Summary
Beskrivs här är användningen av flera hemgjorda verktyg för att överföra, kyla och döda vuxna Drosophila, samt att rengöra glas kultur flaskor och samla ägg. Dessa verktyg är lätta att göra och är ganska effektiva i hanteringen av Drosophila.
Abstract
Fruktfluga, Drosophila melanogaster, används flitigt både i biologisk forskning och biologi utbildning. Hantering vuxen flugor är vanligt men svårt i praktiken, som vuxna flugor flyga. Demonstreras här är hur man gör några enkla och kostnadseffektiva verktyg för att hantera svåra frågor i hanteringen av Drosophila. Hål i skum proppar görs och pipettspetsar eller trattar sätts in i hålen. Flugor rör sig då endast i en riktning i pipettspetsen/trattens assemblage, vilket möjliggör en effektiv kontroll av överföringen av adulta Drosophila till eller från en injektionsflaska. Befintliga protokoll har modifierats för cool-anesthetizing flugor genom kylning i krossad is och överföra dem till en kall, hård den yta. Den den är täckt med en bit av medicinska gasväv som håller immobiliserade flugor från kondenserat vatten när de undersöks under en stereomikroskop. Flugorna är slutligen euthanized för att räkna och sortera eller kasseras genom microwaving. En flaskformad bur har också utvecklats för att samla ägg, samt en arbetsbesparande anordning och medföljande protokoll för rengöring glas kultur flaskor.
Introduction
Den fruktfluga, Drosophila melanogaster, är en modell organism som ofta används i biologisk forskning och biologi utbildning för att studera ett brett spektrum av ämnen1,2. De grundläggande problemen med att hantera Drosophila är överföring av vuxna från flaska till injektionsflaska och immobilisering av flugorna så de är lättare att hantera, eftersom alla vuxna (med undantag för vissa mutanter3,4) kan flyga.
Konventionellt, en forskare överföringar flyger från en flaska till en annan genom att hålla två flaskor mun-till-mun, knacka på flugor ner eller tillåter flugor att flyga upp i en annan flaska, sedan separera och koppla båda flaskorna4. Uppenbarligen kräver detta att öppnandet av två flaskor med samma diameter, och det är svårt att kontrollera mängden av flugorna överförs. Under tiden kräver detta snabba händer för att få jobbet gjort, och flyr ströva flugor kan resultera i problem för laboratoriet eller klassrummet. Lägga till extra virgin flugor eller manliga flugor till ett redan förberett kors är en annan rutinmässig uppgift i Drosophila experiment. Konventionellt, flugor måste immobiliseras i korset flaskan innan tillägg av extra flugor.
Adult Drosophila bedövas rutinmässigt av eter, Co2, eller kylning5. Jämfört med eter och co2 exponering, kylning är den mest kostnadseffektiva agenten för immobilisering vuxna Drosophila och minst skadligt för både flugor och forskare (särskilt unga studenter)6,7. Men vatten som kondenserar kontinuerligt på den kalla ytan eller kammaren vippar flugorna. Det är svårt att bestämma fenotyper av våta flugor, och de kan lätt skadas under manipulation8,9. Detta har hållit kylan metoden från att bli mer allmänt accepterad.
Verktyg för flugtransferal och en metod för flug kylning har beskrivits tidigare10. Häri, en modifierad kylning anestesiteknik rapporteras som är säker, pålitlig, och genomförbart för Drosophila experiment. Beskrivs också i detta dokument är 1) metoder för att döda vuxna för att räkna, sortera eller kasta, 2) arbetsbesparande anordningar och protokoll för rengöring av glas kulturer flaskor, och 3) en enkel bur för uppsamling av ägg. De lätt utformade och kostnadseffektiva verktyg som beskrivs här kan användas för att hantera de svåra frågorna om flug hantering, och dessa metoder har testats och visat sig vara robusta, pålitliga och lätthanterliga för erfarna och oerfarna forskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse av verktyg och tillbehör
- Proppar/trattar
- Få två svamp proppar (diametern på pluggarna måste vara något större än den inre diametern på de flaskor som används för att överföra flugor). Gör ett hål i centrum av svampen pluggar med en uppvärmd elektrisk lödkolv.
- Få två 1 mL pipettspetsar, skär en på mitten på tvären med en vass kniv och kassera den spetsiga änden. Klipp sedan 1,5 cm av den spetsiga änden av den andra pipettspetsen. Limma resterna av de två pipettspetsarna tillsammans med ett universallim för att göra en långsträckt pipettspets (figur 1a).
- Sätt i en tratt och den långsträckta pipettspetsen i svamp kontakterna för att göra en spets och trattpropp (hädanefter kallad T-och F-proppar) och lock pipettspetsen med ett 100 μL microcentrifugerör (figur 1a).
Anmärkning: Längden på tratten stammen måste vara större än höjden på pluggen. Om det är kortare än eller lika med höjden på pluggen, då flugor kommer att fly från stjälken öppningen. Änden på tratt stammen bör vara placerad minst 2 cm över ytan av odlingsmediet eller botten av en tom flaska. Små trattar (t. ex. disk diameter < 60 mm) med små inre skaft öppnings diametrar (< 5 mm) är att föredra. Antingen ett glas eller en plasttratt kan användas för att göra en F-propp. Men, plast trattar är att föredra för biologi klasser, eftersom de bryts mindre lätt än glas kanaler.
- Microdissecting nålar
- Få mekaniska blyertspennor som känns bekväma i handen och insektsnålar som matchar diametrarna (t. ex. 0,5 mm, 0,7 mm) av bly påfyllningarna.
- Skär de breda ändarna av insektsnålar med ett par tänger och fil snittet platt. Byt ut ledningen mot stiften (figur 1b). Tryck på knappen Klicka och mata ut 0.5 – 1 cm av en nål för att genomföra en dissektion. Rengör stiftet och skjut den helt tillbaka till pennan axeln efter en dissektion aktivitet för att göra det säkert för någon person att hantera.
Anmärkning: Microdissecting nålar är användbara inte bara i dissektioner av organ som larv spottkörtlar men också i räkning och sortering döda vuxna flugor.
- Hårda icepacks
- Få flera refreezable hård icepacks (stor-storlek icepacks är att föredra). Figur 1c visar ett icepacks som fungerade bra, vilket mäter 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm och har topp-och botten sidor som är helt plana.
- Skär medicinsk gasväv (nonsteril) i bitar som är något mindre än de kalla ytorna på icepacks de täcker. Till exempel, en bit av medicinska gasväv något mindre än 26,5 cm x 14,5 cm är att föredra att täcka en den visas i figur 1c.
Anmärkning: De nödvändiga tillbehören för dessa kylning verktyg är: en Ice Box (vi använde en 25 cm x 15 cm x 15 cm skum låda för en person och 37 cm x 28 cm x 20 cm låda för mer än en person), som används för att lagra krossad is; ett par fin-punkt pincett, som används för att greppa kylda flugor av sina vingar och överföra dem till en flaska; ett par skyddande arbetshandskar, som används för att ta kylda icepacks av en-20 ° c frys; och plastfilm, som används för att täcka stadiet av ett stereomikroskop.
- Drosophila ägg samling bur
Anmärkning: Färdiga Drosophila ägg samling burar finns tillgängliga från många bioteknikföretag11. Beskrivs här är en liten akryl flaska-formad ägg uppsamlings bur för 60 mm petriskålar (figur 1d vänster; bur designen visas i mitten). Det kan anpassas för andra petriskål storlekar (t. ex. 100 mm, 35 mm). Detta möjliggör överföring av flugor i eller ut ur buren med lätthet. En enkel bur kan förberedas på följande sätt.- Använd en Snap Cutter för att skära en mjuk plast dryck flaska (500 mL, inre diameter ca. 65 mm) till en ungefärlig 2:1 (spetsiga änden: Blunt End) förhållande och kasta den trubbiga änden.
- Linda en remsa av kort papper runt en äppeljuice tallrik (innerdiameter 60 mm) med tejp [äpplejuice plattan används för att samla ägg (figur 1e, höger)].
- Sladdlös rör borste driver
- Skaffa en sladdlös borr förare (max hastighet = 500 rpm).
- Skaffa en rör borste som har borst längs dess sidor samt dess framsida. Helst bör diametern på borsten vara något större än diametern på kulturen flaskor som behöver rengöras. Skär änden av handtaget så att det kan sättas in i borrchucken (figur 1d).
Anmärkning: De nödvändiga tillbehören för dessa rengöringsverktyg inkluderar rostfrittstål svampar och lång krage gummihandskar.
2. överföring av vuxna flugor från injektionsflaska A till injektionsflaska B
Anmärkning: Överföring av vuxna flugor från en injektionsflaska till en annan är den vanligaste praxis som bedrivs i Drosophila experiment [t. ex. överföra flugor från gammal kultur (a) till färsk kultur (b) eller från en kors flaska (a) till Tom injektionsflaska (b)] för anesthetizing. Protokollet som beskrivs här kan användas för alla vuxna flyga överföra aktiviteter. Om inget annat anges används detta protokoll för att överföra flugor från injektionsflaska A till injektionsflaska B i hela detta papper.
- Kontrollera stammen av tratten av en F-propp och pipettspetsen på en T-propp försiktigt, avmarkera sedan alla flugor som finns kvar i proppar med en gummi fläkt. Detta steg är av största vikt, särskilt när en uppsättning av T-och F-proppar används för kontinuerlig överföring av olika Drosophila linjer.
- Tryck ner flugorna i injektionsflaskan A och sätt tillbaka kontakten med en T-propp och sätt sedan i injektionsflaskan B med en F-propp.
- Invertera injektionsflaskan A över injektionsflaska B, sätt in pipettspetsen i änden av T-proppen i F-propp i trattens öppning, knacka på kanten av inverterad injektionsflaska A så att flugor glider ut ur pipetten och genom tratten och släpper in injektionsflaska B. Om någon gammal mat i injektionsflaska A blir mindre kompakt, kan det sjunka när flaskan A är inverterad och knackade. I en sådan situation, Vänd injektionsflaskan B över injektionsflaskan A och låt flugorna krypa upp i injektionsflaskan B.
- Separera T-proppen från F-proppen. Locket på pipettspetsen änden av T-proppen med ett 200 μL microcentrifugerör om de kvarvarande flugorna i injektionsflaskan behöver överföras till andra injektionsflaskor tillfälligt; ta i annat fall bort T-proppen och sätt tillbaka injektionsflaskan A. ta bort F-proppen och sätt tillbaka injektionsflaskan med B.
3. immobilizing flugor genom kylning
- Förvara hårt refreezable icepacks i a-20 ° c frys i minst 24 h före användning.
- Placera en kyld, hård den i rumstemperatur (RT) i 20 min. Fukta lätt en bit av icke-aseptisk medicinsk gasväv med lite rinnande vatten och låt den nära hålla fast vid ytan av den. Den medicinska gasväv kan återanvändas i nästa fluga kylning. På samma gång, kyla en tom flaska i krossad is.
- Överför vuxna flugor som måste immobiliseras i den kylda tomma flaskan (CEV). När de två överförings rören separeras, täck CEV med en petriskål eller en plugg och slå CEV mot den krossade isen för att knacka på alla flugor i CEV ner till botten. Upprepa denna process flera gånger tills alla flugor är immobiliserade. Flugorna kommer att immobiliseras inom 30 s. Nästa, placera CEV i isen för 1 min. Det är inte tillrådligt att överföra alltför många flugor på en gång för anesthetizing.
- Häll kyld flyger ut på den medicinska gasväv som täcker isen Pack. Fördela de överlappande flugor med en pensel och se till att varje fluga kan kylas av den kalla ytan på icepack. Om en kyld hård den sväller något, placera den på en handduk och arbeta på sin plana sida.
- Ta bort scen klippen från stereomikroskopet, täck scenen med en bit plastfilm och sätt upp icepacken på scenen. Slå på den övre lampan (en kall ljuskälla är önskvärt), fokusera stereomikroskopet och flytta den tills kylflugorna kan ses tydligt.
4. avlivning vuxen flugor för att räkna, sortera eller kasta överbord
- Överför vuxen flugor i en tom flaska och täck den med en petriskål.
- Vänd på injektionsflaskan, värm den i 1 min + 20 s i en mikrovågsugn, och låt de döda flugor droppa in i petriskål.
- Sätt på skyddande arbetshandskar och ta ut injektionsflaskan ur mikrovågsugnen. Häll de döda flugor på ett vitt papper kort, räkna eller undersöka flugor med en microdissecting nål under en stereomikroskop, och avyttra flyga organ i en soptunna efter observation.
- För att döda oönskade flugor, värm flugorna i 2 – 3 minuter i en mikrovågsugn och knacka sedan på slaktkropparna i en soptunna.
Anmärkning: Det är inte tillrådligt att döda några Wing Mutant stammar (t. ex., vinge längd mutanter) för undersökning, eftersom det är svårt att döma av slaktkropparna om vingarna sträcker sig bortom spetsen av buken, som ses i vild-typ flugor.
5. överföra flugor in/ut ur flaskformade ägg uppsamlings bur
Anmärkning: Som nämnts ovan, T-och F-proppar används för att överföra flugor in och ut ur ägget uppsamlings bur. Flugor behöver inte vara sövda under hela denna process. Andra detaljer, såsom att förbereda äpplet saft medium, ägg insamling och dechorionization, kan hittas i litteraturen12.
- Sätt ägg uppsamlings bur i äpplejuice plattan eller montera äpplejuice plattan till buren gjord av en läsk flaska. Täta leden runt de två komponenterna med en remsa av paraffin film.
- Placera så många flugor som möjligt i buren och koppla om buren med en skum propp efter överföring av flugor.
- För att byta mat för flugor i buren, överför flugorna i buren till en tom injektionsflaska.
- Byt ut äpplejuice plattan och återföravsluta den, sedan överföra flugorna från injektionsflaskan tillbaka till buren.
- När ägget insamling slutar, överföra flugorna i en tom flaska och överföra dem till kulturen flaskor.
6. rengöring glas kultur flaskor
Anmärkning: I allmänhet innehåller en gammal kultur flaska levande flugor. I det protokoll som beskrivs här behöver dessa flugor inte dödas före rengöring om de inte är transgena flugor.
- Ta bort alla permanenta markör bläck från glas kulturen flaskor med våta, rostfrittstål svampar.
-
Blötlägg kultur flaskorna i rinnande vatten.
- Fyll ett laboratorium sjunka med vatten, tillsätt flytande diskmedel i vattnet, och blanda.
- Sänk ned kultur flaskorna i vattnet och ta sedan bort pluggen så att vattnet kan köra in i injektionsflaskan. Diskmedlet i vattnet kommer att göra alla kvarvarande vuxna flugor sjunka till botten och drunkna i vattnet.
- Blötlägg den gamla kulturen flaskor i vatten i minst 30 min.
- Lossa borr chucken, sätt in prov rörs borsten och dra åt chucken. Kontrollera rotationsväljarens riktning och se till att borren roterar medurs. Justera hastighets utlösaren och se till att maxhastigheten är mindre än 500 rpm.
-
Rengör kultur flaskorna.
- Rengör kultur flaskorna grovt.
- Sätt en lång manschettgummi handske på den icke-dominerande handen och håll flaskan i vattnet.
- Håll den sladdlösa rör borst drivrutinen med den nakna dominanta handen, pressa borsten till odlings flaskan och pressa avtryckaren.
Anmärkning: Doppa inte batteriet i vattnet. Den roterande borsten kommer att bryta upp gammal mat, Pupa, etc., och ta bort mer än 95% av avfallet. - Dumpa avfallet i en separat soptunna. Upprepa denna process tills det mesta av avfallet i varje injektionsflaska har rengjorts.
- Rengör odlings flaskorna grundligt.
- Rengör rör borsten, dränera och rengör diskbänken och fyll på den med rent vatten.
- Ta bort det kvarvarande avfallet från varje odlings flaska som beskrivs i avsnitt 6.4.1.
- Rengör kultur flaskorna grovt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T-och F-proppar utvecklades som en uppsättning enkla verktyg som kan anpassas och användas i alla flyga överföra aktiviteter. Överföra flugor från en gammal kultur i flera nya kulturer innebär att ta bort pluggarna på de färska injektionsflaskorna, ersätta dem med F-proppar, sedan knacka ner flugorna i den gamla flaskan, snabbt ta bort dess plugg, och ersätta den med en T-propp. Om den gamla maten är kompakt, då är det viktigt att vända den gamla flaskan och sätt spetsen på T-propp i öppningen av en F-propp, sedan knacka på flugorna ner i den färska flaskan. Sedan, ersätter T-och F-proppar och omkoppling av flaskor utförs. Om den gamla maten blir mindre kompakt, är det klokt att vända den färska flaskan över, montera F-propp till T-propp, och låt flugor att krypa upp i den färska flaskan.
För att lägga till extra flugor till ett redan förberett kors, är det viktigt att knacka på flugorna i korset flaskan ner och ersätta dess kontakt med en F-propp. Sedan måste försöksledaren undersöka de kylda flugor under en stereomikroskop, plocka upp en önskad flyga genom sin vinge med hjälp av ett par spetsiga pincett, och låt den glida in i korset flaskan genom stammen av tratten. Om en fluga är instängd i stammen av en tratt, det rekommenderas att försiktigt blåsa på den med en luftblåsare och låt den glida in i flaskan. Byte av F-propp och omkoppling av injektionsflaskan när tillräckligt med flugor för ett kors har samlats in krävs då. T-och F-proppar infördes i 201013,14; hittills har mer än 1 200 studenter dragit nytta av dessa flyga överföra enheter. T-och F-proppar har också införts för instruktörer och forskare genom en laboratorie guide15, som har antagits för användning i undervisnings-och forskningslaboratorier.
Befintliga Chill anesthetizing metoder har modifierats för användning i denna studie. Krossad is eller is-vattenblandningar används för att kyla den vuxna flugor sedan överföra immobiliserade flugor på den kalla ytan av en den täckt med en bit av nonsteril medicinsk gasväv. Den gasbinda fibrerna suga upp kondenserat vatten och hålla flugorna torra när de undersöks. På samma gång, de små hålen mellan varp/väft trådar tillåter flugor att röra den kalla ytan på den och hålla dem orörligt (figur 2). Vid en rumstemperatur på 25 ° c ökar temperaturen på ytan av en kyld, hård den dramatiskt från-19 ° c till-2 ° c inom 20 min och når en platå som är säker för både gamla och nykläckta flugor (figur 3). En den fungerar ganska bra inom platån, och de kylda flugor återfå medvetandet vid rumstemperatur inom 30 s. Eftersom en hård den är tunn, kan den sedan placeras under ett stereomikroskop för att undersöka flugorna. Den hårda den beskrivs här kostar mindre än $2; Dessutom har 60 hårda icepacks för en klass av 100-150 studenter varje termin använts, och de är återanvändbara i många år. Denna modifierade version av den kylning anestesiteknik introducerades till en specifik genetik klass tre år sedan, och dess robusthet har testats av mer än 300 studenter och de i andra universitet.
Det har visat sig att mikrovågsugn dielektrisk uppvärmning är en snabbare, mer bekväm agent för att döda vuxna flugor (om de inte längre behövs efter observation) jämfört med agenter som overetherizing eller djupfrysning (tabell 1). Mikrovågsugn dielektrisk uppvärmning kräver en mycket kortare tid att döda flugor än overetherizing eller djupfrysning. Alla flugor dör inom 80 s, så räkna och sortera en stor sats av flugor inom en kort tidsram är möjligt16. Förutsatt att försöksledaren måste döda flugor 20x att räkna och sortera partier för ett experiment, kommer det att ta 3 h + 20 min och 5 h för att döda flugorna genom overetherizing och djupfrysning, respektive; emellertid, endast 27 min behövs med hjälp av en mikrovågsugn.
Liknar overetherized flugor, mikrad flugor förlänga vingarna i rät vinkel från kropparna. Generellt flyga slaktkroppar dödades av mikrovågsugnen var betydligt lättare än de dödas av eter eller kylning, men värmen förvränger inte kroppen form, och slaktkropparna blir inte skarpa eller grumlig. Egenskaper (t. ex. kroppsfärg, ögonfärg och Ving form) av mikrad flugor liknar dem som dödas av eter eller frysning (figur 4), och det finns inga signifikanta skillnader i Ving storlekar (område, längd, bredd) av flugor som dödas av de tre agenterna ( Tabell 1). Därför kan slaktkroppar av flugor som dödas av mikrovågsuvnen användas för att räkna, sortera och mäta vissa egenskaper, till exempel Ving storlek. Mikrovågsugn uppvärmning är också ett bra sätt att döda oönskade flugor och avyttra dem i tid. Dessutom flyger sjukhusens (flaskor som innehåller brandfarliga etanol, metanol eller tvål lösningar), som används för att lagra döda eller kastas flugor, inte längre behövs i fly Labs eller biologi klasserna3.
En liten, Flask-formad ägg uppsamlings bur var avsedd för detta protokoll. Med hjälp av T-och F-proppar, kan ett stort antal flugor överföras till eller från buren, och äpple juice medium plattorna kan ändras med större lätthet. Slutligen, flugorna behöver inte anesthetizing före och efter ägg insamling.
En sladdlös rör borste drivrutin och protokoll för användning av denna utrustning för att rengöra kulturen flaskor utvecklades också för protokollet. Denna batteridriven slang borste kan enkelt bryta ner Gammal mat och Pupa bifogas en glas kultur flaska, en flaska kan rengöras inom 30 s, och effektiviteten av rengöring ökas kraftigt; Därför är rengöring av stora mängder glas kultur flaskor inte längre en tråkig uppgift.
Figur 1: verktyg som används för att hantera Drosophila. (A) som visas är flug överföringsverktyg och nödvändiga tillbehör. De är (från vänster till höger) en luftblåsare (används för att blåsa ut vuxna flugor kvar i tratten stammen); T-och F-proppar (införas i flaskor); och en tom flaska täckt med en petriskål (36 mm, den nedre halvan av en 40 mm petriskål). Skum proppar är större än öppningarna av flaskorna så att de kan användas med flaskor av varierande öppnings storlekar. Den storlek som beskrivs här kan ändras vid behov. (B) visas är material som behövs för de mikro-dissekera nålar. (C) visas är den hårda den används för att kyla flugor. (D) visas är Flask-formade ägg uppsamlings bur (vänster), dess designplan (mitten), och en enkel ägg samling bur gjord av en läsk flaska (höger) (E) visas är de material som behövs för den sladdlösa röret borste föraren. Den vitfärgade rund borsten som kan monteras på borr föraren används för att rengöra Petriskålarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kylda flugor på den kalla ytan på ett icepack. Det kondenserande vattnet absorberas av den medicinska gasväv, och de kylda flugor hålls torra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: variation av temperaturen på den ytan med tiden. Uppgifterna samlades in från fem hårda icepacks och temperaturerna mättes på två ställen i mitten av ett den med en infraröd termometer vid en RT på 25 ° c och relativ luftfuktighet på 29%. Frystemperaturen var-24,5 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av flug slaktkroppar som avlivats genom mikroviftande till dem som avlivats med etyleter och djupfrysning. När flyga slaktkroppar dödades av mikrovågsugnen undersöktes under en stereomikroskop, inga scorches eller snedvridningar hittades på kropparna, och inga märkbara skillnader hittades i kroppen färg, ögonfärg, och vinge form. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Killing agentb | Tid som används för att döda flugor | Vikt (mg/30 flugor) | Vinge (mm eller mm2)d | ||||||
| Kvinna | Manliga | Kvinna | Manliga | ||||||
| Områdens | Längdns | Breddns | Områdens | Längdns | Breddns | ||||
| Värme | 1 min 20 s | 36.60 ± 0,00 a Ac | 22.65 ± 0,95 a A | 1.51 ± 0,16 | 2.30 ± 0,12 | 0.92 ± 0,05 | 1,20 ± 0,09 | 2,06 ± 0,08 | 0.83 ± 0,03 |
| Chill | 15 min | 41.20 ± 0,10 b B | 25.70 ± 1,00 AB A | 1,57 ± 0,15 | 2,37 ± 0,12 | 0,94 ± 0,05 | 1.23 ± 0,12 | 2,07 ± 0,10 | 0.84 ± 0,05 |
| Eter | 10 min | 43.35 ± 0,85 b B | 26,9 ± 0,70 b A | 1,57 ± 0,16 | 2.36 ± 0.11 | 0,94 ± 0,05 | 1.18 ± 0,10 | 2,05 ± 0,10 | 0.83 ± 0,04 |
| a den vuxna Drosophila är Wild typ Drosophila melanogaster. De fångas i Peking, Kina och förvaras i mitt labb i mer än 5 år, och hålls vid 25 ° c i majsmjöl medium. | |||||||||
| b den utrustning som används är värme: 1 300 W mikrovågsugnen; kyla: kylskåp (-30 ° c); eter: 2 mL eter, och den inre storleken på etherizer är 170 mL. | |||||||||
| c inom varje kolumn, medel följt av samma bokstav skiljer sig inte signifikant av Duncans multipel Range test, gemener/versaler indikerar p = 0,05/0,01 | |||||||||
| d flugor väljs ut slumpmässigt från samma kultur flaska. Tjugo höger vingar av samma kön samlades in från flugor dödades av samma agent och två replikationer upprätthölls. Digitala fotografier av varje vingar togs och Ving storlek mättes med hjälp av ImagePro plus programvara | |||||||||
| ns: icke-signifikanta på p = 0,05 | |||||||||
Tabell 1: effekterna av de tre avlivnings medlen på slakt kroppsvikter och Ving storlekar hos vuxna Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Några hemgjorda verktyg för att hantera grundläggande aktiviteter som är involverade i Drosophila uppfödning och experiment beskrivs i detta dokument. Dessa verktyg är enkla men ganska effektiva. Praktiskt taget kan alla labb göra dessa verktyg med lätthet, och en forskning eller ett undervisnings laboratorium behöver inte hitta ett färdigt alternativ som kanske inte är tillgängligt lokalt.
Flyga överföring är den vanligaste praxis och en svår uppgift i Drosophila experiment. Tyvärr, fram till nu, har det inte funnits några beskrivna överföra verktyg3,4,12,17 här, T-och F-proppar beskrivs. Dessa enkla verktyg gör överföring av flugor mycket lättare och mer kontrollerbar, och färre flugor fly under överföringen, vilket framgår av det faktum att få ströva flugor har hittats i genetik klasserna under de senaste åren. Eftersom svampen pluggen är elastisk, det kräver inte att öppningen av flaskorna har samma innerdiameter. Dessutom får endast en fluga passera genom öppnandet av pipettspetsen åt gången. Därför, T-proppar förhindra flugor från svallande i en flaska, och försöksledaren kan enkelt stoppa processen och kontrollera antalet flugor som överförs. T-proppar kan också hindra Gammal mat från att släppa in i en ny injektionsflaska. T-och F-proppar är lätta att göra och använda, och även en oerfarna hanterare kan slutföra flyga överföringar snabbt och enkelt.
F-proppar används för att vägleda flugor i en ny injektionsflaska. Den vuxna flugor tenderar att associera under proppen och inte fly från stammen av tratten. Detta gör en del arbete lättare och mer kontrollerbar (t. ex. överföra flugor från en flaska till en annan eller lägga till extra virgin flugor eller manliga flugor till ett förberett kors). Det har visat sig att när en injektionsflaska placeras i laboratoriet under en ganska lång tid (t. ex. 1 h), kommer endast mycket få flugor fly från stammen av tratten.
I detta dokument beskrivs en genomförbar kylnings metod för immobiliserande flugor. Denna metod är ett bra alternativ till eter och CO2 och kan användas i både forskning och undervisning laboratorier. Denna metod är särskilt vänlig mot ett undervisnings labb, som en instruktör inte behöver vara lika bekymrad över potentiella hälsorisker för studenter eller göra stora ansträngningar för att konstruera en dyr iscensättning område i ett trångt undervisnings labb. Denna metod är kostnadseffektiv, eftersom icepacks är billiga och återanvändbara. En forskare eller student kan kyla och inspektera flyger var som helst, eftersom denna "Cold pad" inte ansluta till någon pipe. Denna metod är inte bara säker för människor utan också för flugor, eftersom systemet fungerar vid temperaturer högre än-2 ° c. Flugor är lätt slås ut och förbli orörligt så länge de stannar på den kalla ytan och inte dödas. Flugorna återfå medvetandet snabbt när de återvänder till rumstemperatur. De som tillämpar denna metod kräver inte en utbildningsperiod, och det finns inga problem med överdriven eller otillräcklig anestesi koncentrationer. Dock bör försöksledaren ägna stor uppmärksamhet åt storleken på icepack, som små icepacks (t. ex. 400-500 mL, ca. 19 cm x 11 cm x 2,5 cm) är inte önskvärt för flyga kylning eftersom de sväller när de är frysta och det blir besvärligt att arbeta på ytorna.
Ett Flask format ägg uppsamlings bur utvecklades också för protokollet. Dra nytta av T-och F-proppar, stora mängder flugor till buren kan läggas till eller överföras utan att kräva immobilisering av flugorna i förväg. Det har visat sig att mikrovågvärmning är ett effektivt sätt att döda flugor för inspektion eller kassering. En mekanisk blyertspenna-baserade microdissection nål och borra-baserade ett städ verktyg utnyttjades också. Alla dessa verktyg är enkla och fungerar bra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A pair of pliers | |||
| Cordless drill driver | max speed: 500 rpm | ||
| Electric soldering iron | |||
| File | |||
| Funnel | diameter of disk<60mm | ||
| Ice box | |||
| Insect pins | |||
| Infrared thermometer | HCIYET HT-830 | ||
| Long cuff rubber gloves | |||
| Mechanical pencils | |||
| Medical gauze | |||
| Microcentrifuge tube | 100 ul | ||
| Microwave oven | |||
| Parafilm | |||
| Peri dish | internal diameter 60 mm | ||
| Pipette tips | 1 ml | ||
| Plastic film | |||
| Plastic Peri dish | Φ36 mm used to cover the empty vial | ||
| Point tweezers | |||
| Protective work gloves | |||
| Re-freezable hard icepacks | 26.5×14.5×2.5 cm or larger | ||
| Rubber air blower | |||
| Snap cutter | |||
| Soft drink bottle | 500 ml, internal diameter c.a. 65 mm | ||
| Sponge stopper | |||
| Stainless steel sponges | |||
| Tube brush | |||
| Vial | Φ34 mm × 90 mm |
References
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Ashburner, M., Roote, J. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 585-599 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2004).
- Ashburner, M., Thompson, J. The laboratory culture of Drosophila. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. 1-109 (1978).
- Ratterman, D. M. Eliminating ether by using ice for Drosophila labs. Tested Studies For Laboratory Teaching. O'Donnell, M. A. , 259-265 (2003).
- Culturing techniques for Drosophila . , Available from: https://www.ptbeach.com/cms/lib/NJ01000839/Centricity/Domain/113/ap%20biology%20Labs/Culturing%20techniques%20for%20Drosophila.pdf (2019).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. (2006).
- Artiss, T., Hughes, B. Taking the Headaches Out of Anesthetizing Drosophila: A Cheap & Easy Method of Constructing Carbon Dioxide Staging. The American Biology Teacher. 69 (8), e77-e80 (2007).
- Qu, W. -H., Zhu, T. -B., Yang, D. -X. A Modified Cooling Method and its Application in Drosophila Experiments. Journal Of Biological Education. 49 (3), 302-308 (2015).
- Egg-laying cages for drosophila. , Available from: https://www.kisker-biotech.com/frontoffice/product?produitId=0H-19-17 (2018).
- Roberts, D. B. Drosophila: a practical approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (1998).
- Tang, M., Peng, Q. -F., Yang, D. Two devices for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 45 (11), 49-50 (2010).
- Zhou, T. -y, Gan, J., Yang, D. Preparation of sponge plug and sponge plug based fly transferring device for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 46 (6), 49-50 (2011).
- Yang, D. Genetics laboratory investigation. , 3rd edn, Science Press. (2016).
- Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, (2018).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting Started: An Overview on Raising and Handling Drosophila. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Humana Press. (2008).
