cytokine cocktail alleen (figuur 2E). Nog belangrijker is, is het fenotype CD90 zeer behouden tijdens de eerste 4 dagen in ex vivo culturen VPA (figuur 2E) behandeld.
Figuur 1: schematische voorstelling van ex vivo uitbreiding cultuur. Gezuiverd CD34+ cellen uit UCBs zijn primer voor 16u in ex vivo cultuur aangevuld met een combinatie van de aangegeven cytokinen. Culturen worden behandeld met VPA (1mM) voor een extra 7 dagen. De ex vivo de uitgebreide cellen vervolgens in myoablated NSG muizen kunnen worden getransplanteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: VPA behandeling activeert de verwerving van CD90 resulterend in de uitbreiding van een groot aantal HSCs. (A) Absolute aantal totaal aantal levensvatbare genucleëerde cellen uitgebreid ex vivo culturen9. Gezuiverd CD34+ cellen van de UCBs beschreven in punt 3 behandeld met cytokine cocktail alleen of een combinatie van cytokine cocktail en VPA zoals beschreven in sectie 4 werden geteld door acridine oranje/propidium jodide kleuring (n = 16). Getallen aanduiden dagen van behandeling met VPA, overwegende dat de PC geeft het primaire onbeschaafd CD34+ cellen geïsoleerd van UCBs. (B, C) Absolute aantal en percentage van CD34+CD90+ cellen gedurende 7 dagen in ex vivo culturen uitgebreid behandeld met cytokine cocktail alleen of een combinatie van cytokine cocktail en VPA (n = 21). Percentage van CD34+CD90+ cellen wordt bepaald door de stroom cytometry analyse van cellen gekleurd zoals beschreven in sectie 4. (D) fenotypische analyse van gesorteerde CD34+ cellen van UCBs (stap 5.3) uitgebreid ex vivo culturen behandeld als geïndiceerd voor 4 dagen. Linker paneel geeft de gating strategie met behulp van isotype kleuring overwegende dat de andere deelvensters aangeven gekleurde cellen in culturen met cytokine cocktail alleen of een combinatie van cytokine cocktail met VPA uitgebreid. Getallen geven het percentage van de CD34-CD90+ cellen, CD34+CD90- cellen en CD34+CD90+ cellen. (E) Percentage van CD34+CD90+ cellen uitgebreid in culturen gestart met gesorteerd op CD34+CD90- van UBCs cellen en behandeld met cytokine cocktail alleen of een combinatie van cytokine cocktail en VPA voor de aangegeven dagen. Percentage wordt bepaald door de stroom cytometry analyse (n = 4). N: aantal biologische wordt gerepliceerd. Foutbalken met SEM; p ≤ 0,0001 zoals bepaald door de negatief-binomiale modellen voor A en B, Beta modellen voor D en 2-way ANOVA for the panel E. panelen A-C en E zijn gewijzigd van Papa et al.9Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin presenteren wij een protocol om snel uit te breiden tot een aanzienlijke mate het aantal functionele menselijke HSCs van UCBs. De pilot en kinetische studies met behulp van dit protocol aangeven dat de ex vivo uitgebreide cellen snel verwerven en behouden van de expressie van verschillende HSC fenotypische markers waaronder CD90 evenals primitieve HSC metabole kenmerken9.
Dit ex vivo uitbreiding protocol is relatief eenvoudig en betrouwbaar. Zuivering van CD34+ cellen met de cel scheidingsteken apparaat (Zie Tabel of Materials) is zeer reproduceerbaar zijn en snel, waardoor snel herstel van geïsoleerde cellen. Deze methode resulteert in een hoog rendement van gezuiverde CD34+ cellen (> 90%) in tegenstelling tot de scheiding van de handmatige immunomagnetic. Bovendien, dit ex vivo uitbreiding protocol vereist geen speciale en complexe apparaten of systemen van de fed-batch cultuur moeten continu aanvoer van grote hoeveelheden verse media aangevuld met cytokines3,13. Daarom beperkt deze methode kosten. Nog belangrijker is, voorziet dit protocol in de uitbreiding van het zwembad van de HSC binnen een korte tijd, die een belangrijke beperkende factor voor besmetting frequentie is.
Verscheidene punten moeten worden beschouwd voor het bereiken van de primitieve HSCs uit CD34+ cellen met behulp van dit protocol. CD34+ cellen uitgebreid voor 4 dagen in culturen met de cytokine cocktail en VPA leiden tot de generatie van een pool van primitieve lange HSCs behandeld. Deze HSCs worden gekenmerkt door de expressie van de hoge niveaus van CD34, CD90 en CD49f, maar ook door een zeer primitieve metabole profiel, die voornamelijk gebaseerd is op glycolyse9. Tijdens meer langdurige incubatie met VPA gedurende 7 dagen, uitgebreide culturen echter zijn heterogener en bevatten een groter aantal zowel op lange termijn en korte termijn, evenals gedifferentieerde cellen in tegenstelling tot cellen uitgebreid voor 4 dagen. Dit resultaat is voornamelijk het gevolg van de uitputting van de VPA in de cultuur en grote aantal celdelingen9. Dus, dit protocol kan worden gebruikt om de uitbreiding van twee verschillende zwembaden van cellen: 4-daagse en 7-daagse uitgebreide cellen. De 7-daagse expansie-product kan worden gebruikt voor allogene HSC-transplantatie waar meer snelle zo goed als duurzame multilineage engraftment vereist is. Het 4-daagse uitbreiding protocol mogelijk geschikt voor genetische modificatie strategieën die gericht zijn op lange termijn herbevolking cellen. Het is ook waarschijnlijk dat deze combinatie van VPA en cytokine cocktail het zwembad van HSCs van CD34 uitbreiden kunt+ cellen op eenzelfde of hoger bij het gebruik van andere media dan de media (Zie Tabel van materialen) in dit protocol gebruikt.
Huidige gen bewerken procedures worden geassocieerd met een aanzienlijk verlies aan HSCs, die hun klinische toepassing beperken. Het grote aantal primitieve HSCs bereikt binnen 2-4 dagen na behandeling van de VPA in ex vivo culturen heeft het potentieel om dit verlies in HSC aantallen overwinnen. Dus, dit protocol kan gunstig zijn voor de verbetering van het bestaande gen protocollen bewerken en inschakelen van correctie van genetische mutaties in HSC-transplantatie gebaseerde therapieën voor β-thalassemie en sikkelcelziekte. Bovendien, het kan worden toegepast om grote aantallen van HSCs tijdens gene manipulaties voor studies gericht op de opheldering van gene functies in HSCs en in Haematopoiese.
Kortom, de hier beschreven methode kan worden gebruikt voor ex vivo uitbreiding van zowel menselijke als lymfkliertest HSCs en kan worden afgestemd op specifieke klinische toepassingen alsook over een breed spectrum van onderzoeken bij het basisonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NYSTEM C030136 toekennen R.H. Wij wil Bartek Jablonski bedanken voor zijn feedback en herziening van het manuscript
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
- Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
- Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
- Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
- Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
- Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
- Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).
