Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий обтекаемый метод эффективного поколения плазмидов, выражающей как фермент CRISPR, так и связанные с ним одногидные РНК (sgRNAs). Ко-трансфекции клеток млекопитающих с этим вектором sgRNA/CRISPR и двойной вектор люциферазы репортер, который рассматривает двойной прядь перерыв ремонт позволяет оценку эффективности нокаута.
Abstract
Несмотря на высокую эффективность, модификация геномного участка ферментом CRISPR требует заранее генерации sgRNA, уникальной для целевого участка. В этой работе описаны ключевые шаги, ведущие к строительству эффективных векторов sgRNA с использованием стратегии, которая позволяет эффективно обнаруживать положительные колонии ПЦР до секвенирования ДНК. Поскольку эффективное редактирование генома с использованием системы CRISPR требует высокоэффективной sgRNA, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо, чтобы сэкономить время и усилия. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута путем изучения двойной пряди перерыва ремонт через одну прядь annealing. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы подобрать предпочтительную цель xCas9/sgRNA от векторов кандидата sgRNA для конкретного редактирования генов. Протокол, изложенный обеспечит предпочтительный вектор фермента sgRNA/CRISPR в течение 10 дней (начиная с надлежащим образом разработанных олигонуклеотидов).
Introduction
SgRNAs CRISPR состоит из 20-нуклеотидной последовательности (протопространственника), которая дополняет геномную целевуюпоследовательность 1,2. Несмотря на высокую эффективность, способность системы CRISPR/Cas изменять данный геномный сайт требует генерации вектора, несущего эффективную sgRNA, уникальную для целевого сайта(ы) 2. В настоящем документе описаны ключевые шаги в генерации этого вектора sgRNA.
Для успешного редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas использование высокоэффективных sgRNAs является важнейшимусловием 3,4,5. Так как инженерии нуклеазы, используемые в редактировании генома проявляется разнообразная эффективность на различных целевыхлокусов 1, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо для того, чтобысэкономить время и усилия 6,7,8,9. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута, изучая двойной пряди перерыв ремонт через одну прядь annealing3,10. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы выбрать предпочтительную цель CRISPR sgRNA из различных векторов sgRNA кандидата, предназначенных для конкретного редактирования генов. Протокол, заявленный здесь, был реализован в нашей группе и сотрудничающих лабораториях в течение последних нескольких лет для создания и оценки CRISPR sgRNAs.
Следующий протокол подводит итоги, как разработать подходящую sgRNA через сетевое программное обеспечение. После выбора подходящих sgRNAs мы описываем различные шаги для получения необходимых олигонуклеотидов, а также подход к вставке парных олигонуклеотидов в вектор выражения pX330-xCas9. Мы также представляем метод для сборки sgRNA-экспрессии и двойной люциферазы репортер векторов на основе перевязки этих последовательностей в препереваренный вектор выражения (шаги 2-10, рисунок 1A). Наконец, мы описываем, как проанализировать эффективность сокращения ДНК для каждого из sgRNAs (шаги 11-12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. конструкция sgRNA oligonucleotide
- Дизайн sgRNAs с помощью онлайн-инструментов, таких как Cas-Designer онлайн инструмент (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Последовательность PAM важна на основе используемого Cas9. Для xCas9, соответствующие последовательности PAM являются NG и бывший упомянутый Cas-Designer онлайн инструмент может генерировать xCas9 соответствующих sgRNAs.
- Используйте инструменты проектирования sgRNA, которые охватывают алгоритмы для прогнозирования на и вне цели (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. Предпочтительнее оценка 0,2 или больше.
- Выберите до 3 целей редактирования генов для оптимального скрининга (например, T1, T2 и T3 были разработаны для овец DKK2 exon 1 ген ориентации -Таблица 1).
2. Модификация олигонуклеотида
- Чтобы модифицировать sgRNA oligonucleotide, удалите 3'-NG протопространственный смежный мотив (PAM), сохраняя последовательность протопространственника (например, начальная последовательность для T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC (20 nt).
- Добавьте пентануклеотид CACCG к 5'-конец олиго.
ПРИМЕЧАНИЕ: После перевязки на скелет pX330-xCas9, эта последовательность будет содержать 3'-конец U6 промоутер мотивации sgRNA транскрипции. Массив "CACC" гарантирует, что олиго соответствует свесам bbsI-перевариваемой плазмиды pX330-xCas9. Базовая "G" является обязательным условием промоутеров РНК-полимеразы III и гарантирует эффективный запуск транскрипции sgRNA (например, приложение массива 5'-CACCG к протопространству T1, достижение T1-F: CACCGTGCCTCTCTACTGGCCGC (25 nt). Эффективность расщепления 21 nt gRNA значительно отличается от 20 nt gRNA1,12,13,14. Как правило, рекомендуется использовать 20 nt с 5'-G, генерируя более короткий протопространитель, если это невозможно, то 21 nt с дополнительными 5'-G могут быть использованы. - Создайте обратный комплект (rc) последовательности протопространственного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, rc протопространца T1 является GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Прим. AAAC к 5'-конец последовательности rc protospacer. Примыкать дополнительный C к 3'-конец rc protospacer.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность "AAAC" гарантирует, что олигонуклеотид подходит для клонирования в bbsI-переваривается pX330-xCas9 плазмида. Дополнительные "C" на 3'-конец имеет важное значение для annealing с инициированием "G" для транскрипции sgRNA описано выше (например, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC (25 nt) является окончательным oligonucleotide последовательность для T1 rc протопространственник). - Закажите олигонуклеотиды.
3. Олигонуклеотид аннеалирование
- Разбавить лиофилизированные олигонуклеотиды до конечной концентрации 10 МКМ в двойной дистиллированной воде (ddH2O).
- Смешайте вперед и обратное олигонуклеотидов в тонкой стенке ПЦР трубки maintaning 1:1 соотношение (например, 20 йл каждый) без добавления каких-либо дополнительных буфера.
- Инкубировать смесь при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем рампы вниз температуры до 72 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Следуйте с периодом охлаждения при комнатной температуре (RT), состоящий из простого удаления образца из машины ПЦР и размещения его на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно фосфорилировать олигонуклеотидные смеси для облегчения перевязки.
4. переваривание вектора sgRNA/CRISPR
- Дайджест 1 мкг выбранного вектора pX330-xCas9 с bbsI (10 единиц фермента на 1 мкг плазмиды) для 2 ч при 37 градусах Цельсия(рисунок 2). Проведи пищеварение вектора экспрессии pX330-xCas9 в общем объеме 50 МКЛ, содержащего 5 МКЛ буфера пищеварения 10x и дистиллированной воды для достижения конечного объема.
- Очистить переваренный вектор путем извлечения полосы из 2% агарозного геля под 10 В/см и впоследствии очистить с помощью колонки кремнезема с помощью коммерческого комплекта извлечения геля.
5. Перевязка аннальных олигонуклеотидов sgRNA к вектору выражения
- Смешайте анналированную sgRNA олигонуклеотиды (5 мкл смеси из шага 4) с bbsI-усваиваемым вектором pX330-xCas9 (очищенный, 100 нг).
- Добавьте 1 мл лигазы и 1 йл буфера 10x лигазы.
- Добавьте дистиллированную воду с соответствующим объемом, до 10 мл.
- Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.
6. Компетентная трансформация клеток
- Вывихит из хранилища компетентные клетки E. coli DH5 и оттаивать их на льду при -80 градусов по Цельсию.
- Добавьте 5 мкл перевязки смеси до 50 мкл компетентной кишечной палочки DH5 и держите смесь на льду в течение 30 мин.
- Тепло удар смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 90 с.
- Отдых на льду в течение 2 мин.
- Восстановите культуру на роторном шейкере в 500 МКЛ ЛГ-медиа на 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Плита 200 МКЛ культуры на ампициллин сопротивление LB агарозной пластины и инкубировать его на ночь при 37 градусов по Цельсию.
7. Определение правильной рекомбинантной плазмиды ПЦР
- Выберите от 5 до 10 бактериальных колоний из пластины LB и используйте каждую из них, чтобы привить одну трубку 1,5 мл, содержащую 1 мл ЛБ-медиа с 60 мг/мл ампициллина.
- Инкубировать трубки на роторный шейкер в течение 2-3 ч.
- Провести обнаружение правильных рекомбинантных плазмидов с помощью конкретных праймер пар для sgRNA oligonucleotides , например, впередгрунтовкидля T1 sgRNA экспрессии векторной конструкции (T1-F): CACCGTGCGCTCCTACTGGGGCCGC, обратный грунт (BbsI-R): AAAGTCCATTGGTTAC
- Подготовка смеси ПЦР(таблица 2).
- Используйте следующие условия езды на велосипеде ПЦР: 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут для недоношенных; 30 циклов по 95 градусов по Цельсию для денатурации, 60 градусов по Цельсию для аннеаляции и 72 градуса по Цельсию для расширения. После завершения 30 циклов выполните заключительный шаг расширения, нагревая в течение 5 минут при 72 градусах Цельсия.
- Вы запустите продукт ПЦР на 2% агарозный гель под 10 В/см. Группа нужного размера (например, 287 б.п.) считается положительной.
8. Проверить последовательность плазмидной экспрессии sgRNA
- Проверить последовательность положительных колоний ПЦР с помощью последовательности Sanger15 с помощью обратного грунтовки BbsI-R(см. шаг 7.3). Это грунтовка anneals на сайте вниз по течению от sgRNA олиго вставки. Был построен pX330-xCas9-T1, выражаюющий последовательность sgRNA, содержащую протопространство TGCCTGCTCCTACTGGGCGG и xCas9.
- Используйте перемотка вперед T1-F для последовательности положительных колоний. Передняя не смогла дать полную информацию последовательности для места окружая место вставки олиго sgRNA, потому что 30-50 bp фрагмент следуя за грунтовкой последовательности не смогли точно быть прочитаны вне.
9. Строительство двойного вектора репортер люциферазы
- Синтезировать 300-500 bp фрагменты ДНК, содержащие цели sgRNA и субклон его в двойной вектор люциферазы репортера через двойное пищеварение , например, субклон 440 bp овец DKK2 exon1 фрагмент в pSSA-Dual плазмида16,17 с помощью двойного пищеварения с AscI и SalI, в результате ПССА-Дуал-DKK2.
- Синтезировать 300-500 bp фрагментов ДНК, содержащих цели sgRNA. Обратите внимание, что последовательности фрагментов ДНК должны быть частями геномных последовательностей, которые могут быть получены с веб-сайта NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) или связанных с ними ссылок.
- Выберите подходящий двойной вектор люциферазы репортер, таких как pSSA-Dual16,17 (или два вектора, выражают светлячок люцифераза и ренилла люцифераза соответственно), а затем переварить этот вектор ифрагменты ДНК, оказано выше, с двумя эндонуклеазами, такими как AscI и SalI.
- Наконец ligate эти два фрагмента с T4 ДНК Ligase, в результате чего pSSA-двойной цели. Подробная информация о двойном пищеварении и перевязки отображается в таблице 3 и таблице 4соответственно. Стоит отметить, что вектор репортеров следует усиливать при стабильных штаммах бактерий (таких как Top10), которые рекомендуется культурировать с меньшей скоростью вращения (обычно не более 200 об/мин), чтобы избежать рекомбинации ДНК.
10. Трансфекция клеток
- Экстракт эндотоксин-свободных плазмидов для векторов, заявленных выше. Оцените чистоту и концентрацию плазмидов с помощью подходящих инструментов. Для этих плазмидов рекомендуется окончательная концентрация не менее 500 нг/йл и соотношение чистоты 1,7-1,9 при поглощении 260/280 нм (A260/A280).
- Со-трансфект соответствующей клеточной линии, такие как PIEC18 с плазмидами в равной пропорции (например, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2-1:1, 0,5 мкг плазмида для каждого дублирования при использовании 24 пластины хорошо). Используйте пустой вектор, такой как pX330-xCas9 в качестве отрицательного контроля.
- За день до трансфекции, пластины клеток в 24-хорошо культуры пластины при плотности 2 х 105 клеток / хорошо. Клетки будут готовы к трансфекции, когда они достигнут слияния 60-80%.
- Перед точкой времени трансфекции удалите супернатант как можно больше и аккуратно добавьте 0,5 мл свежих средств массовой информации для каждой хорошо.
- Разбавить трансфектный реагент в DMEM-средствах при соотношении 1:25 и хорошо перемешать.
- Подготовьте мастер-микс ДНК, разбавляя 0,5 мкг ДНК в 25 МКЛ DMEM-медиа, а затем добавьте 1 МКЛ реагента P3000.
- Добавьте разбавленную ДНК в каждую трубку разбавленного трансфектного реагента (1:1).
- Инкубация в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
- Добавьте к клеткам 50 МКЛ ДНК-липидного комплекса.
- Инкубационые клетки в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия. Затем проанализируйте трансфицированные клетки, как в шаге 11.
11. Обнаружение двойной люциферазы
- Подготовьте достаточное количество 1x пассивного буфера лиза (PLB), добавив 1 том 5x PLB до 4 томов дистиллированной воды и хорошо перемешать.
- Пассивныйлиз клеток, выученных в 24-колодец культурных пластин.
- Удалите среду роста из культурных клеток и аккуратно нанесите достаточный объем фосфатного буферного солевого раствора (PBS) для мытья поверхности культурного сосуда. Закружить сосуд кратко, чтобы удалить отдельные клетки и остаточной среды роста. Полностью удалите раствор полоскания перед нанесением реагента PLB.
- Выпределите 100 МКЛ 1x PLB в каждую культуру хорошо, чтобы полностью покрыть монослой клетки. Пусть культурные тарелки стоят 20 минут.
- Перенесите лисат в трубку или флакон для дальнейшей обработки или хранения.
- Подготовка люциферазы анализ реагента (LAR) путем повторного анализа при условии лиофилизированных люциферазы анализ субстрата в 10 мл поставляемого буфера анализа люциферазы.
- Подготовьте достаточный объем для выполнения желаемого количества анализов репортеров с двойным люциферазой (100 реагентов в соответствии с анализом). Добавьте 1 том 50-х стоп-субстрата к 50 томам стоп-буфера в стеклянной или силиконовой полипропилеевой трубке.
- Двойная люцифераза репортер (DLR) анализ
- Программные люминометры для обеспечения 2-секундной предварительной задержки чтения, а затем 10-секундный период измерения.
- Предрасполагает 100 Л люциферазы анализ реагента в соответствующее количество люминометровых трубок для завершения желаемого количества DLR анализов.
- Тщательно перенесите до 20 МКЛ лизоляции клеток в люминометровую трубку, содержащую LAR; смешать с помощью пипетки 2 или 3 раза. Поместите трубку в люминометр и инициировать чтение.
- Удалите образец трубки из люминометра, добавьте 100 МКЛ стоп-реагента и вихрь кратко перемешать. Замените образец в люминометре и инициируют чтение.
- Запись ренилла люцифераза активность нормализовалась к активности светлячка люциферазы, а именно взаимное соотношение отображается на экране.
- Отбросьте реакционной трубки, и перейти к следующему анализу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методы, изложенные в этом протоколе, для строительства векторов экспрессии sgRNA и xCas9, а затем для оптимизации скрининга sgRNA oligos с относительно более высокой эффективностью таргетинга генов. Здесь мы помечим репрезентативный пример 3 целей sgRNA для овец DKK2 exon 1. SgRNA и xCas9 выражая векторы могут быть построены путем predigesting вектор позвоночника (Рисунок 2), а затем лигатирование его в серии коротких двухструнные фрагменты ДНК через annealing олиго пар. Положительные колонии могут быть обнаружены с помощью конкретных праймер пар руководствоваться ПЦР (Рисунок 3). Фрагмент ДНК 440 bp от овец DKK2 exon 1 был субклонен в pSSA-Dualплазмиду 15 с помощью двойного пищеварения с AscI и SalI, в результате чего pSSA-Dual-DKK2. Возможности таргетинга генов pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 и pX330-xCas9-T3 были одновременно обнаружены(рисунок 5), а затем последний вектор sgRNA был определен как относительно лучший, который мы подбираем для исследования редактирования генов овец на следующем этапе.
Этот метод обнаружения сочетает в себе один механизм анеаляции нитей (SSA)(рисунок 1B и рисунок 4) с геном отчета люциферазы для мониторинга эффективности резки ДНК. Как показано на рисунке 4, SSA это процесс, начатый, когда двойной разрыв нити делается между двумя повторными последовательностями, ориентированными в одном направлении. Области одной нити создаются рядом с перерывами, которые распространяются на повторяющиеся последовательности, так что дополнительные нити могут anneal друг к другу. Этот annealing промежуточных могут быть обработаны путем переваривания от одного мель хвосты и заполнения пробелов. Двойной Люцифераза Репортер гена в основном включает в себя гены люциферазы от светлячка Photinus pyralis и от Renilla reniformis (также известный как морская анютина). Деятельность светлячков и реильных люцифераз измеряется последовательно из одного образца. Когда область распознавания, которая имеет прекращение кодона не вырезать в его середине, ген в системе SSA блокируется и не может быть переведен в функциональный белок. Когда обработка происходит, система SSA будет сливать гомологичную последовательность автоматически, и перекрывающиеся последовательности становятся одной последовательностью, ген получает рекомбинации отремонтированы, а затем может быть прочитана на протяжении производства функционального белка.
Рисунок 1: Схематическое представление различных этапов процесса клонирования.
(A) Схема построения вектора sgRNA, адаптированная из протоколов лаборатории Фэн Чжан. ( B )Схемадвойного люцифераза репортер векторного строительства (выбрать вектор pSSA-DKK2 в качестве примера), фрагменты ДНК Rluc-, Rluc-2 и Rluc-3 представляют собой три части полнометражной последовательности кодирования Ренилла люциферазы. MCS представляет собой "место многократного клонирования". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Predigesting вектор позвоночника pX330-xCas9 с BbsI.
1: ДНК маркер, 2: pX330-xCas9 плазмид, 3: pX330-xCas9 плазмид усваивается с BbsI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Конкретные праймер пары руководствоваться ПЦР для DKK2-T1 sgRNA вектор обнаружения.
Переулки 1-7 указывают ПЦР полосы для 7 различных колоний бактерий отдельно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схема для одной пряди annealing (SSA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Двойная люцифераза анализа с репортером вектор pSSA-DKK2 в клеточной линии PIEC.
Деятельность Ranilla luciferase luciferase значительно индуцирована (P'lt;0.01, Студенческий т тест) в PIEC путем перепредставления pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 или pX330-xCas9-T3 с изменением кратности 3,15, 5,84 или 13,10, соответственно. Бары ошибок указывают на стандартные отклонения (SD)(n-3) для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя | Цели геномной ДНК (5'-3') | sgRNA Олигос (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGTCCTCTCTGGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGCTCTCTCTGGGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCGCGGGC | ||||
Таблица 1: sgRNA цели и oligos предназначен для редактирования генов овец DKK2.
| Компонент ПЦР | Реакция 25 йл |
| 10 МКМ вперед праймер (например, T1-F) | 1 йл |
| 10 МКМ Обратный праймер BbsI-R | 1 йл |
| 10x ПЦР буфер | 2,5 мл |
| 2,5 мММ ДНТП | 1 йл |
| бактериальная жидкость | 1 йл |
| ДНК Так Полимераза | 2,5 единицы |
| Вода без нуклеазы | До 25 мкл |
Таблица 2: ПЦР смесь для положительного обнаружения бактериальных колоний.
| Реагента | Объем |
| pSSA-Двойной вектор (синтезированный фрагмент ДНК или продукт ПЦР) | 1-2 мкг |
| Буфер CutSmart | 5 мкл |
| Asci | 1 йл |
| Сали-ХФ | 1 йл |
| Дистиллированная вода | до 50 мкл |
| Общий объем | 50 мкл |
Таблица 3: Двойное переваривание вектора pSSA-Dual и синтезированного фрагмента ДНК (или продукта ПЦР).
| Реагента | Объем |
| pSSA-Двойной вектор (предпереваренный) | 0,5 мкг |
| Фрагменты ДНК, содержащие цели sgRNA (предварительно проглатываемые) | 0,2 мкг |
| T4 ДНК Лигас Баффер (10x) | 1 йл |
| T4 Лигас ДНК | 1 йл |
| Дистиллированная вода | до 10 мкл |
| Общий объем | 10 йл |
Таблица 4: Реакция перевязки фрагментов ДНК, содержащих цели sgRNA в предварительно проглатываемый вектор pSSA-Dual.
| Шаг 1: подготовка реагентов | |
| Трансфектонный реагент | 2 МЛ |
Таблица 5: Подробная информация о трансфекции клеток в 24 хорошо пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь процедуры клонирования вектора sgRNA облегчают эффективное производство sgRNAs, при этом большая часть затрат приходится на заказ олигонуклеотида и секвенирование векторов. В то время как изложенный метод предназначен, чтобы позволить пользователям генерировать sgRNAs для использования с CRISPR/Cas9, протокол может быть легко адаптирован для использования с Cas9 ортологами или другими РНК-управляемых эндонуклеазов, таких как Cpf1, вводя незначительные изменения в вектор позвоночника и олигонуклеотид нависающие последовательности.
Протокол, изложенный выше, обеспечит предпочтительный целевой показатель sgRNA в течение 10 дней, когда, начиная с надлежащим образом разработанные олигонуклеотиды. Это включает в себя дизайн sgRNA (1 ч, шаги 1 - 2), разбавление, aliquot и annealing олигонуклеотидов (30 мин, шаг 3), переваривание и очищение вектора экспрессии sgRNA (3 ч, шаг 4), клонирование олигонуклеотидов sgRNA в предварительно вываренный пустой вектор (ночь, шаги 5 - 6), обнаружение ПЦР колоний (4-5 ч, шаг 7) и проверка последовательности плазмиды экспрессии sgRNA (24 h , шаг 8). Между тем, строительство и последовательность проверки двойного вектора люциферазы репортер занимает 5 - 7 д (шаг 9). Подготовка клеточной линии, плазмидная трансфекция и двойное обнаружение люциферазы принимают около 48 ч (шаги 10 - 11). Показатели отказов для генерации каждой плазмиды почти 0.
Наиболее важным шагом протокола является ограничительное переваривание ферментом вектора sgRNA ферментами, такими как BbsI. Если пищеварения недостаточно, то положительная скорость бактерий колоний может быть очень низкой. В то время как подход к обнаружению на основе ПЦР может чутко контролировать эффективность пищеварения и положительную скорость. Форвардные грунтовки, ранее используемые в качестве форвардных олиго вставленного фрагмента sgRNA, обеспечивали высокоэффективное различие правых вставок и пустых векторов. Одним из преимуществ этой стратегии является именно эффективное обнаружение положительных колоний ПЦР до секвенирования ДНК. Как указано выше, проверка последовательности по-прежнему относительно дороже по сравнению с ПЦР, особенно когда происходит неполное переваривание BbsI. С точки зрения экономии ресурсов, мы спарить вперед oligos для sgRNA фрагментации аннеляций (таких как T1-F, T2-F или T3-F) с последовательности грунтовки BbsI-R для усиления ПЦР. Благодаря этой стратегии идентификации колоний в лаборатории успешно построено более 500 векторов sgRNA.
Еще одной заслугой протокола является эффективный предварительный отбор кандидатов sgRNA целей с использованием двойной люциферазы репортер системы. Огромная дисперсия эффективности резки действительно существует на различных целевых показателей sgRNA4. Для определения высокоэффективной цели sgRNA с помощью анализа T7E1 или нуклеазы Surveyor1 в трудно трансфектной клеточной линии является трудоемким и трудоемким. Кроме того, для усиления ПЦР в анализе T7E1 или анализе нуклеазы Surveyor, иногда бывает трудно специально усилить целевую последовательность в ДНК генома из-за отсутствия подходящих грунтовокпар 1. В отличие от этого, двойной luciferase репортер анализ не зависит от процедур усиления генома. Ранее мы использовали этот метод, чтобы получить очень активные sgRNAs16,19.
Несмотря на явные преимущества метода, описанного в этой работе, существуют также некоторые ограничения, которые необходимо отметить. Хотя он обеспечивает высокий уровень успеха, предложенный метод на основе люциферазы для отбора sgRNA может быть более дорогим, чем другие подходы (анализ расплава с высоким разрешением и т.д.) из-за необходимости синтеза целевой последовательности. Кроме того, этот подход не быстрее, чем любой из этих альтернативных методов из-за необходимости клонировать плазмид репортера, если простая в трансфицировании линия клеток будет проводиться для таргетинга генов. Необходимо также уточнить, что метод подходит для создания нокаутов, но не для редактирования конкретных нуклеотидов. Кроме того, можно оценить только двойные перерывы и не одноместные перерывы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Этот проект финансировался программой научной дисциплины первого класса Grassland провинции Шаньдун (Китай), Национальным фондом естественных наук Китая (31301936, 31572383), Специальный фонд агронау научных исследований в общественных интересах (201403071), Национальный проект по оценке рисков качества и безопасности молочной продукции (GJFP201800804) и проекты науки и техники жизнедеятельности населения Циндао (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
