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फल मक्खी को संभालने के लिए सरल घर का बना उपकरण ]Drosophila मेलेनोगैस्टर

Published: July 24, 2019 doi: 10.3791/59613
Automatic Translation
1
1Department of Zoology and Animal Physiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University

Summary

यहाँ वर्णित कई घर का बना उपकरण का उपयोग करने के लिए हस्तांतरण, ठंडा, और वयस्क Drosophilaको मारने के लिए, साथ ही कांच संस्कृति शीशियों को साफ करने और अंडे इकट्ठा करने के लिए. इन उपकरणों को बनाने के लिए आसान कर रहे हैं और बल्कि Drosophila से निपटने में कुशल हैं.

Abstract

फल मक्खी, Drosophila मेलेनोगैस्टर,व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान और जीव विज्ञान दोनों शिक्षा में प्रयोग किया जाता है। वयस्क मक्खियों हैंडलिंग आम है, लेकिन व्यवहार में मुश्किल है, वयस्क मक्खियों के रूप में उड़. यहाँ प्रदर्शन किया है कि कैसे Drosophilaसे निपटने में मुश्किल मुद्दों को संबोधित करने के लिए कुछ सरल और लागत प्रभावी उपकरण बनाने के लिए . फोम stoppers में छेद बना रहे हैं और pippette युक्तियाँ या कीप छेद में डाला जाता है. मक्खी तो पिपेट टिप में केवल एक ही दिशा में ले जाते हैं / मौजूदा प्रोटोकॉल कुचल बर्फ में ठंडा और उन्हें एक ठंड, हार्ड आइसपैक सतह पर स्थानांतरित करके शांत-एनेस्थेटाइज़िंग मक्खियों के लिए संशोधित किया गया है। आइसपैक चिकित्सा धुंध का एक टुकड़ा है कि एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत जांच की जब संघनित पानी से स्थिर मक्खियों रहता है के साथ कवर किया जाता है। मक्खियों अंत में गिनती और छँटाई या microwaving द्वारा खारिज के लिए ethanized हैं. एक बोतल के आकार का पिंजरे भी अंडे इकट्ठा करने के लिए विकसित किया गया है, साथ ही साथ एक श्रम की बचत डिवाइस और कांच संस्कृति शीशियों की सफाई के लिए प्रोटोकॉल के साथ.

Introduction

फल मक्खी, Drosophila मेलेनोगैस्टर, व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान और जीव विज्ञान शिक्षा में इस्तेमाल किया विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीवहै 1,2. Drosophila से निपटने की बुनियादी समस्याओं शीशी से शीशी और मक्खियों की अचलीकरण के लिए वयस्कों के हस्तांतरण कर रहे हैं ताकि वे संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, के रूप में सभी वयस्कों (कुछ म्यूटेंट के लिए छोड़कर3,4) उड़ सकता है.

परंपरागत रूप से, एक शोधकर्ता दो शीशियों मुंह से मुंह पकड़ कर एक शीशी से दूसरे करने के लिए मक्खियों स्थानान्तरण, नीचे मक्खियों दोहन या मक्खियों एक और शीशी में उड़ान भरने के लिए अनुमति देता है, तो अलग और दोनों शीशियों replugging4. जाहिर है, यह आवश्यक है कि एक ही व्यास के साथ दो शीशियों के उद्घाटन, और यह स्थानांतरित मक्खियों की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. इस बीच, यह काम करने के लिए जल्दी हाथ की आवश्यकता है, और आवारा मक्खियों से बचने प्रयोगशाला या कक्षा के लिए समस्याओं में परिणाम कर सकते हैं. एक पहले से ही तैयार पार करने के लिए अतिरिक्त कुंवारी मक्खियों या पुरुष मक्खियों जोड़ना Drosophila प्रयोगों में एक और नियमित कार्य है. परंपरागत रूप से, मक्खियों अतिरिक्त मक्खियों के अलावा से पहले पार शीशी में स्थिर किया जाना चाहिए।

वयस्क Drosophila नियमित रूप से ईथर , सीओ2, या द्रुतशीतन5द्वारा anaesthetized कर रहे हैं . ईथर और सीओ2 जोखिम की तुलना में, द्रुतशीतन वयस्क Drosophila और दोनों मक्खियों और शोधकर्ताओं (विशेषरूप से युवा छात्रों) 6,7के लिए कम से कम हानिकारक स्थिर करने के लिए सबसे अधिक लागत कुशल एजेंट है. हालांकि, पानी जो ठंडी सतह या चैम्बर पर लगातार गाढ़ा होता है, मक्खियों को गीला कर देता है। गीली मक्खियों के फीनोटाइप का निर्धारण करना कठिन है और हेरफेर8,9के दौरान वे आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। यह अधिक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं बनने से द्रुतशीतन विधि रखा गया है.

फ्लाई ट्रांसफरल के उपकरण और फ्लाई कूलिंग के लिए एक विधि पहले10वर्णित किया गया है। यहाँ, एक संशोधित द्रुतशीतन संज्ञाहरण तकनीक है कि सुरक्षित है, विश्वसनीय, और Drosophila प्रयोगों के लिए संभव है बताया गया है. इसके अलावा इस पत्र में वर्णित 1) गिनती के लिए वयस्कों की हत्या के लिए तरीके हैं, छँटाई, या discarding, 2) श्रम की बचत उपकरणों और कांच संस्कृति शीशियों की सफाई के लिए प्रोटोकॉल, और 3) अंडे इकट्ठा करने के लिए एक साधारण पिंजरे. आसानी से डिजाइन और लागत प्रभावी उपकरण यहाँ वर्णित मक्खी से निपटने के कठिन मुद्दों को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन तरीकों का परीक्षण किया गया है और मजबूत, विश्वसनीय, और अनुभवी और नौसिखिया शोधकर्ताओं के लिए आसान करने के लिए संभाल साबित हो रहे हैं.

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Protocol

1. उपकरण और सहायक उपकरण की तैयारी

  1. टिप/पनल स्टॉपर
    1. दो स्पंज प्लग प्राप्त करें (प्लग का व्यास मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल शीशियों के आंतरिक व्यास से थोड़ा बड़ा होना चाहिए)। एक गर्म बिजली टांका लोहे के साथ स्पंज प्लग के केन्द्रों में एक छेद बनाओ।
    2. दो 1 एमएल पाइपेट टिप्स प्राप्त करें, एक तेज चाकू के साथ आधे अनुप्रस्थ में एक कटौती करें, और नुकीले अंत को त्याग ें। फिर, दूसरे पिपेट टिप से नुकीले अंत के 1.5 सेमी काट। एक लम्बी पिपेट टिप बनाने के लिए एक सभी उद्देश्य चिपकने वाला के साथ एक साथ दो पिपेट युक्तियों के अवशेष गोंद (चित्र 1A)।
    3. एक कीप और लम्बी पिपेट टिप को स्पंज प्लग में डालें ताकि एक टिप और कीप डाट (इसके बाद टी- और एफ-स्टॉपर के रूप में संदर्भित किया जा सके) और पिपेट टिप को 100 डिग्री सेल्सियस माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चित्र 1क) के साथ कैप करें।
      नोट: फ़नल स्टेम की लंबाई प्लग की ऊंचाई से अधिक होनी चाहिए. यदि यह प्लग की ऊंचाई से छोटा या बराबर है, तो मक्खियां स्टेम ओपनिंग से बच जाएंगी। कीप स्टेम के अंत संस्कृति माध्यम या एक खाली शीशी के नीचे की सतह से ऊपर कम से कम 2 सेमी स्थित होना चाहिए. छोटे कीप (उदा., डिस्क व्यास और 60 मिमी) छोटे आंतरिक स्टेम खोलने व्यास के साथ (और lt;5 मिमी) बेहतर कर रहे हैं। या तो एक गिलास या एक प्लास्टिक कीप एक एफ डाट बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, प्लास्टिक कीप जीव विज्ञान वर्गों के लिए बेहतर कर रहे हैं, के रूप में वे कांच कीप की तुलना में कम आसानी से तोड़.
  2. माइक्रोडिसेक्टिंग सुई
    1. यांत्रिक पेंसिल प्राप्त करें जो हाथ और कीट पिन में सहज महसूस करते हैं जो उनके लीड रिफिल के व्यास (जैसे, 0.5 मिमी, 0.7 मिमी) से मेल खाते हैं।
    2. प्लास की एक जोड़ी के साथ कीट पिन के व्यापक सिरों को काटें और कट फ्लैट फाइल करें। लीड को पिनों से बदलें (चित्र 1B) . क्लिक बटन दबाएँ और एक विच्छेदन का संचालन करने के लिए एक पिन के 0.5-1 सेमी बाहर फ़ीड. पिन को साफ करें और किसी भी व्यक्ति को संभालने के लिए इसे सुरक्षित बनाने के लिए विच्छेदन गतिविधि के बाद इसे पूरी तरह से पेंसिल शाफ्ट में वापस धक्का दें।
      नोट: माइक्रोडिसेक्टिंग सुईन न केवल लार्वा लार ग्रंथियों जैसे अंगों के विच्छेदन में बल्कि मृत वयस्क मक्खियों की गिनती और छँटाई में भी उपयोगी होती हैं।
  3. हार्ड आइसपैक
    1. कई refreezable हार्ड आइसपैक प्राप्त करें (बड़े आकार के आइसपैक बेहतर कर रहे हैं)। चित्र 1C एक आइसपैक दिखाता है जो अच्छी तरह से काम करता है, जो 26.5 सेमी x 14.5 सेमी x 2.5 सेमी को मापता है और इसमें ऊपर और नीचे के पक्ष हैं जो पूरी तरह से सपाट हैं।
    2. चिकित्सा धुंध (नॉनस्टराइल) को टुकड़ों में काटें जो उनके कवर किए गए आइसपैक की ठंड सतहों से थोड़ा छोटे होते हैं। उदाहरण के लिए, 26.5 बउ x 14.5 बउ से थोड़ा छोटा चिकित्सा जाली का एक टुकड़ा चित्र 1Cमें दर्शाए गए आइसपैक को कवर करने के लिए बेहतर होता है।
      नोट: इन द्रुतशीतन उपकरणों के लिए आवश्यक सामान में शामिल हैं: एक बर्फ बॉक्स (हम एक व्यक्ति के लिए एक 25 सेमी x 15 सेमी x 15 सेमी फोम बॉक्स और एक से अधिक व्यक्ति के लिए 37 सेमी x 28 सेमी x 20 सेमी बॉक्स का उपयोग किया जाता है), जो कुचल बर्फ स्टोर करने के लिए प्रयोग किया जाता है; ठीक बिंदु चिमटी की एक जोड़ी है, जो अपने पंखों से ठंडा मक्खियों हड़पने के लिए और उन्हें एक शीशी के लिए हस्तांतरण करने के लिए उपयोग किया जाता है; सुरक्षात्मक काम दस्ताने, जो एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर ठंडा icepacks लेने के लिए उपयोग किया जाता है की एक जोड़ी; और प्लास्टिक की फिल्म, जिसका उपयोग स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के चरण को कवर करने के लिए किया जाता है।
  4. Drosophila अंडा संग्रह पिंजरे
    नोट: रेडीमेड Drosophila अंडा संग्रह पिंजरों कई जैव प्रौद्योगिकी कंपनियों से उपलब्ध हैं11. यहाँ वर्णित 60 मिमी पेट्री व्यंजनों के लिए एक छोटे से एक्रिलिक बोतल के आकार का अंडा संग्रह पिंजरे है (चित्र1D छोड़ दिया; पिंजरे डिजाइन बीच में दिखाया गया है). यह अन्य पेट्री डिश आकार (उदाहरण के लिए, 100 मिमी, 35 मिमी) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह आसानी से पिंजरे में या बाहर मक्खियों के हस्तांतरण की अनुमति देता है। एक साधारण पिंजरे के रूप में इस प्रकार तैयार किया जा सकता है.
    1. एक लगभग 2:1 (अंकित अंत: कुंद अंत) अनुपात में एक नरम प्लास्टिक पीने की बोतल (500 एमएल, आंतरिक व्यास ca. 65 मिमी) में कटौती और कुंद अंत को छोड़ने के लिए एक तस्वीर कटर का प्रयोग करें।
    2. चिपकने वाला टेप के साथ एक सेब का रस प्लेट (आंतरिक व्यास 60 मिमी) के चारों ओर कार्ड पेपर की एक पट्टी लपेटें [एप्पल रस प्लेट अंडे इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्र 1E,सही)]।
  5. कॉर्डलेस ट्यूब ब्रश ड्राइवर
    1. एक ताररहित ड्रिल ड्राइवर प्राप्त करें (अधिकतम गति $ 500 rpm)।
    2. एक ट्यूब ब्रश है कि इसके पक्षों के साथ ही इसके सामने bristles है प्राप्त करें. आदर्श रूप में, ब्रश का व्यास संस्कृति शीशियों कि साफ करने की आवश्यकता के व्यास से थोड़ा बड़ा होना चाहिए. इसके हैंडल के अंत को काटें ताकि इसे ड्रिल चक में डाला जा सके (चित्र 1D) ।
      नोट: इन सफाई उपकरणों के लिए आवश्यक सामान स्टेनलेस स्टील स्पंज और लंबे कफ रबर दस्ताने शामिल हैं.

2. Vial A से Vial B में वयस्क मक्खी स्थानांतरित करना

नोट: वयस्क मक्खियों को एक शीशी से दूसरे में स्थानांतरित करना Drosophila प्रयोगों में आयोजित सबसे आम अभ्यास है [उदाहरण के लिए, पुरानी संस्कृति से मक्खियों को स्थानांतरित करना (A) ताजा संस्कृति (बी) या एक क्रॉस शीशी (ए) से खाली शीशी (बी) के लिए एनेस्थेइज़िंग के लिए। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित किसी भी वयस्क मक्खी स्थानांतरित गतिविधियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब तक अन्यथा नहीं कहा गया है, इस प्रोटोकॉल इस कागज भर में शीशी एक से शीशी बी के लिए मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. एक एफ-स्टॉपर के कीप और टी-स्टॉपर के पिपेट टिप के स्टेम को सावधानी से चेक करें, फिर रबर एयर ब्लोअर के साथ स्टॉपर में रहने वाली किसी भी मक्खियों को साफ करें। यह कदम सर्वोपरि महत्व का है, खासकर जब टी और एफ-स्टॉपर का एक सेट विभिन्न Drosophila लाइनों के निरंतर स्थानांतरण के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. शीशी ए में मक्खियों नीचे ठोकर और एक टी-स्टॉपर के साथ अपने प्लग की जगह है, तो एक एफ-स्टॉपर के साथ शीशी बी प्लग।
  3. शीशी एक से अधिक शीशी बी, एफ-स्टॉपर के कीप खोलने में टी-स्टॉपर के पिपेट टिप अंत डालें, उल्टे शीशी ए के किनारे दस्तक करने के लिए मक्खियों को पिपेट टिप से बाहर और कीप के स्टेम के माध्यम से पर्ची करने की अनुमति दें, और शीशी बी में छोड़ दें। यदि शीशी में किसी भी पुराने भोजन एक कम कॉम्पैक्ट हो जाता है, यह छोड़ सकता है जब शीशी एक उलटा है और खटखटाया. ऐसी स्थिति में, शीशी ए पर विठ्ठल शीशी बी और मक्खियों को शीशी बी में क्रॉल करने की अनुमति दें।
  4. टी-स्टॉपर को F-स्टॉपर से अलग करें। एक 200 डिग्री एल microcentrifuge ट्यूब के साथ टी-स्टॉपर के पिपेट टिप अंत कैप अगर शीशी में शेष मक्खियों एक क्षण भर के लिए अन्य शीशियों को स्थानांतरित करने की आवश्यकता है; अन्यथा, T-stopper निकालें और शीशी A. F-स्टॉपर निकालें और शीशी B replugें.

3. चिलिंग द्वारा मक्खी को स्थिर करना

  1. उपयोग करने से पहले कम से कम 24 एच के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में हार्ड refreezable आइसपैक रखें।
  2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर एक ठंडा, कठिन आइसपैक रखें। थोड़ा कुछ पानी के साथ गैर-एसेप्टिक चिकित्सा धुंध का एक टुकड़ा गीला और इसे बारीकी से आइसपैक की सतह से चिपके रहने की अनुमति दें। चिकित्सा धुंध अगले मक्खी द्रुतशीतन में पुन: उपयोग किया जा सकता है। एक ही समय में, कुचल बर्फ में एक खाली शीशी ठंडा.
  3. वयस्क मक्खियों कि ठंडा खाली शीशी (CEV) में immobilized होने की जरूरत स्थानांतरण. जब दो हस्तांतरण शीशियों अलग कर रहे हैं, एक पेट्री डिश या एक प्लग के साथ CEV कवर और कुचल बर्फ के खिलाफ CEV दस्तक नीचे CEV में सभी मक्खियों नल के लिए. इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएँ जब तक कि सभी मक्खियों immobilized हैं. मक्खियों 30 s के भीतर स्थिर हो जाएगा. अगले, 1 मिनट के लिए बर्फ में CEV जगह है. एनेस्थेटाइज़िंग के लिए एक समय में बहुत अधिक मक्खियों को स्थानांतरित करना उचित नहीं है।
  4. ठंडा मक्खियों को मेडिकल धुंध पर डालें जो आइस पैक को कवर करता है। एक तूलिका के साथ ओवरलैपिंग मक्खियों को फैलाएं और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक मक्खी को आइसपैक की ठंडी सतह से ठंडा किया जा सकता है। यदि एक ठंडा मुश्किल आइसपैक थोड़ा फूलता है, तो इसे एक तौलिया पर रखें और अपने फ्लैट साइड पर काम करें।
  5. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से मंच क्लिप निकालें, प्लास्टिक की फिल्म के एक टुकड़े के साथ मंच को कवर, और मंच पर आइसपैक डाल दिया। शीर्ष प्रकाश पर बारी (एक ठंडा प्रकाश स्रोत वांछनीय है), स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित करने और ठंडा मक्खियों स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है जब तक आइसपैक ले जाएँ।

4. गिनती, छंटनी, या त्याग के लिए वयस्क मक्खी की हत्या

  1. वयस्क एक खाली शीशी में मक्खियों स्थानांतरण और यह एक पेट्री डिश के साथ कवर.
  2. शीशी उलटें, यह एक माइक्रोवेव ओवन में 1 मिनट + 20 s के लिए गर्मी, और मृत मक्खियों पेट्री डिश में ड्रॉप की अनुमति देते हैं.
  3. सुरक्षात्मक काम दस्ताने पर रखो और माइक्रोवेव से बाहर शीशी ले. एक सफेद कागज कार्ड पर मृत मक्खियों डालो, गिनती या एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक microdissecting सुई के साथ मक्खियों की जांच, और एक कचरे में मक्खी निकायों के निपटान अवलोकन के बाद कर सकते हैं.
  4. अवांछित मक्खियों को मारने के लिए, एक माइक्रोवेव ओवन में 2-3 मिनट के लिए मक्खियों गर्मी, तो एक कचरे के डिब्बे में शवनल नल.
    नोट: परीक्षा के लिए कुछ विंग उत्परिवर्ती उपभेदों (जैसे, विंग लेंथ म्यूटेंट) को मारना उचित नहीं है, क्योंकि यदि पंख पेट की नोक से परे बढ़ते हैं, तो शवों से न्याय करना मुश्किल है, जो जंगली प्रकार की मक्खियों में देखा जाता है।

5. बोतल के आकार का अंडा संग्रह पिंजरे में /

नोट: जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, टी और एफ-स्टॉपर का उपयोग अंडे संग्रह पिंजरे में और बाहर मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। इस प्रक्रिया के दौरान मक्खी को एनेस्थेटाइज़ किए जाने की आवश्यकता नहीं है। अन्य विवरण, जैसे सेब का रस मध्यम, अंडा संग्रह, और dechorionization तैयार करने के रूप में, साहित्य12में पाया जा सकता है.

  1. सेब का रस प्लेट में अंडे संग्रह पिंजरे डालें या एक शीतल पेय की बोतल से बने पिंजरे में सेब का रस प्लेट माउंट करें। पैराफिन फिल्म की एक पट्टी के साथ दो घटकों के आसपास संयुक्त सील.
  2. पिंजरे में संभव के रूप में कई मक्खियों प्लेस और मक्खियों को स्थानांतरित करने के बाद एक फोम डाट के साथ पिंजरे replug.
  3. पिंजरे में मक्खियों के लिए भोजन बदलने के लिए, एक खाली शीशी के लिए पिंजरे में मक्खियों हस्तांतरण।
  4. सेब का रस प्लेट बदलें और इसे रीसील करें, फिर शीशी से मक्खियों को पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें।
  5. जब अंडा संग्रह समाप्त होता है, एक खाली शीशी में मक्खियों हस्तांतरण और उन्हें संस्कृति शीशियों में स्थानांतरित।

6. सफाई ग्लास संस्कृति Vials

नोट: आम तौर पर, एक पुरानी संस्कृति शीशी जीवित मक्खियों शामिल हैं. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, इन मक्खियों को सफाई से पहले मारे जाने की जरूरत नहीं है जब तक कि वे ट्रांसजेनिक मक्खियों हैं।

  1. गीला, स्टेनलेस स्टील स्पंज के साथ कांच संस्कृति शीशियों से किसी भी स्थायी मार्कर स्याही निकालें.
  2. संस्कृति की शीशियों को बहते पानी में भिगो दें।
    1. पानी के साथ एक प्रयोगशाला सिंक भरें, पानी में तरल dishwashing साबुन जोड़ने के लिए, और मिश्रण.
    2. पानी में संस्कृति शीशियों विसर्जित कर दिया, तो प्लग को हटाने, पानी शीशी में चलाने के लिए अनुमति देता है. पानी में डिश डिटर्जेंट किसी भी शेष वयस्क मक्खियों को नीचे सिंक और पानी में डूब कर देगा।
    3. पुरानी संस्कृति शीशियों को कम से कम 30 मिनट के लिए पानी में भिगो दें।
  3. ड्रिल के चक ढीला, परीक्षण ट्यूब ब्रश डालने और चक retighten. रोटेशन चयनकर्ता की दिशा की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि ड्रिल दक्षिणावर्त घूमता है। गति ट्रिगर समायोजित करें और सुनिश्चित करें कि अधिकतम गति 500 आरपीएम से कम है।
  4. संस्कृति शीशियों को साफ करें।
    1. संस्कृति शीशियों को मोटे तौर पर साफ करें।
      1. गैर प्रमुख हाथ पर एक लंबे कफ रबर दस्ताने रखो और पानी में शीशी पकड़.
      2. नंगे प्रमुख हाथ के साथ ताररहित ट्यूब ब्रश ड्राइवर पकड़ो, संस्कृति शीशी में ब्रश निचोड़, और ट्रिगर निचोड़.
        नोट: बैटरी को पानी में न डुबोएं। घूर्णन ब्रश पुराने भोजन, प्यूपा, आदि को तोड़ने, और कचरे के 95% से अधिक हटा देंगे।
      3. कचरे को एक अलग कचरे में फेंक सकते हैं। इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक प्रत्येक शीशी में कचरे के अधिकांश साफ किया गया है.
    2. संस्कृति शीशियों को अच्छी तरह से साफ करें।
      1. ट्यूब ब्रश को साफ करें, सिंक को छान लें और साफ करें, और इसे साफ पानी से फिर से भरें।
      2. खंड 6.4.1 में वर्णित के रूप में प्रत्येक संस्कृति शीशी से शेष अपशिष्ट निकालें।

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Representative Results

टी और एफ-स्टॉपर सरल उपकरण है कि अनुकूलित किया जा सकता है और किसी भी मक्खी हस्तांतरण गतिविधियों में इस्तेमाल का एक सेट के रूप में विकसित किए गए थे। कई ताजा संस्कृतियों में एक पुरानी संस्कृति से मक्खियों स्थानांतरण ताजा शीशियों के प्लग को हटाने, उन्हें एफ-स्टॉपर के साथ की जगह शामिल है, तो पुराने शीशी में मक्खियों नीचे दोहन, जल्दी से अपने प्लग को हटाने, और यह एक टी-स्टॉपर के साथ की जगह। यदि पुराना भोजन कॉम्पैक्ट है, तो पुरानी शीशी को फ्लिप करना और एफ-स्टॉपर के उद्घाटन में टी-स्टॉपर की नोक डालना महत्वपूर्ण है, फिर मक्खियों को ताजा शीशी में टैप करें। फिर, टी और एफ-स्टॉपर को बदलकर शीशियों को रीप्लग करना किया जाता है। यदि पुराना भोजन कम कॉम्पैक्ट हो जाता है, तो ताजा शीशी को फ्लिप करने की सलाह दी जाती है, एफ-स्टॉपर को टी-स्टॉपर पर माउंट करें, और मक्खियों को ताजा शीशी में क्रॉल करने की अनुमति दें।

एक पहले से ही तैयार पार करने के लिए अतिरिक्त मक्खियों को जोड़ने के लिए, यह नीचे पार शीशी में मक्खियों नल और एक एफ डाट के साथ अपने प्लग की जगह महत्वपूर्ण है। फिर, प्रयोगकर्ता एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ठंडा मक्खियों की जांच करनी चाहिए, नुकीले चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर अपने पंख से एक वांछित मक्खी लेने के लिए, और यह कीप के स्टेम के माध्यम से पार शीशी में पर्ची करने के लिए अनुमति देते हैं। यदि एक मक्खी कीप के तने में फंस जाती है, तो यह सलाह दी जाती है कि वह उस पर एक एयर ब्लोअर के साथ धीरे से उड़ा दे और इसे शीशी में फिसल जाने दें। F-स्टॉपर की जगह और शीशी replugging जब एक क्रॉस के लिए पर्याप्त मक्खियों एकत्र किया गया है तो आवश्यक है। टी और एफ-स्टॉपर 201013,14में शुरू किए गए थे; इस प्रकार अब तक, 1,200 से अधिक छात्रों को इन मक्खी स्थानांतरित उपकरणों से लाभान्वित किया है. टी और एफ-स्टॉपर भी एक प्रयोगशाला गाइड15,जो शिक्षण और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए अपनाया गया है के माध्यम से प्रशिक्षकों और शोधकर्ताओं के लिए पेश किया गया है।

मौजूदा ठंड एनेस्थेटाइज़िंग विधियों को इस अध्ययन में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है। कुचल बर्फ या बर्फ के पानी के मिश्रण वयस्क मक्खियों ठंडा करने के लिए उपयोग किया जाता है तो nonsterile चिकित्सा धुंध के एक टुकड़े के साथ कवर एक आइसपैक की ठंड सतह पर स्थिर मक्खियों हस्तांतरण। जाली फाइबर गाढ़ा पानी को सोखते हैं और जांच के बाद मक्खियों को सूखा रखते हैं। उसी समय, ताना/बाने के धागे के बीच छोटे छेद मक्खियों को आइसपैक की ठंडी सतह को छूने और उन्हें स्थिर रखने की अनुमति देते हैं (चित्र2)। 25 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान पर, एक ठंडा, हार्ड आइसपैक की सतह का तापमान 20 मिनट के भीतर -19 डिग्री सेल्सियस से-2 डिग्री सेल्सियस तक नाटकीय रूप से बढ़ जाता है और एक पठार तक पहुंचता है जो पुराने और नए अंडे वाली मक्खियों दोनों के लिए सुरक्षित है (चित्र 3)। एक आइसपैक पठार के भीतर काफी अच्छी तरह से काम करता है, और ठंडी मक्खियों 30 s के भीतर कमरे के तापमान पर चेतना हासिल. क्योंकि एक कठिन आइसपैक पतली है, यह तो मक्खियों की जांच करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत रखा जा सकता है। यहाँ वर्णित कठिन आइसपैक की लागत $2 से भी कम है; इसके अलावा, 100-150 छात्रों के एक वर्ग के लिए 60 कठिन icepacks प्रत्येक सेमेस्टर इस्तेमाल किया गया है, और वे कई वर्षों के लिए पुन: प्रयोज्य हैं. द्रुतशीतन संज्ञाहरण तकनीक के इस संशोधित संस्करण तीन साल पहले एक विशिष्ट आनुवंशिकी वर्ग के लिए पेश किया गया था, और इसकी मजबूती 300 से अधिक छात्रों और अन्य विश्वविद्यालयों में उन लोगों द्वारा परीक्षण किया गया है.

यह पाया गया है कि माइक्रोवेव परावैद्युत हीटिंग वयस्क मक्खियों को मारने के लिए एक तेज, अधिक सुविधाजनक एजेंट है (यदि वे अब अवलोकन के बाद की जरूरत नहीं है) ऐसे overetherizing या गहरी ठंड के रूप में एजेंटों की तुलना में (तालिका1). माइक्रोवेव परावैद्युत हीटिंग overetherizing या गहरी ठंड से मक्खियों को मारने के लिए एक बहुत कम समय की आवश्यकता है. सभी मक्खियों 80 s के भीतर मर जाते हैं, तो गिनती और एक छोटी समय सीमा के भीतर मक्खियों का एक बड़ा बैच छँटाई संभव है16. यह मानते हुए कि प्रयोगकर्ता को एक प्रयोग के लिए बैचों की गणना और सॉर्ट करने के लिए मक्खियों को 20x को मारने की आवश्यकता है, क्रमशः मक्खियों को ओवरथराइजिंग और गहरी ठंड से मारने के लिए 3 h + 20 मिनट और 5 एच लगेंगे; हालांकि, केवल 27 मिनट एक माइक्रोवेव का उपयोग कर की जरूरत है.

अतिअदित मक्खियों की तरह, माइक्रोवेव मक्खियों शरीर से सही कोण पर पंख का विस्तार. आम तौर पर, microwaving द्वारा मारे गए मक्खी शव ों की तुलना में काफी हल्का थे ईथर या द्रुतशीतन द्वारा मारे गए लोगों की तुलना में, लेकिन गर्मी शरीर के आकार विकृत नहीं करता है, और शव कुरकुरा या turgid नहीं बन जाते हैं. माइक्रोवेव मक्खियों के लक्षण (उदा., शरीर का रंग, आंखों का रंग, और पंख आकार) ईथर या ठंड से मारे गए लोगों के समान हैं (चित्र 4), और तीन एजेंटों द्वारा मारे गए मक्खियों के पंख आकार (क्षेत्र, लंबाई, चौड़ाई) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है () तालिका 1) इसलिए, microwaving द्वारा मारे गए मक्खियों के शव गिनती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, छँटाई, और कुछ लक्षण को मापने, जैसे पंख आकार के रूप में. माइक्रोवेव हीटिंग भी अवांछित मक्खियों को मारने और एक समय पर तरीके से उनमें से निपटान करने के लिए एक अच्छा तरीका है। इसके अतिरिक्त, मक्खी morgues (ज्वलनशील इथेनॉल, मेथनॉल, या साबुन समाधान युक्त बोतलें), जो मृत या खारिज मक्खियों को स्टोर करने के लिए उपयोग किया जाता है, अब मक्खी प्रयोगशालाओं या जीव विज्ञान कक्षाओं3में की जरूरत है.

एक छोटे से, बोतल के आकार का अंडा संग्रह पिंजरे इस प्रोटोकॉल के लिए डिजाइन किया गया था. टी- और एफ-स्टॉपर का उपयोग करके, बड़ी संख्या में मक्खियों को पिंजरे में या बाहर स्थानांतरित किया जा सकता है, और सेब का रस मध्यम प्लेटें अधिक आसानी से बदला जा सकता है। अंत में, मक्खियों से पहले और अंडे संग्रह के बाद एनेस्थेटाइज़िंग की जरूरत नहीं है।

संस्कृति शीशियों को साफ करने के लिए इस उपकरण के उपयोग के लिए एक ताररहित ट्यूब ब्रश ड्राइवर और प्रोटोकॉल भी प्रोटोकॉल के लिए विकसित किया गया था। इस बैटरी संचालित ट्यूब ब्रश आसानी से पुराने भोजन और एक गिलास संस्कृति शीशी से जुड़ी प्यूपा नीचे तोड़ सकते हैं, एक शीशी 30 s के भीतर साफ किया जा सकता है, और सफाई की दक्षता बहुत बढ़ जाती है; इसलिए, कांच संस्कृति शीशियों की बड़ी मात्रा में सफाई अब एक कठिन काम है.

Figure 1
चित्र 1: Drosophila से निपटने में इस्तेमाल उपकरण. (ए) दिखाया मक्खी हस्तांतरण उपकरण और आवश्यक सामान हैं. वे कर रहे हैं (बाएं से दाएं) एक हवा ब्लोअर (कीप स्टेम में शेष वयस्क मक्खियों को उड़ाने के लिए इस्तेमाल किया); टी और एफ-स्टॉपर (विशिषों में शामिल); और एक खाली शीशी एक पेट्री डिश (36 मिमी, एक 40 मिमी पेट्री डिश के नीचे आधा) के साथ कवर किया. फोम stoppers शीशियों के उद्घाटन से बड़ा है ताकि वे चर खोलने आकार की शीशियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि आवश्यक हो तो यहाँ वर्णित आकार बदला जा सकता है. (ख) दिखाया सूक्ष्म विच्छेदन सुइयों के लिए आवश्यक सामग्री हैं. (सी) दिखाया गया है कि मक्खियों को ठंडा करने के लिए प्रयोग किया जाने जाने वाली कठोर आइसपैक है। (डी) दिखाया बोतल के आकार का अंडा संग्रह पिंजरे (बाएं), इसकी डिजाइन योजना (मध्य), और एक साधारण अंडा संग्रह पिंजरे एक शीतल पेय की बोतल से बना है (दाएं) (ई) दिखाया ताररहित ट्यूब ब्रश ड्राइवर के लिए आवश्यक सामग्री हैं. सफेद रंग का गोल ब्रश जिसे ड्रिल ड्राइवर के लिए माउंट किया जा सकता है, पेट्री डिश को साफ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक आइसपैक की ठंडी सतह पर ठंडा मक्खियों। संघनन पानी चिकित्सा धुंध द्वारा अवशोषित कर लेता है, और ठंडा मक्खियों सूखी रखा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: समय के साथ आइसपैक सतह के तापमान का रूपांतर। डेटा पांच कठिन आइसपैक से एकत्र किए गए थे, और तापमान 25 डिग्री सेल्सियस के एक आर टी और 29% की सापेक्ष आर्द्रता पर एक अवरक्त थर्मामीटर के साथ एक आइसपैक के केंद्र में दो स्थानों में मापा गया। फ्रीजर का तापमान -24.5 डिग्री सेल्सियस था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एथिल ईथर और गहरी ठंड से मारे गए लोगों के लिए microwaving द्वारा मारे गए मक्खी शवों की तुलना. जब microwaving द्वारा मारे गए मक्खी शवों एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई, कोई झुलसा या विकृतियों शरीर पर पाए गए, और कोई ध्यान देने योग्य मतभेद शरीर का रंग, आंखों का रंग, और पंख के आकार में पाए गए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एजेंटबी की हत्या मक्खियों को मारने के लिए इस्तेमाल किया गया समय वजन (mg/30 मक्खियों) विंग (मिमी या मिमी2)घ
महिला पुरुष महिला पुरुष
क्षेत्रएन एस लंबाईएन एस चौड़ाईएन एस क्षेत्रएन एस लंबाईएन एस चौड़ाईएन एस
गर्मी 1 मिनट 20 s 36.60 डिग्री 0.00 एसी 22.65 ]0.95 एक ए 1.51 ]0.16 2.30 डिग्री 0.12 0.92 डिग्री 0.05 १.२००००००९ 2.06 डिग्री 0.08 0.83]0.03
सर्दी 15 मिनट 41.20 डिग्री 0.10 बी बी 25.70 $1.00 ए बी ए 1.57 डिग्री 0.15 2.37 डिग्री 0.12 0.94 डिग्री 0.05 १.२९०१२ २.०९००१० 0.84 डिग्री 0.05
ईथर 10 मिनट 43.35 ]0.85 b 26.9 ]0.70 b ए 1.57 डिग्री 0.16 2.36 डिग्री 0.11 0.94 डिग्री 0.05 १.१९९०१० २.०९०००१० 0.83 डिग्री 0.04
एक वयस्क Drosophila जंगली प्रकार Drosophila मेलेनोगैस्टरहैं . वे बीजिंग, चीन में कब्जा कर लिया और अधिक से अधिक 5 साल के लिए मेरी प्रयोगशाला में रखा जाता है, और cornmeal माध्यम में 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा.
ख उपकरणों का इस्तेमाल गर्मी कर रहे हैं: 1,300 डब्ल्यू माइक्रोवेव ओवन; ठंड: फ्रिज (-30 डिग्री सेल्सियस); ईथर: 2 एमएल ईथर, और ईथरकेशकर का आंतरिक आकार 170 एमएल है।
c प्रत्येक स्तंभ के भीतर, एक ही पत्र के बाद का मतलब है डंकन एकाधिक रेंज टेस्ट से काफी अलग नहीं हैं, कम /
घ मक्खी एक ही संस्कृति शीशी से बेतरतीब ढंग से चयन कर रहे हैं. एक ही लिंग के बीस दाहिने पंख एक ही एजेंट द्वारा मारे गए मक्खियों से एकत्र किए गए थे और दो प्रतिकृतियां बनाए रखी गई थीं। प्रत्येक पंखों की डिजिटल तस्वीरें ले जाया गया और विंग आकार ImagePro प्लस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया था
ंःअ-महत्वपूर्णं च च ते ते ते ते ते ते ते

तालिका 1: शव वजन और वयस्क Drosophila के पंख आकार पर तीन हत्या एजेंटों के प्रभाव.

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Discussion

Drosophila पालन और प्रयोग में शामिल बुनियादी गतिविधियों से निपटने के लिए कुछ घर का बना उपकरण इस कागज में वर्णित हैं. इन उपकरणों को सरल लेकिन बल्कि प्रभावी रहे हैं. वस्तुतः, किसी भी प्रयोगशाला आसानी से इन उपकरणों कर सकते हैं, और एक अनुसंधान या एक शिक्षण प्रयोगशाला के लिए एक तैयार विकल्प है कि शायद स्थानीय रूप से उपलब्ध नहीं है खोजने की जरूरत नहीं है.

फ्लाई स्थानांतरण सबसे आम अभ्यास और Drosophila प्रयोगों में एक मुश्किल काम है. दुर्भाग्य से, अब तक, वहाँ कोई उपकरण3,4, 12,17यहाँ, टी और एफ-स्टॉपर स्थानांतरित करने का वर्णन किया गया है. इन सरल उपकरण मक्खियों को स्थानांतरित करना बहुत आसान और अधिक नियंत्रणीय, और कम मक्खियों हस्तांतरण के दौरान बच, तथ्य यह है कि कुछ आवारा मक्खियों हाल के वर्षों में आनुवंशिकी वर्गों में पाया गया है द्वारा सबूत के रूप में. स्पंज प्लग लोचदार है के रूप में, यह शीशियों के उद्घाटन व्यास के अंदर एक ही है कि आवश्यकता नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक समय में पिपेट टिप के उद्घाटन के माध्यम से पारित करने के लिए केवल एक मक्खी की अनुमति है; इसलिए, टी-स्टॉपर मक्खियों को शीशी में बढ़ने से रोकते हैं, और प्रयोगकर्ता आसानी से प्रक्रिया को रोक सकता है और स्थानांतरित मक्खियों की संख्या को नियंत्रित कर सकता है। टी-स्टॉपर भी पुराने भोजन को एक ताजा शीशी में छोड़ने से रोक सकते हैं। टी और एफ-स्टॉपर बनाने और उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, और यहां तक कि एक अनुभवहीन हैंडलर जल्दी और आसानी से उड़ान भरने के स्थानान्तरण को पूरा कर सकते हैं।

एफ-स्टॉपर का उपयोग मक्खियों को एक नई शीशी में मार्गदर्शन करने के लिए किया जाता है। वयस्क मक्खियों डाट के नीचे सहयोगी के लिए करते हैं और कीप के तने से बच नहीं है। यह कुछ काम आसान और अधिक नियंत्रणीय बनाता है (जैसे, एक शीशी से दूसरे में मक्खियों को स्थानांतरित करने या एक तैयार पार करने के लिए अतिरिक्त कुंवारी मक्खियों या पुरुष मक्खियों जोड़ने). यह पाया गया है कि जब एक शीशी एक काफी लंबे समय के लिए प्रयोगशाला में रखा जाता है (उदाहरण के लिए, 1 ज), केवल बहुत कुछ मक्खियों कीप के तने से बच जाएगा.

इस कागज में, मक्खियों को स्थिर करने के लिए एक व्यावहारिक द्रुतशीतन विधि का वर्णन किया गया है। इस विधि ईथर और सीओ2 के लिए एक महान विकल्प है और दोनों अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि विशेष रूप से एक शिक्षण प्रयोगशाला के लिए अनुकूल है, के रूप में एक प्रशिक्षक के रूप में छात्रों के लिए संभावित स्वास्थ्य जोखिम के बारे में चिंतित होने की जरूरत नहीं है या महान प्रयास करने के लिए एक भीड़ भरे शिक्षण प्रयोगशाला में एक महंगी मचान क्षेत्र का निर्माण. इस विधि लागत प्रभावी है, के रूप में icepacks सस्ती और पुन: प्रयोज्य हैं. एक शोधकर्ता या छात्र ठंडा और कहीं भी मक्खियों का निरीक्षण कर सकते हैं, के रूप में इस "ठंडा पैड" किसी भी पाइप से कनेक्ट नहीं करता है. यह विधि न केवल लोगों के लिए सुरक्षित है बल्कि मक्खियों के लिए भी सुरक्षित है, क्योंकि सिस्टम -2 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर काम करता है। मक्खी हल्के से बाहर खटखटाया और जब तक वे ठंड की सतह पर रहते हैं और मारे नहीं रहे हैं स्थिर रहते हैं। मक्खियों जल्दी से चेतना हासिल एक बार वे कमरे के तापमान पर लौटने. जो लोग इस विधि को लागू एक प्रशिक्षण अवधि की आवश्यकता नहीं है, और अत्यधिक या अपर्याप्त संज्ञाहरण सांद्रता के साथ कोई चिंता नहीं कर रहे हैं. हालांकि, प्रयोगकर्ताओं को आइसपैक के आकार पर करीब से ध्यान देना चाहिए, क्योंकि छोटे आकार के आइसपैक (उदाहरण के लिए, 400-500 एमएल, कै 19 सेमी x 11 सेमी x 2.5 सेमी) मक्खी द्रुतशीतन के लिए वांछनीय नहीं हैं क्योंकि वे जमे हुए होते हैं और सतहों पर काम करना अजीब हो जाता है।

एक बोतल के आकार का अंडा संग्रह पिंजरे भी प्रोटोकॉल के लिए विकसित किया गया था. टी और एफ-स्टॉपर का लाभ उठाते हुए, पिंजरे में बड़ी मात्रा में मक्खियों को जोड़ा जा सकता है या स्थानांतरित किया जा सकता है, जिसके लिए पहले से ही मक्खियों को स्थिर करने की आवश्यकता होती है। यह पाया गया है कि माइक्रोवेव हीटिंग निरीक्षण या discarding के लिए मक्खियों को मारने के लिए एक कारगर तरीका है। एक यांत्रिक पेंसिल आधारित microdissection सुई और ड्रिल आधारित एक सफाई उपकरण भी उपयोग किया गया. इन उपकरणों के सभी सरल और अच्छी तरह से काम कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A pair of pliers
Cordless drill driver max speed: 500 rpm
Electric soldering iron
File
Funnel diameter of disk<60mm
Ice box
Insect pins
Infrared thermometer HCIYET HT-830
Long cuff rubber gloves
Mechanical pencils
Medical gauze
Microcentrifuge tube 100 ul
Microwave oven
Parafilm
Peri dish internal diameter 60 mm
Pipette tips 1 ml
Plastic film
Plastic Peri dish Φ36 mm used to cover the empty vial
Point tweezers
Protective work gloves
Re-freezable hard icepacks 26.5×14.5×2.5 cm or larger
Rubber air blower
Snap cutter
Soft drink bottle 500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
Sponge stopper
Stainless steel sponges
Tube brush
Vial Φ34 mm × 90 mm

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References

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जीव विज्ञान अंक 149 Drosophila,वयस्क स्थानांतरित ठंडा तरीकों वयस्क हत्या संस्कृति शीशी सफाई अंडा संग्रह
फल मक्खी को संभालने के लिए सरल घर का बना उपकरण ]<em>Drosophila मेलेनोगैस्टर</em>
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Yang, D. Simple Homemade Tools to… More

Yang, D. Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies—Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59613, doi:10.3791/59613 (2019).

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