Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine optimierte Methode zur effizienten Erzeugung von Plasmiden beschreibt, die sowohl das CRISPR-Enzym als auch die zugehörige Single Guide RNA (sgRNAs) exemittiert. Die Kotransfektion von Säugetierzellen mit diesem sgRNA/CRISPR-Vektor und einem dualen Luziferase-Reportervektor, der die Reparatur von Doppelstrang-Bruch untersucht, ermöglicht die Bewertung der Knockout-Effizienz.
Abstract
Obwohl hocheffizient, erfordert die Modifikation einer genomischen Stelle durch das CRISPR-Enzym die Generierung einer sgRNA, die für die Zielstelle(en) im Voraus einzigartig ist. Diese Arbeit beschreibt die wichtigsten Schritte, die zum Aufbau effizienter sgRNA-Vektoren führen, mit einer Strategie, die eine effiziente Detektion der positiven Kolonien durch PCR vor der DNA-Sequenzierung ermöglicht. Da eine effiziente Genombearbeitung mit dem CRISPR-System eine hocheffiziente sgRNA erfordert, ist eine Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen notwendig, um Zeit und Aufwand zu sparen. Ein duales luziferase-Reportersystem wurde entwickelt, um die K.o.-Effizienz zu bewerten, indem die Reparatur von Doppelstrang-Pausen durch einstrangiges Glühen untersucht wird. Hier verwenden wir dieses Reportersystem, um das bevorzugte xCas9/sgRNA-Ziel von Kandidaten-sgRNA-Vektoren für eine spezifische Genbearbeitung abzuholen. Das skizzierte Protokoll wird einen bevorzugten sgRNA/CRISPR-Enzymvektor in 10 Tagen liefern (beginnend mit entsprechend entwickelten Oligonukleotiden).
Introduction
Die CRISPR sgRNAs bestehen aus einer 20-Nukleotid-Sequenz (dem Protospacer), die die genomische Zielsequenz1,2ergänzt. Obwohl hocheffizient, erfordert die Fähigkeit des CRISPR/Cas-Systems, eine bestimmte genomische Site zu modifizieren, die Erzeugung eines Vektors, der eine effiziente sgRNA trägt, die für die Zielsite(en)2einzigartig ist. In diesem Artikel werden die wichtigsten Schritte bei der Generierung dieses sgRNA-Vektors beschrieben.
Für eine erfolgreiche Genombearbeitung mit dem CRISPR/Cas-System ist der Einsatz hocheffizienter sgRNAs eine entscheidende Voraussetzung3,4,5. Da in der Genombearbeitung eingesetzte Nukleasen unterschiedliche Effizienzen an verschiedenen Ziel-Loci1aufweisen, ist eine Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen erforderlich, um Zeit und Aufwandzusparen 6,7,8,9. Ein duales luziferase Reportersystem wurde entwickelt, um die Knockout-Effizienz zu bewerten, indem die Reparatur von Doppelstrang-Pausen über einstrangiges Glühen3,10untersucht wird. Hier verwenden wir dieses Reportersystem, um ein bevorzugtes CRISPR sgRNA-Ziel aus verschiedenen Kandidaten-sgRNA-Vektoren auszuwählen, die für die spezifische Genbearbeitung entwickelt wurden. Das hier angegebene Protokoll wurde in den letzten Jahren in unserer Gruppe und in den Kooperierenden Laboratorien implementiert, um CRISPR sgRNAs zu generieren und zu bewerten.
Das folgende Protokoll fasst zusammen, wie geeignete sgRNA über Netzwerksoftware zu entwerfen. Sobald die geeigneten sgRNAs ausgewählt sind, beschreiben wir die verschiedenen Schritte, um die erforderlichen Oligonukleotide zu erhalten, sowie den Ansatz, die gepaarten Oligonukleotide in den pX330-xCas9-Expressionsvektor einzufügen. Wir präsentieren auch eine Methode zur Zusammenstellung von sgRNA-exezierenden und dualen Luziferase-Reportervektoren, die auf der Ligation dieser Sequenzen in einen vorverdauten Expressionsvektor basieren (Schritte 2-10, Abbildung 1A). Schließlich beschreiben wir, wie die DNA-Schneideffizienz für jeden der sgRNAs analysiert werden kann (Schritte 11-12).
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Protocol
1. sgRNA Oligonukleotid-Design
- Entwerfen Sie sgRNAs mit Online-Tools wie dem Cas-Designer-Onlinetool (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Die PAM-Sequenz ist wichtig, basierend auf dem verwendeten Cas9. Für xCas9 sind die relevanten PAM-Sequenzen NG und das frühere cas-Designer-Online-Tool kann xCas9-relevante sgRNAs generieren.
- Verwenden Sie sgRNA-Designtools, die Algorithmen für die On- und Off-Target-Vorhersage (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11umfassen. Es wird eine Punktzahl von 0,2 oder höher bevorzugt.
- Wählen Sie bis zu 3 Gen-Editing-Ziele für ein optimales Screening aus (z. B. T1, T2 und T3 wurden für Schafe DKK2 exon 1 Gen targeting entwickelt [Tabelle 1]).
2. Oligonukleotid-Modifikation
- Um das sgRNA-Oligonukleotid zu modifizieren, löschen Sie das angrenzende Motiv 3'-NG protospacer (PAM) und behalten die Protospacer-Sequenz bei (z. B. Startsequenz für T1: TGCCTGCTCTCTTACTGGCCGC [20 nt]).
- Fügen Sie das Pentanukleotid CACCG an das 5'-Ende des Oligos.
HINWEIS: Nach der Ligation zum pX330-xCas9-Skelett enthält diese Sequenz das 3'-Ende des U6-Promoters, der die sgRNA-Transkription motiviert. Das Array "CACC" garantiert, dass der Oligo mit den Überhängen des BbsI-verdauten pX330-xCas9-Plasmids übereinstimmt. Die Basis "G" ist eine Voraussetzung für RNA Polymerase III Promotoren und garantiert die effektive Inbetriebnahme der sgRNA-Transkription (z.B. anhängen das 5'-CACCG-Array an den Protospacer von T1, das Erreichen von T1-F: CACCGTGCGCGCCTCTCTGGCCGC [25 nt]). Die Spaltungseffizienz von 21 nt gRNA unterscheidet sich signifikant von der von 20 nt gRNA1,12,13,14. Es wird allgemein empfohlen, 20 nt mit 5'-G zu verwenden, indem Sie einen kürzeren Protospacer erzeugen, wenn dies nicht möglich ist, dann können 21 nt mit zusätzlichem 5'-G verwendet werden. - Erstellen Sie eine umgekehrte Ergänzung (rc) der Protospacer-Sequenz.
HINWEIS: Der RC des T1-Protospacers ist beispielsweise GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Fügen Sie AAAC an das 5'-Ende der rc-Protospacer-Sequenz an. Fügen Sie ein zusätzliches C an das 3'-Ende des rc-Protospacers an.
HINWEIS: Die "AAAC"-Sequenz stellt sicher, dass das Oligonukleotid zum Klonen in das bbsI-verdaute pX330-xCas9-Plasmid geeignet ist. Das zusätzliche "C" am 3'-Ende ist für das Glühen mit der oben beschriebenen sgRNA-Transkription unerlässlich (z.B. AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] ist die letzte Oligonukleotidsequenz für T1 rc protospacer). - Bestellen Sie die Oligonukleotide.
3. Oligonukleotid-Glühen
- Lyophilisierte Oligonukleotide in doppeldestilliertem Wasser (ddH2O) verdünnen.
- Mischen Sie Vorwärts- und Rückwärtsoligonukleotide in einem dünnwandigen PCR-Rohr mit einem Verhältnis von 1:1 (z. B. je 20 l), ohne einen zusätzlichen Puffer hinzuzufügen.
- Inkubieren Sie die Mischung bei 95 °C für 5 min und rampen Sie dann die Temperatur auf 72 °C für 10 min. Folgen Sie mit einer Abkühlzeit bei Raumtemperatur (RT), die darin besteht, die Probe einfach von der PCR-Maschine zu entfernen und bei RT zu platzieren.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Oligonukleotid-Mischungen zu phosphorylieren, um die Ligation zu erleichtern.
4. sgRNA/CRISPR Vektorverdauung
- Digest 1 g des ausgewählten pX330-xCas9-Vektors mit BbsI (10 Einheiten Enzym pro 1 g Plasmid) für 2 h bei 37 °C(Abbildung 2). Führen Sie die Verdauung des pX330-xCas9 sgRNA Expressionsvektors in einem Gesamtvolumen von 50 l durch, das 5 l 10-fachen Verdauungspuffer und destilliertes Wasser enthält, um das Endvolumen zu erreichen.
- Reinigen Sie den verdauten Vektor durch Bandextraktion von einem 2% Agarose-Gel unter 10 V/cm und reinigen Sie anschließend mit einer Kieselsäuresäule mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit.
5. Ligation der geglühten sgRNA-Oligonukleotide zum Expressionsvektor
- Mischen Sie die geglühten sgRNA-Oligonukleotide (5 l der Mischung aus Schritt 4) mit dem BbsI-verdauten pX330-xCas9-Vektor (gereinigt, 100 ng).
- Fügen Sie 1 L Ligase und 1 l 10x LigasePuffer hinzu.
- Destilliertes Wasser mit entsprechendem Volumen, bis zu 10 l, hinzufügen.
- Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
6. Kompetente Zelltransformation
- E. coli DH5- kompetente Zellen bei -80 °C aus der Lagerung nehmen und auf Eis auftauen.
- Fügen Sie 5 l der Ligationsmischung auf 50 l des kompetenten E. coli DH5- und 30 min auf Eis zu halten.
- Hitze schockieren das Gemisch bei 42 °C für 90 s.
- Ruhen Sie es auf Eis für 2 min.
- Stellen Sie die Kultur auf einem Drehshaker in 500 l LB-Medien für 1 h bei 37 °C wieder her.
- Platte 200 l der Kultur auf einer Ampicillinresistenz LB Agaroseplatte und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C.
7. Identifizierung der richtigen rekombinanten Plasmide durch PCR
- Wählen Sie 5 bis 10 Bakterienkolonien aus der LB-Platte und verwenden Sie jede von ihnen, um ein 1,5 ml-Rohr mit 1 ml LB-Medien mit 60 mg/ml Ampicillin zu impfen.
- Inkubieren Sie die Rohre auf einem Drehschüttler für 2-3 h.
- Durchführung des Nachweises korrekter rekombinanter Plasmide unter Verwendung spezifischer Primerpaare für die sgRNA-Oligonukleotide [z.B. Vorwärtsprimer für T1 sgRNA Expressionsvektorkonstruktion (T1-F): CACCGTGCGCGCTCCTACTCTCTGCGC, Reverse Primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, Produktion eines 287 bp Amplicon (Abbildung 3)].
- Bereiten Sie die PCR-Mischung vor (Tabelle 2).
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Zyklusbedingungen: 95 °C für 5 min für die Vordenaturierung; 30 Zyklen von 95 °C für 30 s für Denaturierung, 60 °C für 30 s zum Glühen und 72 °C für 30 s für Dieverlängerung. Nach Abschluss der 30 Zyklen einen letzten Verlängerungsschritt durch Erhitzen für 5 min bei 72 °C durchführen.
- Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 2% Agarose-Gel unter 10 V/cm aus. Ein Band mit der richtigen Größe [z.B. 287 bp] gilt als positiv.
8. Validieren Sie die Sequenz des sgRNA-Expressionsplasmids
- Überprüfen Sie die Reihenfolge der PCR-positiven Kolonien durch Sanger-Sequenzierung15 mit dem Reverse Primer BbsI-R (siehe Schritt 7.3). Diese Grundierung anneals an der Stelle flussabwärts des sgRNA Oligoeinsatzes. Die pX330-xCas9-T1, die eine sgRNA-Sequenz mit Protospacer TGCCTGCTCTTACTGGCCGCGG und xCas9 exzessiiert, wurde konstruiert.
- Verwenden Sie die Vorwärtsgrundierung T1-F, um die positiven Kolonien zu sequenzieren. Der Vorwärts-Teil konnte keine vollständigen Sequenzinformationen für die Stelle geben, die die Einfügestelle des sgRNA-Oligos umgibt, da 30-50 bp Fragment nach dem Sequenzierungsprimer nicht genau ausgelesen werden konnte.
9. Konstruktion von dualen luziferase Reporter Vektor
- Synthesize 300-500 bp DNA-Fragmente, die die sgRNA-Ziele enthalten, und subklonieren Sie es in einen dualen Luziferase-Reportervektor durch Doppelverdauung [z.B. Subklon 440 bp Schafe DKK2 exon1 Fragment in pSSA-Dual Plasmid16,17 durch Die Verwendung von Doppelverdauung mit AscI und SalI, resultierende pSSA-Dual-DKK2].
- Synthesize 300-500 bp DNA-Fragmente, die die sgRNA-Ziele enthalten. Beachten Sie, dass die Sequenzen der DNA-Fragmente Teile der genomischen Sequenzen sein müssen, die von der NCBI-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oder verwandten Referenzen abgerufen werden könnten.
- Wählen Sie einen geeigneten Dual-Luziferase-Reportervektor wie pSSA-Dual16,17 (oder zwei Vektoren, die Galleluzifase bzw. Renilla-Luziferase exdrücken) und verdauen Sie dann diesen Vektor und die oben genannten DNA-Fragmente mit zwei Endonukleasen wie AscI und SalI.
- Schließlich ligate diese beiden Fragmente mit T4 DNA Ligase, was zu pSSA-Dual-Target. Einzelheiten für die Doppelverdauung und Ligation sind in Tabelle 3 bzw. Tabelle 4aufgeführt. Es ist erwähnenswert, dass der Reportervektor in stabilen Bakterienstämmen (wie Top10) verstärkt werden sollte, die mit niedrigerer Rotationsgeschwindigkeit (in der Regel nicht mehr als 200 Umdrehungen pro Minute) kultiviert werden sollen, um eine DNA-Rekombination zu vermeiden.
10. Zelltransfektion
- Extrahieren Sie Endotoxinfreie Plasmide für die oben genannten Vektoren. Bewerten Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmide mit geeigneten Instrumenten. Für diese Plasmide wird eine Endkonzentration von nicht weniger als 500 ng/l und ein Reinheitsverhältnis von 1,7-1,9 bei Absorptionsstärke 260/280 nm (A260/A280) empfohlen.
- Kotranstranssektieren Sie eine geeignete Zelllinie wie PIEC18 mit den Plasmiden in gleichem Verhältnis (z.B. pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 g Plasmid für jede Duplizierung bei Verwendung von 24 Well-Platten). Verwenden Sie einen leeren Vektor wie pX330-xCas9 als negatives Steuerelement.
- Einen Tag vor der Transfektion, Plattenzellen in einer 24-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen/Well. Zellen sind bereit für die Transfektion, wenn sie einen Zusammenfluss von 60-80% erreichen.
- Vor dem Transfektionszeitpunkt den Überstand so weit wie möglich entfernen und für jeden Brunnen vorsichtig 0,5 ml frische Medien hinzufügen.
- Transfektionsreagenz in DMEM-Medien im Verhältnis 1:25 verdünnen und gut mischen.
- Bereiten Sie den Master-Mix der DNA vor, indem Sie 0,5 g DNA in 25 l DMEM-Medien verdünnen, und fügen Sie dann 1 L P3000-Reagenz hinzu.
- Fügen Sie verdünnte DNA zu jeder Tube des verdünnten Transfektionsreagenzes (1:1 Verhältnis) hinzu.
- 10–15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie den Zellen 50 L DNA-Lipid-Komplex hinzu.
- Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C. Analysieren Sie dann transfizierte Zellen wie in Schritt 11.
11. Dual-Luciferase-Erkennung
- Bereiten Sie eine ausreichende Menge des 1x passiven Lysepuffers (PLB) vor, indem Sie 1 Volumen von 5x PLB zu 4 Volumen destilliertem Wasser hinzufügen und gut mischen.
- Passive Lyse von Zellen, die in 24-Well-Kulturplatten kultiviert werden.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den kultivierten Zellen, und wenden Sie vorsichtig ein ausreichendes Volumen an Phosphatgepufferter Saline (PBS) an, um die Oberfläche des Kulturgefäßes zu waschen. Wirbeln Sie das Gefäß kurz, um abgetrennte Zellen und Restwachstumsmedium zu entfernen. Entfernen Sie die Spüllösung vollständig, bevor Sie PLB-Reagenz auftragen.
- Geben Sie 100 l 1x PLB in jede Kultur gut, um die Zellmonolayer vollständig abzudecken. Lassen Sie die Kulturplatten für 20 min stehen.
- Übertragen Sie das Lysat zur weiteren Handhabung oder Lagerung in ein Rohr oder eine Durchstechflasche.
- Bereiten Sie Luziferase-Assay-Reagenz (LAR) vor, indem Sie das mitgelieferte lyophilisierte Luziferase-Assay-Substrat in 10 ml des mitgelieferten Luziferase-Assaypuffers wieder aufsetzen.
- Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen vor, um die gewünschte Anzahl von Dual-Luciferase-Reporter-Assays (100 L Reagenz pro Assay) durchzuführen. Fügen Sie 1 Volumen von 50x Stop-Substrat zu 50 Volumen Stop-Puffer in einem Glas oder silikonisierte Polypropylen-Rohr.
- Dual-Luciferase-Reporter (DLR) Assay
- Programmierluminometer, um eine 2-Sekunden-Vorleseverzögerung zu gewährleisten, gefolgt von einem 10-Sekunden-Messzeitraum.
- Vorgeben Sie 100 l Luziferase-Assay-Reagenz in die entsprechende Anzahl von Luminometer-Röhren, um die gewünschte Anzahl von DLR-Assays zu vervollständigen.
- Sorgfältig bis zu 20 l Zelllysat in das Luminometerrohr mit LAR übertragen; 2- oder 3-mal durch Pipettieren mischen. Legen Sie das Rohr in das Luminometer und initiieren Sie das Lesen.
- Entfernen Sie das Probenröhrchen aus dem Luminometer, fügen Sie 100 L Stop-Reagenz und Wirbel kurz hinzu, um sie zu mischen. Ersetzen Sie die Probe im Luminometer, und initiieren Sie das Lesen.
- Zeichnen Sie die Renilla-Luziferase-Aktivität normalisiert, um die Galle Luziferase Aktivität, nämlich die reziproke des Verhältnisses auf dem Bildschirm angezeigt.
- Entsorgen Sie das Reaktionsrohr, und fahren Sie mit dem nächsten Test fort.
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Representative Results
Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sind für die Konstruktion von sgRNA- und xCas9-Expressionsvektoren und dann für das Optimierungsscreening von sgRNA-Oligos mit relativ höheren Gen-Targeting-Effizienzen. Hier zeigen wir ein repräsentatives Beispiel von 3 sgRNA-Zielen für Schafe DKK2 exon 1. SgRNA- und xCas9-Expressionsvektoren können durch Vorverdauen des Vektorrückgrats (Abbildung 2) aufgebaut werden, gefolgt von der Ligaung in einer Reihe kurzer Doppelstrang-DNA-Fragmente durch glühende Oligopaare. Die positiven Kolonien konnten durch spezifische Primerpaare geführtPCR erkannt werden (Abbildung 3). Ein 440 bp DNA-Fragment von Schafen DKK2 exon 1 wurde in pSSA-Dual Plasmid15 subkloniert, indem doppelverdauungshaltige Mitarbeit bei AscI und SalI verwendet wurde, was zu pSSA-Dual-DKK2 führte. Die Gen-Targeting-Kapazitäten von pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 und pX330-xCas9-T3 wurden simutanusly detektiert (Abbildung 5), und dann wurde der letzte sgRNA-Vektor als der relativ bessere identifiziert, den wir im nächsten Schritt für die Forschung zur Schaf-Gen-Editing aufnehmen.
Diese Detektionsmethode kombiniert einen Single-Strand-Glühmechanismus (SSA)(Abbildung 1B und Abbildung 4) mit einem Luziferase-Berichtsgen, um die Effizienz des DNA-Schneidens zu überwachen. Wie in Abbildung 4dargestellt, ist SSA ein Prozess, der eingeleitet wird, wenn ein doppelter Strangbruch zwischen zwei wiederholten Sequenzen vorgenommen wird, die in die gleiche Richtung ausgerichtet sind. Einzelne Strangbereiche werden neben den Brüchen erstellt, die sich bis zu den wiederholten Sequenzen erstrecken, so dass die komplementären Stränge zueinander annealen können. Dieses glühende Zwischenprodukt kann verarbeitet werden, indem die einzelnen gestrandeten Schwänze verdaut und die Lücken gefüllt werden. Das Dual-Luciferase Reporter-Gen enthält hauptsächlich die Luziferase-Gene aus der Galle Photinus pyralis und aus Renilla reniformis (auch bekannt als Meerstiefin. Die Aktivitäten von Gofafly und Renilla-Luziferasen werden sequenziell aus einer einzigen Probe gemessen. Wenn der Erkennungsbereich, der das Beendigungscodon hat, nicht in seiner Mitte geschnitten wird, wird das Gen im SSA-System blockiert und kann nicht in ein funktionelles Protein übersetzt werden. Wenn die Verarbeitung stattfindet, wird das SSA-System die homologe Sequenz automatisch zusammenführen, und überlappende Sequenzen werden zu einer einzigen Sequenz, das Gen wird rekombiniert und kann dann während der Produktion eines funktionellen Proteins gelesen werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte des Klonvorgangs.
(A) Schematic of sgRNA vector construction, adapted from the protocols of Feng Zhang Lab. (B) Schematic of dual luciferase reporter vector building (select vector pSSA-DKK2 as a example), DNA fragments Rluc-, Rluc-2 und Rluc-3 represent three parts of full-length coding sequence of Renilla luciferase. MCS steht für "Mehrfachklonen". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vorverdauen des Vektor-Backbones pX330-xCas9 mit BbsI.
1: DNA-Marker, 2: pX330-xCas9-Plasmid, 3: pX330-xCas9-Plasmid mit BbsI verdaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Spezifische Primerpaare geführtpcR für DKK2-T1 sgRNA Vektordetektion.
Bahnen 1-7 zeigen PCR-Bänder für 7 verschiedene Bakterienkolonien separat an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schemata für einsträngiges Glühen (SSA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Dual-Luziferase-Assay mit Reportervektor pSSA-DKK2 in der Zelllinie PIEC.
Die Aktivitäten der Ranilla luciferase luciferase werden signifikant induziert (P<0.01, Student es t test) in PIEC durch Überexpresing von pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 oder pX330-xCas9-T3 mit der Faltänderung von 3,15, 5,84 bzw. 13,10. Die Fehlerbalken geben Standardabweichungen (SD)(n=3) für jede Gruppe an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | Genomische DNA-Ziele (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCTTACTGGCCGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGTCCCtCTGGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCTCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGGGGGCAGCGCGCGGGCGC | ||||
Tabelle 1: sgRNA-Ziele und Oligos zur Genbearbeitung von Schafen DKK2.
| PCR-Komponente | 25-L-Reaktion |
| 10 M Vorwärtsprimer (z.B. T1-F) | 1 L |
| 10 m Reverse Primer BbsI-R | 1 L |
| 10x PCR-Puffer | 2,5 l |
| 2,5 mM dNTPs | 1 L |
| bakterielle Flüssigkeit | 1 L |
| DNA Taq Polymerase | 2,5 Einheiten |
| Nukleasefreies Wasser | Bis zu 25 l |
Tabelle 2: PCR-Mischung zum Nachweis positiver Bakterienkolonien.
| Reagenz | Volumen |
| pSSA-Dual-Vektor (synthetisiertes DNA-Fragment oder PCR-Produkt) | 1-2 g |
| CutSmart-Puffer | 5 l |
| Asci | 1 L |
| SalI-HF | 1 L |
| Destilliertes Wasser | bis zu 50 l |
| Gesamtvolumen | 50 l |
Tabelle 3: Doppelte Verdauung von pSSA-Dual-Vektor und synthetisiertem DNA-Fragment (oder PCR-Produkt).
| Reagenz | Volumen |
| pSSA-Dual-Vektor (vorverdaut) | 0,5 g |
| DNA-Fragmente, die die sgRNA-Ziele enthalten (vorverdaut) | 0,2 g |
| T4 DNA Ligase Puffer (10x) | 1 L |
| T4 DNA Ligase | 1 L |
| Destilliertes Wasser | bis zu 10 l |
| Gesamtvolumen | 10 l |
Tabelle 4: Eine Ligationsreaktion von DNA-Fragmenten, die die sgRNA-Targets enthalten, in einen vorverdauten pSSA-Dual-Vektor.
| Schritt 1: Reagenzzubereitung | |
| Transfektionsreagenz | 2 l |
Tabelle 5: Details der Zelltransfektion in einer 24-Well-Platte.
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Discussion
Die sgRNA-Vektorklonierungsverfahren, die wir hier beschrieben haben, erleichtern die effiziente Produktion von sgRNAs, wobei die meisten Kosten aus der Oligonukleotid-Reihenfolge und Vektorsequenzierung abgeleitet werden. Während die skizzierte Methode entwickelt wurde, um Benutzern die Generierung von sgRNAs für die Verwendung mit CRISPR/Cas9 zu ermöglichen, kann das Protokoll leicht für die Verwendung mit Cas9-Orthoologen oder anderen RNA-geführten Endonukleasen wie Cpf1 angepasst werden, wodurch kleinere Modifikationen am Vektor-Backbone und den Oligonukleotid-Überhangsequenzen eingeführt werden.
Das oben beschriebene Protokoll wird ein bevorzugtes sgRNA-Ziel in 10 Tagen bieten, wenn es mit entsprechend gestalteten Oligonukleotiden beginnt. Dazu gehören das sgRNA-Design (1 h, Schritte 1 - 2), Verdünnung, aliquot und Glühen der Oligonukleotide (30 min, Schritt 3), Verdauung und Reinigung des sgRNA Expressionsvektors (3 h, Schritt 4), das Klonen der sgRNA-Oligonukleotide zu einem vorverdauten leeren Vektor (über Nacht, Schritte 5 - 6), die PCR-Detektion der Kolonien (4-5 h, Schritt 7) und die Validierung der Sequenz des sgRNA-Expressionsplasmids (24 h) , Schritt 8). In der Zwischenzeit dauert die Konstruktion und Sequenzvalidierung des dualen Luziferase-Reportervektors 5 – 7 d (Schritt 9). Die Herstellung der Zelllinie, Plasmidtransfektion und duale Luziferase-Erkennung dauern etwa 48 h (Schritte 10 - 11). Die Ausfallraten für die Erzeugung jedes Plasmids liegen bei fast 0.
Der kritischste Schritt des Protokolls ist die restriktive Enzymverdauung von sgRNA-Vektoren durch Enzyme wie BbsI. Wenn die Verdauung nicht ausreicht, dann könnte die positive Rate der Bakterienkolonien sehr niedrig sein. Während der PCR-basierte Erkennungsansatz die Verdauungseffizienz und die positive Rate sensibel überwachen könnte. Die Vorwärtsprimer, die früher als Vorwärtsoligos des eingefügten sgRNA-Fragments verwendet wurden, sorgten für eine hochwirksame Unterscheidung von rechten Einfügungen und leeren Vektoren. Einer der Vorteile dieser Strategie ist gerade der effiziente Nachweis der positiven Kolonien durch PCR vor der DNA-Sequenzierung. Wie oben erwähnt, ist die Sequenzüberprüfung im Vergleich zur PCR immer noch relativ teurer, insbesondere wenn eine unvollständige Verdauung von BbsI auftritt. In Bezug auf die Ressourceneinsparung haben wir die Vorwärtsoligos für sgRNA-Fragmentglühen (wie T1-F, T2-F oder T3-F) mit dem Sequenzierungsprimer BbsI-R zur PCR-Verstärkung gekoppelt. Mehr als 500 sgRNA-Vektoren wurden im Labor durch diese Strategie zur Identifizierung von Kolonien erfolgreich konstruiert.
Ein weiterer Vorteil des Protokolls ist die effektive Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen mit dualen luziferase Reporter-System. Bei verschiedenen sgRNA-Zielen 4 bestehtin der Tat eine enorme Varianz der Schneideffizienz. Ein hocheffizientes sgRNA-Ziel durch T7E1-Assay oder Surveyor-Nuklease-Assay1 in einer schwer zu transfekierten Zelllinie zu identifizieren, ist zeitaufwändig. Darüber hinaus ist es für die PCR-Verstärkung im T7E1-Assay oder Surveyor-Nuklease-Assay manchmal schwierig, die Zielsequenz in der Genom-DNA gezielt zu verstärken, da es an geeigneten Primerpaarenfehlt 1. Im Gegensatz dazu ist der duale Luziferase-Reporter-Assay unabhängig von Genomamplifikationsverfahren. Bisher haben wir diese Methode verwendet, um hochaktive sgRNAs16,19zu erhalten.
Trotz der klaren Vorteile der in dieser Arbeit beschriebenen Methode gibt es auch einige Einschränkungen, auf die hingewiesen werden muss. Obwohl es eine hohe Erfolgsrate sicherstellt, könnte die vorgeschlagene luziferase-basierte Methode zur sgRNA-Auswahl teurer sein als andere Ansätze (Vermessungs-/hochauflösende Schmelzeanalyse usw.), da die Zielsequenz synthetisiert werden muss. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht schneller als eine dieser alternativen Methoden, da das Reporter-Plasmid geklont werden muss, wenn eine leicht zu transfekte Zelllinie für das Gen-Targeting durchgeführt wird. Es ist auch notwendig zu klären, dass die Methode geeignet ist, Knockouts zu machen, aber nicht, um bestimmte Nukleotide zu bearbeiten. Darüber hinaus können nur doppelsträngige Pausen und nicht einsträngige Pausen ausgewertet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch das First Class Grassland Science Discipline Program der Provinz Shandong (China), die National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), der Sonderfonds für agrowissenschaftliche Forschung im öffentlichen Interesse (201403071), Nationale Risikobewertung großes Sonderprojekt für die Qualität und Sicherheit von Milcherzeugnissen (GJFP201800804) und Projekte der Qingdao People es Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
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