Summary
Aquí se describe el uso de varias herramientas caseras para transferir, enfriar y matar drosophilaadulta, así como para limpiar viales de cultivo de vidrio y recoger huevos. Estas herramientas son fáciles de hacer y son bastante eficientes en el manejo de Drosophila.
Abstract
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es ampliamente utilizado tanto en la investigación biológica y la educación biológica. El manejo de moscas adultas es común pero difícil en la práctica, ya que las moscas adultas vuelan. Aquí se muestra cómo hacer algunas herramientas simples y rentables para abordar problemas difíciles en el manejo de Drosophila. Se hacen orificios en los tapónes de espuma y se insertan puntas o embudos de pipeta en los orificios. Las moscas entonces se mueven sólo en una dirección en el conjunto de punta/embudo de pipeta, lo que permite un control eficiente de la transferencia de Drosophila adulta dentro o fuera de un vial. Los protocolos existentes se han modificado para las moscas de anestetización fría enfriándose en hielo triturado y transfiriéndolas a una superficie fría y dura de la bolsa de hielo. La bolsa de hielo está cubierta con un pedazo de gasa médica que mantiene las moscas inmovilizadas del agua condensada cuando se examina bajo un estereomicroscopio. Las moscas son finalmente eutanasiadas para contar y clasificar o descartadas por microwaving. También se ha desarrollado una jaula en forma de botella para recoger huevos, así como un dispositivo de ahorro de mano de obra y un protocolo de acompañamiento para la limpieza de viales de cultivo de vidrio.
Introduction
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo ampliamente utilizado en la investigación biológica y la educación biológica para estudiar una amplia gama de temas1,2. Los problemas básicos de manejo de Drosophila son la transferencia de adultos de vial a vial e inmovilización de las moscas para que sean más fáciles de manejar, ya que todos los adultos (excepto algunos mutantes3,4) pueden volar.
Convencionalmente, un investigador transfiere moscas de un vial a otro sosteniendo dos viales boca a boca, tocando las moscas haciaabajo o permitiendo que las moscas vuelen hacia arriba en otro vial, luego separando y reenchufando ambos viales 4. Obviamente, esto requiere que la apertura de dos viales con el mismo diámetro, y es difícil controlar la cantidad de moscas transferidas. Mientras tanto, esto requiere manos rápidas para hacer el trabajo, y escapar de las moscas perdidas puede resultar en problemas para el laboratorio o el aula. Añadir moscas vírgenes adicionales o moscas macho a una cruz ya preparada es otra tarea rutinaria en los experimentos de Drosophila. Convencionalmente, las moscas deben ser inmovilizadas en el vial de cruz antes de la adición de moscas adicionales.
Drosophila adulta son anestesiadas rutinariamente por éter, CO2o escalofriante5. En comparación con la exposición al éter y el CO2, el enfriamiento es el agente más rentable para inmovilizar drosophila adulta y el menos dañino tanto para las moscas como para los investigadores (especialmente los jóvenes estudiantes)6,7. Sin embargo, el agua que se condensa continuamente en la superficie fría o la cámara humedece las moscas. Es difícil determinar los fenotipos de las moscas húmedas, y pueden dañarse fácilmente durante la manipulación8,9. Esto ha impedido que el método de enfriamiento sea más ampliamente aceptado.
Las herramientas para la transferencia de mosca y un método para el enfriamiento de vuelo se han descrito previamente10. Aquí, se reporta una técnica de anestesia escalofriante modificada que es segura, confiable y factible para los experimentos de Drosophila. También se describen en este artículo 1) métodos para matar adultos para contar, clasificar o desechar, 2) dispositivos y protocolos de ahorro de mano de obra para limpiar viales de cultivo de vidrio, y 3) una jaula simple para recoger huevos. Las herramientas de fácil diseño y rentables que se describen aquí se pueden utilizar para abordar los problemas difíciles de manejo de la mosca, y estos métodos han sido probados y han demostrado ser robustos, confiables y fáciles de manejar para investigadores experimentados y novatos.
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Protocol
1. Preparación de herramientas y accesorios
- Tapón de punta/embudo
- Obtener dos tapones de esponja (el diámetro de los tapones debe ser ligeramente mayor que el diámetro interno de los viales utilizados para transferir moscas). Haga un agujero en los centros de los tapones de esponja con un soldador eléctrico calentado.
- Obtenga dos puntas de pipeta de 1 ml, corte una por la mitad transversalmente con un cuchillo afilado y deseche el extremo puntiagudo. A continuación, corte 1,5 cm del extremo puntiagudo de la segunda punta de pipeta. Pegue los restos de las dos puntas de pipeta junto con un adhesivo multiusos para hacer una punta de pipeta alargada (Figura1A).
- Inserte un embudo y la punta alargada de la pipeta en los tapones de esponja para hacer un tapón de punta y embudo (en adelante denominados t- y F-stoppers) y tapar la punta de la pipeta con un tubo de microcentrífuga de 100 l (Figura 1A).
NOTA: La longitud del vástago del embudo debe ser mayor que la altura del enchufe. Si es más corto o igual que la altura del enchufe, las moscas escaparán de la abertura del vástago. El extremo del vástago del embudo debe estar situado al menos 2 cm por encima de la superficie del medio de cultivo o la parte inferior de un vial vacío. Son preferibles embudos pequeños (por ejemplo, diámetro del disco <60 mm) con pequeños diámetros internos de apertura del vástago (<5 mm). Se puede utilizar un embudo de vidrio o de plástico para hacer un F-stopper. Sin embargo, los embudos de plástico son preferibles para las clases de biología, ya que se rompen menos fácilmente que los embudos de vidrio.
- Agujas microdistveantes
- Obtenga lápices mecánicos que se sientan cómodos en la mano y los pasadores de insectos que coincidan con los diámetros (por ejemplo, 0,5 mm, 0,7 mm) de sus recargas de plomo.
- Corta los extremos anchos de los pasadores de insectos con un par de alicates y archiva el corte plano. Sustituya el cable por los pasadores (Figura1B). Pulse el botón de clic y alimente 0,5–1 cm de un pasador para realizar una disección. Limpie el pasador y empújelo completamente de nuevo en el eje del lápiz después de una actividad de disección para que sea seguro para cualquier persona.
NOTA: Las agujas microdissección son útiles no sólo en disecciones de órganos como las glándulas salivales larvales, sino también en el recuento y clasificación de moscas adultas muertas.
- Paquetes de hielo duros
- Obtenga varias compresas de hielo duro refreezables (las compresas de hielo de gran tamaño son preferibles). La Figura 1C muestra un paquete de hielo que funcionó bien, que mide 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm y tiene lados superior e inferior que son completamente planos.
- Corte la gasa médica (no estéril) en trozos ligeramente más pequeños que las superficies frías de las bolsas de hielo que cubren. Por ejemplo, una pieza de gasa médica ligeramente inferior a 26,5 cm x 14,5 cm es preferible cubrir una compresa de hielo que se muestra en la Figura 1C.
NOTA: Los accesorios necesarios para estas herramientas de refrigeración incluyen: una caja de hielo (utilizamos una caja de espuma de 25 cm x 15 cm x 15 cm para una persona y caja de 37 cm x 28 cm x 20 cm para más de una persona), que se utiliza para almacenar hielo triturado; un par de pinzas de punto fino, que se utilizan para agarrar moscas frías por sus alas y transferirlas a un vial; un par de guantes de trabajo de protección, que se utilizan para sacar las compresas de hielo refrigeradas de un congelador de -20 oC; y película de plástico, que se utiliza para cubrir el escenario de un estereomicroscopio.
- Jaula de recogida de huevos Drosophila
NOTA: Las jaulas de recolección de huevos Drosophila ya hechas están disponibles en muchas empresas de biotecnología11. Aquí se describe una pequeña jaula de colección de huevos en forma de botella de acrílico para platos Petri de 60 mm (Figura1D a la izquierda; el diseño de la jaula se muestra en el medio). Se puede adaptar para otros tamaños de plato Petri (por ejemplo, 100 mm, 35 mm). Esto permite la transferencia de moscas dentro o fuera de la jaula con facilidad. Una jaula simple se puede preparar de la siguiente manera.- Utilice un cortador de presión para cortar una botella de bebida de plástico suave (500 ml, diámetro interno aprox. 65 mm) en una proporción aproximada de 2:1 (extremo puntiagudo: extremo romo) y deseche el extremo romo.
- Envuelva una tira de papel de tarjeta alrededor de una placa de jugo de manzana (diámetro interno 60 mm) con cinta adhesiva [la placa de jugo de manzana se utiliza para recoger huevos (Figura1E,derecha)].
- Controlador de cepillo de tubo inalámbrico
- Obtenga un controlador de taladro inalámbrico (velocidad máxima a 500 rpm).
- Obtener un cepillo de tubo que tiene cerdas a lo largo de sus lados, así como su parte delantera. Idealmente, el diámetro del cepillo debe ser ligeramente mayor que el diámetro de los viales de cultivo que necesitan ser limpiados. Corte el extremo de su asa para que pueda insertarse en el portabrocas (Figura1D).
NOTA: Los accesorios necesarios para estas herramientas de limpieza incluyen esponjas de acero inoxidable y guantes de goma de manguito largo.
2. Transferencia de moscas adultas del vial A al vial B
NOTA: La transferencia de moscas adultas de un vial a otro es la práctica más común que se lleva a cabo en experimentos de Drosophila [por ejemplo, transferir moscas de la antigua cultura (A) al cultivo fresco (B) o de un vial cruzado (A) a un vial vacío (B)] para anestesia. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para cualquier actividad de transferencia de moscas adultas. A menos que se indique lo contrario, este protocolo se utiliza para transferir moscas del vial A al vial B a través de este papel.
- Compruebe cuidadosamente el tallo del embudo de un F-stopper y la punta de la pipeta de un t-stopper, luego despeje las moscas que permanezcan en los tapones con un soplador de aire de goma. Este paso es de suma importancia, especialmente cuando se utiliza un conjunto de T- y F-stoppers para la transferencia continua de diferentes líneas de Drosophila.
- Toque las moscas en el vial A y reemplace su enchufe con un T-stopper, luego enchufe el vial B con un F-stopper.
- Invierta el vial A sobre el vial B, inserte el extremo de la punta de la pipeta del tapón en la abertura del embudo del F-stopper, golpee el borde del vial invertido A para permitir que las moscas se deslicen fuera de la punta de la pipeta y a través del vástago del embudo, y caigan en el vial B. Si cualquier alimento viejo en el vial A se vuelve menos compacto, puede caer cuando el vial A se invierte y se golpea. En tal situación, invierta el vial B sobre el vial A y permita que las moscas se arrastren hasta el vial B.
- Separe el T-stopper del F-stopper. Tapar el extremo de la punta de la pipeta del T-stopper con un tubo de microcentrífuga de 200 l si las moscas restantes en el vial A necesitan ser transferidas a otros viales momentáneamente; de lo contrario, retire el T-stopper y vuelva a enchufar el vial A. Retire el F-stopper y vuelva a reconectar el vial B.
3. Inmovilizar moscas por enfriamiento
- Conservar las compresas de hielo refreezables en un congelador de -20 oC durante al menos 24 horas antes de su uso.
- Colocar una compresa de hielo fría y dura a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos. Humedezca ligeramente un pedazo de gasa médica no aséptica con un poco de agua corriente y deje que se adhiera estrechamente a la superficie de la bolsa de hielo. La gasa médica se puede reutilizar en el siguiente enfriamiento de mosca. Al mismo tiempo, enfríe un vial vacío en hielo triturado.
- Transfiera moscas adultas que necesitan ser inmovilizadas en el vial vacío refrigerado (CEV). Cuando los dos viales de transferencia estén separados, cubra el CEV con una placa Petri o un tapón y golpee el CEV contra el hielo triturado para tocar todas las moscas en el CEV hasta el fondo. Repita este proceso varias veces hasta que todas las moscas estén inmovilizadas. Las moscas serán inmovilizadas dentro de los 30 s. A continuación, coloque el CEV en el hielo durante 1 min. No es aconsejable transferir demasiadas moscas a la vez para anestesiar.
- Vierta las moscas frías sobre la gasa médica que cubre la bolsa de hielo. Extienda las moscas superpuestas con un pincel y asegúrese de que cada mosca pueda ser enfriada por la superficie fría de la bolsa de hielo. Si una empanada de hielo duro se hincha ligeramente, colóquela en una toalla y trabaje en su lado plano.
- Retire los clips del escenario del estereomicroscopio, cubra el escenario con un pedazo de película de plástico y coloque la compresa de hielo en el escenario. Encienda la luz superior (una fuente de luz fría es deseable), enfoque el estereomicroscopio y mueva la bolsa de hielo hasta que las moscas frías se puedan ver claramente.
4. Matar moscas adultas para contar, ordenar o descartar
- Transfiera las moscas adultas a un vial vacío y cúbralo con un plato de Petri.
- Invertir el vial, calentarlo durante 1 min + 20 s en un horno microondas, y dejar que las moscas muertas caigan en el plato Petri.
- Ponte guantes de trabajo de protección y saca el vial del microondas. Vierta las moscas muertas en una tarjeta de papel blanco, cuente o examine las moscas con una aguja microdissección bajo un estereomicroscopio, y deseche los cuerpos de mosca en un cubo de basura después de la observación.
- Para matar moscas no deseadas, calienta las moscas durante 2-3 minutos en un horno microondas, luego toca las carcasas en un cubo de basura.
NOTA: No es aconsejable matar algunas cepas mutantes de alas (por ejemplo, mutantes de longitud de ala) para su examen, ya que es difícil juzgar a partir de los cadáveres si las alas se extienden más allá de la punta del abdomen, que se ve en moscas de tipo salvaje.
5. Transferencia de moscas de entrada/salida de la jaula de recogida de huevos en forma de botella
NOTA: Como se mencionó anteriormente, los T- y F-stoppers se utilizan para transferir moscas dentro y fuera de la jaula de recolección de huevos. Las moscas no necesitan ser anestesiadas durante todo este proceso. Otros detalles, como la preparación del medio de jugo de manzana, la colección de huevos y la desconreorionización, se pueden encontrar en la literatura12.
- Inserte la jaula de recolección de huevos en el plato de jugo de manzana o monte la placa de jugo de manzana en la jaula hecha de una botella de refresco. Selle la articulación alrededor de los dos componentes con una tira de película de parafina.
- Coloque tantas moscas como sea posible en la jaula y vuelva a enchufar la jaula con un tapón de espuma después de transferir las moscas.
- Para cambiar la comida de las moscas en la jaula, transfiera las moscas de la jaula a un vial vacío.
- Vuelva a colocar la placa de jugo de manzana y vuelva a sellarla, luego transfiera las moscas del vial de vuelta a la jaula.
- Cuando termine la recolección de huevos, transfiera las moscas a un vial vacío y transfieralas a viales de cultivo.
6. Limpieza de viales de cultivo de vidrio
NOTA: Generalmente, un vial de cultivo antiguo contiene moscas vivas. En el protocolo descrito aquí, estas moscas NO necesitan ser asesinadas antes de la limpieza a menos que sean moscas transgénicas.
- Retire cualquier tinta marcadora permanente de los viales de cultivo de vidrio con esponjas húmedas de acero inoxidable.
-
Remoje los viales de cultivo en agua corriente.
- Llene un fregadero de laboratorio con agua, agregue jabón líquido para lavar platos en el agua y mezcle.
- Sumerja los viales de cultivo en el agua y, a continuación, retire el tapón, permitiendo que el agua corra hacia el vial. El detergente para platos en el agua hará que las moscas adultas restantes se hundan hasta el fondo y se ahoguen en el agua.
- Remoje los antiguos viales de cultivo en agua durante al menos 30 minutos.
- Afloje el portabrocas del taladro, inserte el cepillo del tubo de ensayo y vuelva a apretar el mandril. Compruebe la dirección del selector de rotación y asegúrese de que el taladro gire en el sentido de las agujas del reloj. Ajuste el gatillo de velocidad y asegúrese de que la velocidad máxima sea inferior a 500 rpm.
-
Limpie los viales de cultivo.
- Limpie los viales de cultivo aproximadamente.
- Coloque un guante de goma de manguito largo en la mano no dominante y sostenga el vial en el agua.
- Sostenga el controlador de cepillo de tubo inalámbrico con la mano dominante desnuda, apriete el cepillo en el vial de cultivo y apriete el gatillo.
NOTA: No sumerja la batería en el agua. El cepillo giratorio romperá los alimentos viejos, la pupa, etc., y eliminará más del 95% de los residuos. - Vierta los residuos en un cubo de basura separado. Repita este proceso hasta que se haya limpiado la mayor parte de los residuos de cada vial.
- Limpie bien los viales de cultivo.
- Limpie el cepillo del tubo, drene y limpie el fregadero, y rellénelo con agua limpia.
- Retire los residuos restantes de cada vial de cultivo como se describe en la sección 6.4.1.
- Limpie los viales de cultivo aproximadamente.
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Representative Results
Los T- y F-stoppers fueron desarrollados como un conjunto de herramientas simples que se pueden adaptar y utilizar en cualquier actividad de transferencia de moscas. Transferir moscas de una cultura antigua a varios cultivos frescos implica quitar los tapones de los viales frescos, reemplazarlos con F-stoppers, luego derribar las moscas en el vial viejo, quitar rápidamente su enchufe y reemplazarlo con un T-stopper. Si el alimento viejo es compacto, entonces es importante voltear el vial viejo e insertar la punta del T-stopper en la abertura de un F-stopper, luego toque las moscas hacia abajo en el vial fresco. A continuación, se realiza la sustitución de los tapónes T y F y la reconexión de los viales. Si el alimento viejo se vuelve menos compacto, se recomienda voltear el vial fresco, montar el F-stopper en el T-stopper, y permitir que las moscas se arrastren hasta el vial fresco.
Para añadir moscas adicionales a una cruz ya preparada, es importante tocar las moscas en el vial de cruz hacia abajo y reemplazar su enchufe con un F-stopper. A continuación, el experimentador debe examinar las moscas frías bajo un estereomicroscopio, recoger una mosca deseada por su ala utilizando un par de pinzas puntiagudas, y permitir que se deslice en el vial de cruz a través del tallo del embudo. Si una mosca está atrapada en el tallo de un embudo, se recomienda soplar suavemente sobre él con un soplador de aire y dejar que se deslice en el vial. Se requiere reemplazar el F-stopper y volver a enchufar el vial cuando se hayan recogido suficientes moscas para una cruz. Los T- y F-stoppers se introdujeron en 201013,14; hasta el momento, más de 1.200 estudiantes se han beneficiado de estos dispositivos de transferencia de moscas. T- y F-stoppers también se han introducido a los instructores e investigadores a través de una guía de laboratorio15, que se ha adoptado para su uso en laboratorios de enseñanza e investigación.
Los métodos de anestesia por frío existentes se han modificado para su uso en este estudio. Las mezclas de hielo triturado o hielo y agua se utilizan para enfriar las moscas adultas y luego transferir las moscas inmovilizadas a la superficie fría de una bolsa de hielo cubierta con un pedazo de gasa médica no estéril. Las fibras de gasa absorben el agua condensada y mantienen las moscas secas cuando se examinan. Al mismo tiempo, los pequeños agujeros entre los hilos warp/weft permiten a las moscas tocar la superficie fría de la compresa de hielo y mantenerlas inmóviles (Figura2). A una temperatura ambiente de 25oC, la temperatura de la superficie de una empanada fría y dura aumenta drásticamente de -19 oC a -2 oC en un plazo de 20 minutos y alcanza una meseta que es segura tanto para las moscas viejas como para las recién nacidas (Figura3). Una empaque de hielo funciona bastante bien dentro de la meseta, y las moscas frías recuperan la conciencia a temperatura ambiente dentro de los 30 s. Debido a que una empaque de hielo duro es delgado, entonces se puede colocar bajo un estereomicroscopio para examinar las moscas. La bolsa de hielo dura descrita aquí cuesta menos de $2; además, se han utilizado 60 paquetes de hielo duros para una clase de 100-150 estudiantes cada semestre, y son reutilizables durante muchos años. Esta versión modificada de la técnica de anestesia escalofriante fue introducida en una clase de genética específica hace tres años, y su robustez ha sido probada por más de 300 estudiantes y aquellos de otras universidades.
Se ha encontrado que la calefacción dieléctrica por microondas es un agente más rápido y conveniente para matar moscas adultas (si ya no son necesarias después de la observación) en comparación con agentes como el sobreétere o la congelación profunda (Tabla1). La calefacción dieléctrica por microondas requiere un tiempo mucho más corto para matar moscas que el sobreétere o la congelación profunda. Todas las moscas mueren dentro de los 80 s, por lo que contar y clasificar un gran lote de moscas dentro de un corto período de tiempo es factible16. Suponiendo que el experimentador necesita matar moscas 20veces para contar y ordenar lotes para un experimento, tomará 3 h + 20 min y 5 h para matar a las moscas por sobreétere y congelación profunda, respectivamente; sin embargo, sólo se necesitan 27 minutos utilizando un microondas.
Al igual que las moscas sobreeterizadas, las moscas microondas extienden las alas en ángulo recto desde los cuerpos. Generalmente, las canales de mosca muertas por microwaving eran significativamente más ligeras que las que mataban por el éter o el enfriamiento, pero el calor no distorsiona la forma del cuerpo, y las carcasas no se vuelven nítidas o turgidas. Las características (por ejemplo, el color del cuerpo, el color de los ojos y la forma de las alas) de las moscas microondas son similares a las que mueren por el éter o la congelación (Figura4), y no hay diferencias significativas en el tamaño de las alas (área, longitud, anchura) de las moscas asesinadas por los tres agentes ( Tabla 1). Por lo tanto, las canales de moscas muertas por el microwaving se pueden utilizar para contar, clasificar y medir algunos rasgos, como el tamaño de las alas. Calefacción por microondas también es un buen método para matar moscas no deseadas y deshacerse de ellos de manera oportuna. Además, las morgues volantes (botellas que contienen soluciones inflamables de etanol, metanol o jabón), que se utilizan para almacenar moscas muertas o desechadas, ya no son necesarias en laboratorios de moscas o clasesdebiología 3.
Para este protocolo se diseñó una pequeña jaula de recogida de huevos en forma de botella. Usando T- y F-stoppers, un gran número de moscas se pueden transferir dentro o fuera de la jaula, y las placas medianas de jugo de manzana se pueden cambiar con mayor facilidad. Finalmente, las moscas no necesitan anestesia antes y después de la recolección de huevos.
Un controlador de cepillo de tubo inalámbrico y protocolo para el uso de este equipo para limpiar viales de cultivo también fue desarrollado para el protocolo. Este cepillo de tubo alimentado por batería puede descomponer fácilmente alimentos viejos y pupupa unido a un vial de cultivo de vidrio, un vial se puede limpiar dentro de 30 s, y la eficiencia de la limpieza se incrementa en gran medida; por lo tanto, la limpieza de grandes cantidades de viales de cultivo de vidrio ya no es una tarea tediosa.
Figura 1: Herramientas utilizadas en el manejo de Drosophila. (A) Se muestran las herramientas de transferencia de moscas y los accesorios necesarios. Son (de izquierda a derecha) un soplador de aire (utilizado para soplar moscas adultas que quedan en el vástago del embudo); T- y F-stoppers (insertados en viales); y un vial vacío cubierto con un plato Petri (36 mm, la mitad inferior de un plato Petri de 40 mm). Los tapónes de espuma son más grandes que las aberturas de los viales por lo que se pueden utilizar con viales de tamaños de apertura variables. El tamaño descrito aquí se puede cambiar si es necesario. (B) Se muestran los materiales necesarios para las agujas de microdisección. (C) Se muestra la empaque de hielo duro utilizado para enfriar las moscas. (D) Se muestra la jaula de recogida de huevos en forma de botella (izquierda), su plan de diseño (medio), y una jaula de recolección de huevos simple hecha de una botella de refresco (derecha) (E) Se muestran los materiales necesarios para el controlador de cepillo de tubo inalámbrico. El cepillo redondo de color blanco que se puede montar en el controlador de perforación se utiliza para limpiar los platos DeLica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Moscas frías en la superficie fría de una bolsa de hielo. El agua condensadora es absorbida por la gasa médica, y las moscas frías se mantienen secas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Variación de la temperatura de la superficie de la compresa de hielo con el tiempo. Los datos se recogieron de cinco empaques de hielo duros, y las temperaturas se midieron en dos lugares en el centro de una compresa de hielo con un termómetro infrarrojo a una RT de 25 oC y una humedad relativa del 29%. La temperatura del congelador fue de -24,5 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de cadáveres de mosca sin microoniques con los muertos por éter etílico y congelación profunda. Cuando los cadáveres de mosca muertos por microwaving fueron examinados bajo un estereomicroscopio, no se encontraron quemacas ni distorsiones en los cuerpos, y no se encontraron diferencias notables en el color del cuerpo, el color de los ojos y la forma de las alas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Agente asesinob | Tiempo utilizado para matar moscas | Peso (mg/30 moscas) | Ala (mm o mm2)d | ||||||
| Mujer | masculino | Mujer | masculino | ||||||
| Areans | Longitudns | Anchons | Areans | Longitudns | Anchons | ||||
| Calor | 1 min 20 s | 36,60 a 0,00 aA c | 22,65 x 0,95 a A | 1,51 x 0,16 | 2,30 x 0,12 | 0,92 x 0,05 | 1,20 x 0,09 | 2,06 x 0,08 | 0,83 x 0,03 |
| Frío | 15 min | 41,20 x 0,10 b B | 25,70 x 1,00 ab A | 1,57 x 0,15 | 2,37-0,12 | 0,94 x 0,05 | 1,23 x 0,12 | 2,07 x 0,10 | 0,84 x 0,05 |
| Éter | 10 min | 43,35 x 0,85 b B | 26,9 x 0,70 b A | 1,57 x 0,16 | 2,36 x 0,11 | 0,94 x 0,05 | 1,18 x 0,10 | 2,05 x 0,10 | 0,83 x 0,04 |
| a Los adultos Drosophila son salvajes tipo Drosophila melanogaster. Se capturan en Beijing, China y se mantienen en mi laboratorio durante más de 5 años, y se mantienen a 25 oC en medio de harina de maíz. | |||||||||
| b Los equipos utilizados son calor: horno microondas de 1.300 W; frío: frigorífico (-30 oC); éter: 2 ml de éter, y el tamaño interior del etherizer es de 170 ml. | |||||||||
| c Dentro de cada columna, los medios seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes por la Prueba de Rango Múltiple de Duncan, las letras minúsculas/mayúsculas indican p - 0.05/0.01 | |||||||||
| d Las moscas se seleccionan aleatoriamente del mismo vial de cultivo. Veinte alas derechas del mismo sexo fueron recogidas de las moscas muertas por el mismo agente y se mantuvieron dos replicaciones. Se tomaron fotografías digitales de cada alas y se midió el tamaño de las alas utilizando el software ImagePro Plus | |||||||||
| ns: No significativo en p á 0,05 | |||||||||
Tabla 1: Los efectos de los tres agentes asesinos en los pesos de la canal y el tamaño de las alas de la Drosophila adulta.
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Discussion
Algunas herramientas caseras para manejar las actividades básicas involucradas en la cría y experimentación de Drosophila se describen en este artículo. Estas herramientas son simples pero bastante efectivas. Prácticamente, cualquier laboratorio puede hacer estas herramientas con facilidad, y una investigación o un laboratorio de enseñanza no necesita encontrar una alternativa ya hecha que tal vez no esté disponible localmente.
La transferencia de moscas es la práctica más común y una tarea difícil en los experimentos de Drosophila. Desafortunadamente, hasta ahora, no se han descrito herramientas de transferencia3,4,12,17 Aquí, T- y F-stoppers se describen. Estas sencillas herramientas hacen que la transferencia de las moscas sea mucho más fácil y controlable, y menos moscas escapan durante la transferencia, como lo demuestra el hecho de que pocas moscas perdidas se han encontrado en las clases de genética en los últimos años. Como el tapón de esponja es elástico, no requiere que la abertura de los viales tenga el mismo diámetro interior. Además, sólo se permite que una mosca pase a través de la abertura de la punta de la pipeta a la vez; por lo tanto, los T-stoppers evitan que las moscas salimenten en un vial, y el experimentador puede detener fácilmente el proceso y controlar el número de moscas transferidas. Los T-stoppers también pueden evitar que los alimentos viejos caigan en un vial fresco. Los T- y F-stoppers son fáciles de hacer y usar, e incluso un manejador inexperto puede completar transferencias de mosca rápida y fácilmente.
Los F-stoppers se utilizan para guiar a las moscas en un vial nuevo. Las moscas adultas tienden a asociarse bajo el tapón y no escapan del tallo del embudo. Esto hace que un poco de trabajo sea más fácil y más controlable (por ejemplo, transferir moscas de un vial a otro o agregar moscas vírgenes adicionales o moscas macho a una cruz preparada). Se ha encontrado que cuando un vial se coloca en el laboratorio durante bastante tiempo (por ejemplo, 1 h), sólo muy pocas moscas escaparán del tallo del embudo.
En este artículo, se describe un método de enfriamiento factible para inmovilizar moscas. Este método es una gran alternativa al éter y CO2 y se puede utilizar en laboratorios de investigación y enseñanza. Este método es particularmente amigable con un laboratorio de enseñanza, ya que un instructor no necesita estar tan preocupado por los posibles riesgos para la salud de los estudiantes o hacer grandes esfuerzos para construir un área de ensayo costosa en un laboratorio de enseñanza lleno de gente. Este método es rentable, ya que las bolsas de hielo son baratas y reutilizables. Un investigador o estudiante puede enfriar e inspeccionar moscas en cualquier lugar, ya que esta "almohadilla fría" no se conecta a ninguna tubería. Este método no sólo es seguro para las personas, sino también para las moscas, ya que el sistema funciona a temperaturas superiores a -2 oC. Las moscas son ligeramente noqueadas y permanecen inmóviles mientras permanezcan en la superficie fría y no mueran. Las moscas recuperan la conciencia rápidamente una vez que regresan a la temperatura ambiente. Aquellos que aplican este método no requieren un período de entrenamiento, y no hay preocupaciones con concentraciones de anestesia excesivas o inadecuadas. Sin embargo, los experimentadores deben prestar mucha atención al tamaño de la bolsa de hielo, ya que las empaques de hielo de pequeño tamaño (por ejemplo, 400-500 ml, aprox. 19 cm x 11 cm x 2,5 cm) no son deseables para el enfriamiento de mosca, ya que se hinchan cuando se congelan y se vuelve incómodo trabajar en las superficies.
También se desarrolló una jaula de recogida de huevos en forma de botella para el protocolo. Aprovechando los T- y F-stoppers, grandes cantidades de moscas a la jaula se pueden agregar o transferir sin necesidad de inmovilización de las moscas de antemano. Se ha encontrado que la calefacción por microondas es una manera eficiente de matar moscas para inspección o descarte. También se utilizó una aguja de microdisección mecánica a base de lápiz y una herramienta de limpieza basada en taladro. Todas estas herramientas son simples y funcionan bien.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A pair of pliers | |||
| Cordless drill driver | max speed: 500 rpm | ||
| Electric soldering iron | |||
| File | |||
| Funnel | diameter of disk<60mm | ||
| Ice box | |||
| Insect pins | |||
| Infrared thermometer | HCIYET HT-830 | ||
| Long cuff rubber gloves | |||
| Mechanical pencils | |||
| Medical gauze | |||
| Microcentrifuge tube | 100 ul | ||
| Microwave oven | |||
| Parafilm | |||
| Peri dish | internal diameter 60 mm | ||
| Pipette tips | 1 ml | ||
| Plastic film | |||
| Plastic Peri dish | Φ36 mm used to cover the empty vial | ||
| Point tweezers | |||
| Protective work gloves | |||
| Re-freezable hard icepacks | 26.5×14.5×2.5 cm or larger | ||
| Rubber air blower | |||
| Snap cutter | |||
| Soft drink bottle | 500 ml, internal diameter c.a. 65 mm | ||
| Sponge stopper | |||
| Stainless steel sponges | |||
| Tube brush | |||
| Vial | Φ34 mm × 90 mm |
References
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