Summary
इसमें हम चूहों में बाएं-पूर्व अवरोही कोरोनरी धमनी के स्थायी लिगेशन को प्राप्त करने के तरीके को दर्शाते हुए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इस मॉडल को उच्च प्रासंगिकता के लिए मायोकार्डियल इन्फेक्शन और सहवर्ती जैविक प्रक्रियाओं के pathophysiology की जांच है.
Abstract
मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) और तीव्र कोरोनरी रोग पश्चिमी जीवन शैली के साथ आबादी में मौत के सबसे प्रमुख कारणों में से एक हैं। बाएं-पूर्व अवरोही (एलएडी) कोरोनरी धमनी के स्थायी लिगेशन के साथ एमआई के murine मॉडल बारीकी से मानव में एमआई नकल करता है। Murine मॉडल आजकल उपलब्ध व्यापक आनुवंशिक इंजीनियरिंग से लाभ. यहाँ हम स्थायी लाड कोरोनरी लिगेशन द्वारा मायोकार्डियल इन्फेक्शन के एक reproduible murine शल्य मॉडल का प्रस्ताव. हमारी तकनीक ketamine / xylazine के साथ संज्ञाहरण शामिल है कि तेजी से एक विरोधी के प्रशासन द्वारा उलट जा सकता है, यांत्रिक की मदद से वेंटिलेशन के लिए tracheotomy के बिना intubation, extrinsic सकारात्मक के आवेदन के साथ वेंटिलेशन कूपिका पतन से बचने के लिए अंतिम-एक्सपायरी दबाव (पीईपी), कंकाल की मांसपेशियों के लिए किए गए न्यूनतम सर्जिकल घावों को सीमित करने वाली एक thoracotomy विधि, और थोरेसेंटेसिस के बिना फेफड़ों की मुद्रास्फीति। इस विधि विरल आक्रामक है, reproduible और बाद सर्जरी मृत्यु दर और जटिलताओं को कम कर देता है.
Introduction
तीव्र मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) इस्कीमिक हृदय रोगों (आईएचडी) की सबसे गंभीर अभिव्यक्ति है। IHD दुनिया भर में रुग्णता और मौत का प्रमुख कारण हैं, विशेष रूप से पश्चिमी देशों में1. नतीजतन, यह स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली2पर एक भारी आर्थिक प्रभाव पड़ता है. एमआई atherosclerotic पट्टिका द्वारा एक कोरोनरी धमनी के occlusion और मायोकार्डियम के बड़े हिस्से में रक्त के प्रवाह के बाद गिरफ्तारी की विशेषता है। मायोकार्डियम में ऑक्सीजन की आपूर्ति की कमी कार्डियोमायोसाइट्स की इस्कीमिक मौत की ओर जाता है। यह रोग की स्थिति वेंट्रिकुलर ऊतक में प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करती है जो अंततः वेंट्रिकुलर कार्यों, फिर से तैयार करने और दिल की विफलता3में कमी की ओर ले जाती है। एमआई एक जटिल pathophysiological हालत है कि कई और जटिल जैविक प्रक्रियाओं विनियमित सेल मौत, ऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन, घाव भरने, फाइब्रोसिस और वेंट्रिकुलर remodeling के लिए प्रतिक्रिया शामिल है। इन जैविक प्रतिक्रियाओं में से कुछ को इन विट्रो में अलग-अलग प्रक्रियाओं के रूप में मॉडलिंग की जाती है जैसे कि क्षति-संबद्ध आण्विक पैटर्न और संबद्ध भड़काऊ प्रतिक्रियाओंकीरिहाई। इन सरलीकृत मॉडल एमआई को समझने के लिए आवश्यक हैं. हालांकि केवल एक में vivo मॉडल एमआई के जवाब में लगे जैविक प्रक्रियाओं जटिलता की एक यथार्थवादी छवि प्रदान कर सकते हैं.
हालांकि सूअर की तरह बड़े जानवरों में एमआई के मॉडल और अधिक बारीकी से एमआई के मानव pathophysiology से संबंधित हो सकता है, murine मॉडल की शक्ति आनुवंशिक इंजीनियरिंग है कि किसी भी अन्य स्तनपायी प्रजातियों की तुलना में अधिक उन्नत है द्वारा की पेशकश की संभावनाओं में रहता है. अन्य गैर-नकारात्मक पहलुओं रिश्तेदार कम लागत और शल्य सेटअप की सादगी कर रहे हैं.
यह उल्लेख करने के लायक है कि मायोकार्डियम के इस्कीमिया-रिफ्यूजन के मॉडल स्थायी एमआई मॉडल की तुलना में विभिन्न परिणामों को प्रदर्शित कर सकते हैं। जैव प्रक्रियाओं जैसे कोशिका मृत्यु के प्रकार लगे हुए , गुणवत्ता / आयाम या सूजन की गतिज और मायोकार्डियल ऊतक में घाव भरने प्रतिक्रियाओं के मॉडल के अनुसार भिन्न हो सकते हैं5,6,7. हालांकि, स्थायी कोरोनरी occlusion के इस प्रोटोकॉल आसानी से एक इस्किमिया-रिफ्यूजन मॉडल प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
यह विधि प्रतिकर्षण के बिना एमआई के फिजियोपैथोलॉजी से संबंधित अध्ययनों के लिए प्रासंगिक है और स्थानीय हृदय ऊतक और प्रणालीगत में कोरोनरी अधिग्रहण (मिनट) से होने वाली पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं की निगरानी की अनुमति देती है स्तर.
Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित पशु प्रयोगों की समीक्षा की गई और वाड के कैंटन की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
नोट: इन प्रयोगों के लिए, हम 25 ग्राम और 30 ग्राम और 8-12 सप्ताह की उम्र के बीच वजन पुरुष C57Bl/6J चूहों का इस्तेमाल किया. चूहे चाउ छर्रों और पानी विज्ञापन libitum खिलाया और पारंपरिक परिस्थितियों में पैदा किया गया. सर्जिकल उपकरण पहले बाँझ था. प्रयोगकर्ता बाँझ शल्य दस्ताने और एक शल्य मुखौटा पहनने के लिए संदूषण और बाद ऑपरेटिव संक्रमण को सीमित करना चाहिए.
1. संज्ञाहरण और श्वासनली कैनुलेशन।
- संवेदनाहारी दवाओं की खुराक निर्धारित करने के लिए माउस वजन, पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक दवा और वेंटीलेटर की ज्वारीय मात्रा. 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पैड को प्री-वार्म करें। शल्य सेटअप चित्र 1में दर्शाया गया है।
- केटामाइन और जाइलज़ीन के मिश्रण के साथ क्रमशः 80 मिलीग्राम/किग्रा और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर माउस को इंट्रापर्टोनली इंजेक्शन करें।
- जल्दी से गले पर माउस फर दाढ़ी और रिब पिंजरे के बाईं ओर एक बिजली के रेजर का उपयोग कर.
- पूंछ और /या पिछले पैर pinching द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें और हीटिंग पैड पर एक सुपाच्य स्थिति में जानवर व्यवस्थित। आंखों के गर्म होने से बचने के लिए जानवर के सिर के नीचे एक छोटी सी धुंध संपीड़न रखें। आंखों के सूखापन से बचने के लिए नेत्र जेल लगाएं।
- हीटिंग पैड की सतह पर चिपकने वाला टेप के साथ चार अंगों को सुरक्षित करें। ऊपरी छेदक के तहत 5-0 रेशम सीवन के एक पाश पास और हीटिंग पैड पर चिपकने वाला टेप के साथ पाश की चरम सीमा छड़ी। यह जानवर के मुंह को खुला रखने के लिए और cannulation की सुविधा होगी.
- पूर्व-शेड क्षेत्रों पर हेयर रिमूवल क्रीम लागू करें और 1 मिनट के लिए कपास झाड़ू से धीरे से मालिश करें। फर और क्रीम की अधिकता को धुंध के साथ साफ करें। चीरा क्षेत्रों को साफ करने के लिए 0.9% नमकीन समाधान और धुंध की बूंदों का उपयोग करें। मुंडा गले और छाती पर बाँझ धुंध के टुकड़े लागू करें और उन्हें iodopovidone में लेना।
नोट: हम चीरों साइटों के लिए एक स्थानीय संवेदनाहारी दवा (lidocaine या bupivacain) के आवेदन की सलाह देते हैं. - वेंटीलटर को 7 एमएल/किग्रा की ज्वारीय मात्रा और 140 स्ट्रोक/मिनट की वेंटिलेशन दर पर सेट करें।
नोट: अब से एक माइक्रोसर्जरी स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काम पर। - गले के केंद्र पर त्वचा पकड़ो और छोटे कैंची का उपयोग कर एक पुच्छल / शिरस्य रेखा के बाद 0.5 सेमी का चीरा प्रदर्शन। लार ग्रंथि के खण्डों को अलग करें, फिर गला और श्वासनली दिखाई देने तक घुमावदार विच्छेदन संदबे के साथ स्टर्नोहाइइड मांसपेशियों के फासिया को धीरे से अलग करें। लोचदार बैंड से जुड़े आकुंचकों के साथ उद्घाटन के सुरक्षित किनारे।
नोट: मांसपेशियों के चीरा के बिना इस कदम करो. एक प्रशिक्षित ऑपरेटर इस कदम को वैकल्पिक बनाने श्वासनली के दृश्य के बिना मौखिक गुहा के माध्यम से जानवर को इंटूबेट करने में सक्षम होगा। - जीभ को बग़ल में धीरे से पकड़ें। संदंश के साथ, श्वासनली में 16 जी कैनुला की कुंद की भीतरी सुई डालें। गले चीरा के माध्यम से श्वासनली में सही प्रविष्टि कल्पना.
- कैनुला को वेंटीलेटर से कनेक्ट करें और निकास ट्यूबिंग को पानी में रखकर सही वेंटिलेशन सुनिश्चित करें। बुलबुले की उपस्थिति सही intubation इंगित करता है.
नोट: ऑपरेशन के दौरान ऊतकों को गीला रखने के लिए बाँझ धुंध को गले के चीरे पर 0.9% नमकीन घोल और iodopovidone के साथ भिगोदिया जाता है। प्रक्रिया के दौरान नमी को नियंत्रित करें।
2. बालक कोरोनरी धमनी का लिगेशन
- डक्ट टेप से बाएं पूर्वकाल पंजा छोड़ें और माउस को दाईं ओर डेक्यूबिटस स्थिति में सावधानी से ले जाएं। एक बार जानवर सही स्थिति में है बाएं पूर्वकाल अंग को सुरक्षित करें।
- बाएं पेक्टोरेलिस माइनर और प्रमुख मांसपेशियों के बीच की रेखा को पहचानें और रेखा के बाद कैंची से 1 सेमी पर एक तिरछी त्वचा चीरा बनाएं। कुंद माइक्रो कैंची विच्छेदन के साथ, चीरा के बिना पेक्टोरालिस मांसपेशियों के अलग फासिया। लोचदार बैंड से जुड़े रिट्रैक्टर ्स्सकेर से अलग पेक्टोरिलिस मांसपेशियों को बनाए रखें।
- 3 सेमी एच2हे के सकारात्मक अंत-समाप्तिदबाव दाब (पीईपी) के साथ वेंटीलेटर सेट करें।
- 3 rd और 4th पसलियों के बीच 3rd इंटरकोस्टल अंतरिक्ष पर कुंद संदंश का उपयोग करके छाती गुहा खोलें। आंतरिक वक्ष धमनी को छूने से बचें क्योंकि रक्तस्राव का खतरा है। दिल या फेफड़ों को स्पर्श न करें। रिबकेज में दो रिट्रैक्टर लागू करें, प्रत्येक रिब पर एक (चित्र 2A)।
- एक घुमावदार ठीक संदंश के साथ, ध्यान से हृदय और फेफड़ों को नुकसान पहुंचाए बिना इसे दूर करें।
- बाईं ओर उतरते (LAD) कोरोनरी धमनी का पता लगाएँ. बालक धमनी एक सतही चमकदार लाल रेखा के रूप में प्रकट होती है जो बाएँ कर्ण के किनारे से शीर्ष की ओर चल रही है।
- एक सुई धारक का उपयोग करने के लिए बालक के तहत एक 7-0 रेशम सीवन पारित करने के लिए 2 से 3 मिमी नीचे छोड़ दिया atria. दिल के ऊतकों के फाड़ से बचने के लिए धीरे-धीरे रेशम खींचो। लिगेचर को तीन गाँठों के साथ बाँधें। बाएँ वेंट्रिकल का निचला बायां भाग लिगेशन पर तुरंत पीला पड़ जाएगा (चित्र 2ठ-ई)
नोट: वेंट्रिकुलर गुहा में बहुत गहरी नहीं जाना या बहुत सतही रहने के लिए महत्वपूर्ण है। शर्म से संचालित जानवरों के लिए, एलएडी के नीचे सीवन रेशम को खींचें और इसे धीरे-धीरे ऊतक फाड़ने से बचें। - रिब रिट्रैक्टर्स को छोड़ें, 3आरडी रिब को संदके के साथ रखें और 3आर और 4वें पसलियों के नीचे 6-0 रेशम सीवन के साथ दो पास बनाएं।
चेतावनी: दिल या फेफड़ों को छिद्रित न करें। अभी तक समुद्री मील कस मत करो. - उद्घाटन पर 37 डिग्री सेल्सियस 0.9% नमकीन समाधान की तीन बूँदें रखो और 2 या 3 श्वसन चक्र के लिए समय सीमा समाप्ति निकास ट्यूब बंद करने के लिए ठीक से फेफड़ों फुलाना. सीवन कस और दो फेंक के साथ सुरक्षित.
- मांसपेशियों को पकड़े हुए आकुंचकों को रिलीज करें और उन्हें अपनी सही जगह पुनः प्राप्त करने में मदद करें।
- 5-0 सीवन रेशम के दो टांके के साथ बंद वक्ष त्वचा और दो फेंकता के साथ सुरक्षित. 5-0 सीवन रेशम के एक सिलाई के साथ गले की त्वचा को बंद करें और दो थ्रो के साथ सुरक्षित करें।
3. पोस्ट-ऑपरेटिव प्रक्रियाओं और अनुवर्ती.
- अंगों से चिपकने वाला टेप बैंड निकालें। जानवर के दाईं ओर हीटिंग पैड पर एक सेक रखो.
नोट: संज्ञाहरण से इस बिंदु तक की समग्र प्रक्रिया में 40-45 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए। जागने की प्रक्रिया को गति देने के लिए 0.1 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता में आईपी 0.2 एमएल एटिपामेज़ोल इंजेक्ट करें। - अंतःपरीक्षेत 0.3 एमएल 5% ग्लूकोज घोल 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म्ड इंजेक्ट करता है।
- ध्यान से सेक पैड पर अधर decubitus पर जानवर बारी।
- वेंटीलेटर बंद करो; यदि माउस स्वतः साँस लेता है, सावधानी से cannula हटा दें.
- इंजेक्शन subcutaneous (एससी) 0.1 mg/kg buprenorphine और एक पूर्व गर्म पिंजरे में चूहों डाल 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्म और एक 100% O2 के साथ हवादार 1 h. मॉनिटर चूहों किसी भी जीवन के लिए खतरनाक हालत जैसे अत्यधिक डिस्पनिया या हेमोरेज के रूप में किसी भी जीवन की धमकी हालत के लिए.
- सर्जरी के बाद दो पहले दिनों के दौरान, दो बार दैनिक माउस की निगरानी. एस.सी.सी. 0.1 मिलीग्राम/किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन को दैनिक दो बार इंजेक्शन करें। इंट्रापर्टोनली 0.3 एमएल 0 5% ग्लूकोज समाधान को दैनिक रूप से दो बार इंजेक्ट करता है। नरम आहार और पानी विज्ञापन libitum के साथ चूहों प्रदान करें. यदि आवश्यक हो तो जानवर को गर्म करें।
नोट: opioids के अलावा, जानवरों nonsteroidal विरोधी भड़काऊ आहार में मिश्रित दवाओं या पीने के पानी में पतला के साथ प्रदान किया जाना चाहिए. - तीन दिन से, अनुसूचित जाति 0.1 मिलीग्राम/ यदि जानवर अभी भी वजन कम कर रहा है तो इंट्रापर्टोनली 5% ग्लूकोज समाधान का 0.3 एमएल प्रतिदिन दो बार इंजेक्ट करता है। यदि आवश्यक हो तो जानवर को गर्म करें।
नोट: अत्यधिक पीड़ा से बचने के लिए आवश्यक होने पर सख्ती से पूर्वनिर्धारित रुकावट मानदंड लागू करें। आमतौर पर चूहों दिन 3 और 4 तक वजन कम और फिर वजन बढ़ाने. सात दिनों के बाद, चूहों आमतौर पर पूर्व आपरेशन वजन पुनः प्राप्त.
Representative Results
चूहे को सर्जरी के सात दिन बाद इच्छामृत्यु दी गई। पशुओं को 80 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम जाइलज़ीन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया था। संज्ञाहरण के तहत, रक्त वेना cava से तैयार किया गया था और दिल का नमूना था. Atria हटा दिया गया, मायोकार्डियम बर्फ ठंडा पीबीएस में धोया गया. इस्कीमिक क्षेत्रों की माप के लिए, दिल 40 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे, फिर कटा हुआ और पीबीएस में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए दाग 2% triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) युक्त। दिल स्लाइस कमरे के तापमान पर 4% बफर paraformaldehyde समाधान में रात भर तय कर रहे थे. इस्केमिक क्षेत्र बेदाग रहे जबकि जीवित ऊतक डिहाइड्रोजनेज की उपस्थिति के कारण लाल रंग में दागा गया था। इस्केमिक क्षेत्रों की गणना एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर (चित्र3क, बी) के साथ बाएं वेंट्रिकल (एलवी) के सफेद क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में की गई थी। जैव रासायनिक और आण्विक जीव विज्ञान विश्लेषण के लिए, दिल तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे. तरल नाइट्रोजन पर दिल पीसने के बाद अंग पाउडर प्रोटीन और MRNA निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया गया था। infarcted दिल के मायोकार्डियल ऊतक में फाइब्रोसिस की हद तक अल्फा चिकनी-मांसपेशी actin के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था ($SMA) और SMAD2 फॉस्फोरिलेशन, जो क्रमशः प्रमुख रीड-आउट हैं myofibroblasts और TGF के संकेत सक्रियण ( चित्र 3C). Tgfbके MRNA अभिव्यक्ति , और बहाव लक्ष्य Ctgf, Postn और Il11 मायोकार्डियल फाइब्रोसिस के सभी संकेतक हैं. यह वास्तविक समय पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) विश्लेषण (चित्र 3 डी) द्वारा दिखाया गया था।
प्रो भड़काऊ संकेतन रास्ते और समर्थक भड़काऊ जीन की अभिव्यक्ति आम तौर पर मायोकार्डियल इंफार्क्शन के बाद पहले सप्ताह के भीतर सक्रिय पाया गया. एनएफ-जेडबी च65 प्रतिलेखन कारक का फॉस्फोरिलेशन सूजन की पहचान है और एमआई चूहों के पूरे मायोकार्डियम निष्कर्षों में देखा गया था (चित्र 3E)। प्रो भड़काऊ जीन Il1b, Il6 और Cxcl10 (चित्र 3 F) और monocytes/मैक्रोफेज मार्करCd14 और Mertk की MRNA अभिव्यक्ति वास्तविक समय पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया (चित्र 3 जी) . ध्यान दीजिए कि एनएफ-जेडबी च्65 तथा स्माड2 फॉस्फोरिलेशन (चित्र3 ब्,म्,लेन 4-7) की सीमा में परिवर्तनशीलता थी। यह परिवर्तनशीलता काफी हद तक infarct के आकार पर निर्भर करता है.
चित्र 1 : शल्य सेटअप का विवरण. (ए) सर्जिकल सेटअप में एक संशोधित हीटिंग पैड, एक वेंटीलेटर और लोचदार बैंड से जुड़े रिट्रैक्टर शामिल हैं। (बी) शल्य चिकित्सा के दौरान प्रयुक्त कैंची, बलप और सुई धारक का सेट। (ग) मिनी-रिट्रैक्टर्स का क्लोज-अप। नहीं दिखाया: सर्जिकल स्टीरियो माइक्रोस्कोप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : सर्जरी और बालक लिगेशन के प्रतिनिधि छवियों. (ए) आकुंचकों के साथ छाती खोली। बायां निलय स्पष्ट था. ऊपर, बाएँ और नीचे retractors ribcage आयोजित किया और सही retractor पेक्टोरेलिस मांसपेशियों आयोजित किया. (बी) सुई लाड के नीचे से गुजरी थी। (सी) सीवन रेशम बालक के नीचे, बाएं वेंट्रिकल में पारित किया गया था। (डी) लाड पर एकल सिलाई. (ई) लिगिंग प्रक्रिया के अंत में सीवन को तीन गाँठों के साथ सुरक्षित किया गया था। (च) हृदय के पूर्ववर्ती दृश्य का प्रतिनिधित्व। LAD लिगेशन की स्थिति 2-3 मिमी नीचे छोड़ दिया atria और बालक के विकर्ण शाखा के ऊपर था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : पूरे मायोकार्डियम में फाइब्रोसिस और सूजन सर्जरी के बाद सात दिन निकालता है। (क) सात दिन बाद सर्जरी के बाद कटा हुआ हृदय का दाग लगाने वाली टीटीसी की प्रतिनिधि छवियां। पीला इस्कीमिक क्षेत्रों unstained और सफेद बने रहे, जबकि लाइव ऊतक लाल दाग था. बाईं ओर से तीसरे टुकड़े पर लिगेशन दिखाई दे रहा था। (बी) पांच अफ़सोसित हृदयों के इस्कीमिक क्षेत्रों का आकार टीटीसी धुंधला तकनीक का उपयोग करके मापा गया था। परिणाम बाएं वेंट्रिकल (LV) के सफेद क्षेत्र का प्रतिशत थे. (ग) फाइब्रोसिस के संकेतक के रूप में पूरे मायोकार्डियम में SMAD2 फॉस्फोरिलेशन और अल्फा-SMA अभिव्यक्ति का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (डी) पूरे मायोकार्डियम अर्क में Tgfb, Ctgf, Postn और Il11 की mRNA अभिव्यक्ति. (प) पूरे मायोकार्डियम अर्क में एनएफ-जेडबी च65 फॉस्फोरिलेशन का पश्चिमी धब्बा। (च) पूरे मायोकार्डियम अर्क में समर्थक भड़काऊ जीन Il1b, Il6 और Cxcl10 की MRNA अभिव्यक्ति. (जी) क्रमशः मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और फैगोसाइटिक मैक्रोफेज के मायोकार्डियम में उपस्थिति के संकेतक के रूप में Cd14 और Mertk की mrNA अभिव्यक्ति। छ ] 3 में शम और छ ] 4 एमआई समूह में। MRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, अभिव्यक्ति अंतर्जात नियंत्रण Rps18 के सापेक्ष था और समूह तुलना unpaired छात्र टी परीक्षण थे, * पी $ 0.05, * * पी $ 0.01, * * * पी $ 0.001. पैनल में बी, डी, एफ और जी त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस प्रक्रिया का पहला महत्वपूर्ण कदम निश्चित रूप से intubation है. हम एक श्वासनली ट्यूब के रूप में एक 16 जी कैथेटर की कुंद भीतरी सुई का उपयोग करें. हम चूहों कि वजन कम से कम 22 ग्राम के साथ इस सेटअप का उपयोग करने की सिफारिश नहीं है. इस सेटअप के साथ, श्वासनली को नुकसान पहुँचाए बिना छोटे शरीर के वजन के साथ चूहों को ठीक से इन्टुबेट करना मुश्किल हो सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु श्वासनली और रिबकेज को उजागर करते समय मांसपेशियों के लिए किए गए चीरों को सीमित करना है। ऊतक क्षति को कम करना प्रमुख महत्व का है, खासकर जब एमआई के बाद सूजन प्रक्रियाओं का अध्ययन। यही कारण है कि हम मांसपेशियों और पसलियों को बलप और रिट्रैक्टर8,9 के साथ कोमल रूप से फैलाना पसंद करतेहैं. हम खून बह रहा10को नियंत्रित करने के लिए बिजली के क्यूटेराइज़र का उपयोग नहीं करते . यह iatrogenic जलता है और पक्ष संक्रमण का कारण बन सकता है. आघात और संक्रमण दोनों सूजन पढ़ने-आउट पूर्वाग्रह हो सकता है। thoracotomy के दौरान एक पानी ट्यूब सीमा अंत-निर्भया एवियोलर पतन में वेंटिलेशन निकास plunging द्वारा 3 सेमी एच2हे के एक बाहरी पीईपी का आवेदन। लाड का स्थानीयकरण एक और महत्वपूर्ण कदम है और यह ध्यान में रखना चाहिए कि कोरोनरी धमनियों की शरीर रचना विज्ञान तनाव और माउस11के जीनोटाइप के आधार पर भिन्न हो सकती है . यह कुछ अनुभव की आवश्यकता है LAD कल्पना करने के लिए, लेकिन सीवन सीधे रखने 2-3 प्रक्रिया में वर्णित के रूप में बाईं atria नीचे मिमी लिगेशन की सही स्थिति की अनुमति होगी. सीवन के तहत बाएं वेंट्रिकल के बड़े हिस्से का तत्काल मलिनकिरण सटीकता की पुष्टि करता है। अंत में, कृत्रिम रूप से छाती बंद करने के दौरान 2-3 श्वसन चक्र के लिए वेंटिलेशन निकास अवरुद्ध द्वारा ऑटो-पीईपी लागू करने से फेफड़ों के क्षणिक hyperinflation की अनुमति देता है जो वक्ष गुहा12से हवा का पीछा करने में मदद करेगा। हम जानबूझकर थोरैसेंटेसिस नहीं करते , जैसा कि 9,10में दिखाया गया है . इस तरह, हम फेफड़ों और दिल की चोटों के जोखिम को सीमित करते हैं और अत्यधिक ऊतक क्षति या छिद्र से बचें।
मायोकार्डियल इस्कीमिया-रिफ्यूजन (आई/आर) एक संबंधित सर्जिकल मॉडल है जो क्लीनिक में एमआई रोगियों के लिए किया जाता है कि कोरोनरी रक्त प्रवाह की बहाली की नकल करता है। आई/आर मॉडल के दौरान कोरोनरी धमनी का क्षणिक आकल 20 से 45 मिनट8,13की अवधि के लिए एलएडी पर ट्यूबिंग का एक टुकड़ा कसकर किया जाता है . फिर occlusion वांछित अवधि के लिए मायोकार्डियम के रिपरफ्यूजन की अनुमति देने के लिए जारी की है। हमारे प्रोटोकॉल पर लागू किया गया यह सरल संशोधन आसानी से इसे आई/आर मॉडल4,8,14,15में बदल सकता है . इस इन्फेक्शन की पुष्टि कार्डियक ट्रोपोनिन टी8,10 या इकोकार्डियोग्राफी15के रक्त परीक्षण से की जा सकती है .
एमआई मैं /आर मॉडल से अलग है क्योंकि अपने आप में रिफ्यूजन एक चोट लाती है। एमआई अधिक ऊतक परिगलन लाती है और apoptosis reperfused मायोकार्डियम5में अधिक स्पष्ट है. एमआई 7 में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की देरी से मायोकार्डियल घुसपैठ के साथ भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ का काइनेटिक्स भी एमआई और आईआर के बीच अलगहै। अफ़गदार क्षेत्र का आकार और स्थिति स्थायी लिगेशन और आई/आर मॉडल15के बीच भी भिन्न होगी। इसे ध्यान में रखते हुए, एक प्रासंगिक मॉडल का चयन करने के लिए सतर्क होना चाहिए क्योंकि मैं/आर और स्थायी एमआई मॉडल बराबर नहीं हैं। मायोकार्डियल इन्फेक्शन का एक और murine मॉडल cryoinfarction मॉडल है. एलवी पूर्वकाल की दीवार पर क्रायोजेनिक जांच के आवेदन से वेंट्रिकुलर ऊतक की ठंड और एलएडी धमनी में रक्त प्रवाह गिरफ्तारी पैदा होती है। हालांकि यह तकनीक एम आई और आई/आर तकनीकों से अलग है जो पुन: मॉडलिंग और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के समय और आयाम के संबंधमें 16,17.
भिन्नता किसी भी शल्य प्रक्रिया के लिए के रूप में एक सीमा है. यह परिवर्तनशीलता जैविक अंतरों पर निर्भर करती है। इसका एक अच्छा उदाहरण चूहों में कोरोनरी धमनी व्यवस्था में भिन्नताहै. यह भी प्रयोगकर्ता कौशल पर निर्भर करता है. यह उल्लेखनीय है कि इस मॉडल के साथ स्थिर परिणामों तक पहुंचने के लिए प्रयोगकर्ताओं का पर्याप्त प्रशिक्षण अनिवार्य है। एक सुप्रशिक्षित प्रयोगकर्ता आसानी से ऐसे अगम्य आकार ों का उत्पादन कर सकता है जो पुनरुत्पाद्य हैं (चित्र 3क-बी)। मॉडल की मृत्यु दर लाड की स्थिति, प्रयोगों की अवधि (दिन, सप्ताह), माउस तनाव और जीनोटाइप पर निर्भर करती है। संवेदनाहारी और एनाल्जेसिक दवाओं के प्रकार भी putative cardioprotective या cardidepressant प्रभाव के साथ प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. हमारे हाथों में, इस मॉडल की वैश्विक मृत्यु दर 25-30% है। इस मृत्यु दर में प्रयोग की समाप्ति से पहले सहज मृत्यु और बलिदान शामिल होते हैं, चाहे वे तनाव और प्रयोग की अवधि हो। अधिकांश मौतें या बलिदान सर्जरी के बाद दूसरे और चौथे दिनों के बीच हैं। एक सख्त दर्द प्रबंधन लागू करने और जानवरों का पालन मृत्यु दर को कम कर सकते हैं.
यहाँ हम infarct आकार के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत टीटीसी धुंधला और प्रोटीन और जीन की अभिव्यक्ति का उपयोग कर विश्लेषण LV में पश्चिमी धब्बा और वास्तविक समय पीसीआर द्वारा क्रमशः (चित्र 3C-G)। यह भी एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) या एंजाइमी परख द्वारा इन मापदंडों के कई उपाय करने के लिए संभव है। बेशक, परिकल्पना है कि परीक्षण किया जा करने की जरूरत के अनुसार, इस विधि अल्ट्रासाउंड द्वारा किसी भी कार्यात्मक विश्लेषण द्वारा पीछा किया जा सकता, एमआरआई या दबाव और मात्रा के intraventricular कैथेटर माप. यह भी दिल निकालने के लिए संभव है और आगे अलग कोशिकाओं पर हृदय कोशिका जीव विज्ञान की जांच. कुल मिलाकर, डीएडी कोरोनरी धमनी के स्थायी लिगेशन के साथ एमआई मॉडल विशेष रूप से सूजन और फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है, घाव भरने और मायोकार्डियल इंफार्क्शन के बाद हृदय समारोह में परिवर्तन।
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस मॉडल को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान 310030$162629 से एलएल) के समर्थन और थोरैसिक सर्जरी और लौसने विश्वविद्यालय अस्पताल की गहन देखभाल चिकित्सा की सेवाओं से विभागीय निधियों के साथ विकसित किया गया था। JL एम्मा Muschamp फाउंडेशन से एक अनुदान के प्राप्तकर्ता है. हम जीव विज्ञान और लौसने विश्वविद्यालय के चिकित्सा के संकाय के पशु चिकित्सकों और पशु सुविधा कर्मचारियों के महत्वपूर्ण समर्थन स्वीकार करते हैं. हम उनके तकनीकी संकेत के लिए लौसने विश्वविद्यालय अस्पताल के हृदय आकलन सुविधा से लौसने विश्वविद्यालय अस्पताल के कार्डिएक सर्जरी की सेवा से डॉ जूज़ेपिना मिलानो और डॉ Alexandre Sarre धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
| 30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
| 70% Ethanol | |||
| Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
| Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
| Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
| Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
| Electrical Razor | Remington | HC720 | |
| Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
| Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
| Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
| Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
| Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt | Aesculap | FM013R | |
| NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
| Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
| Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
| Silk Suture 7-0,BV-1 | Ethicon | K804 | |
| Student Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Student Fine Forceps-Angled | Fine Science Tools | 91110-10 | |
| Surgical Gloves | Weitacare | 834301 | |
| Surgical heating pad | Personalized setting | ||
| Temgesic sol 0.3 mg/ml Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | N02AE01 | |
| Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
| Universal S3 Microscope, OMPIMD | Zeizz | ||
| Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Viscotears | Alcon | 1551535 | |
| Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |
References
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