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Bioengineering

CRISPR प्लाज्मिड्स का निर्माण और एक दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर सिस्टम के माध्यम से स्तनधारी कोशिकाओं में नॉकआउट दक्षता का पता लगाना

Published: December 5, 2020 doi: 10.3791/59639
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 2, 1
1Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, 2University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम CRISPR एंजाइम और संबद्ध एकल गाइड आरएनए (SgRNAs) दोनों को व्यक्त करते हुए प्लाज्मिड की कुशल पीढ़ी के लिए एक सुव्यवस्थित विधि का वर्णन करते हुए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस sgRNA/CRISPR वेक्टर और एक दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर वेक्टर है कि डबल स्ट्रैंड तोड़ मरम्मत की जांच के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के सह-ट्रांसफेक्शन नॉकआउट दक्षता के मूल्यांकन की अनुमति देता है ।

Abstract

हालांकि अत्यधिक कुशल, CRISPR एंजाइम द्वारा एक जीनोमिक साइट के संशोधन के लिए पहले से ही लक्ष्य साइट (ओं) के लिए अद्वितीय एक sgRNA की पीढ़ी की आवश्यकता है । यह काम एक रणनीति का उपयोग करके कुशल एसजीआरएनए वैक्टर के निर्माण के लिए अग्रणी प्रमुख चरणों का वर्णन करता है जो डीएनए अनुक्रमण से पहले पीसीआर द्वारा सकारात्मक उपनिवेशों का कुशल पता लगाने की अनुमति देता है। चूंकि CRISPR प्रणाली का उपयोग कुशल जीनोम संपादन एक अत्यधिक कुशल sgRNA की आवश्यकता है, उंमीदवार sgRNA लक्ष्यों का एक चयन समय और प्रयास को बचाने के लिए आवश्यक है । सिंगल स्ट्रैंड एनीलिंग के जरिए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक रिपेयर की जांच करके नॉकआउट एफिशिएंसी का मूल्यांकन करने के लिए ड्यूल लूसिफेरेज रिपोर्टर सिस्टम विकसित किया गया है । यहां, हम विशिष्ट जीन संपादन के लिए उम्मीदवार sgRNA वैक्टर से पसंदीदा xCas9/sgRNA लक्ष्य लेने के लिए इस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग करें । उल्लिखित प्रोटोकॉल 10 दिनों में एक पसंदीदा sgRNA/CRISPR एंजाइम वेक्टर प्रदान करेगा (उचित रूप से डिजाइन किए गए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से शुरू) ।

Introduction

CRISPR sgRNAs में 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (प्रोटोस्पेसर) शामिल है, जो जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम1,2के पूरक है। हालांकि अत्यधिक कुशल, CRISPR/कैस प्रणाली की क्षमता एक दिया जीनोमिक साइट को संशोधित करने के लिए एक वेक्टर की पीढ़ी के लक्ष्य साइट (ओं)2के लिए अद्वितीय एक कुशल sgRNA ले जाने की आवश्यकता है । यह पत्र उस sgRNA वेक्टर की पीढ़ी में महत्वपूर्ण कदम का वर्णन करता है ।

CRISPR/Cas प्रणाली का उपयोग कर सफल जीनोम संपादन के लिए, अत्यधिक कुशल sgRNAs का उपयोग एक महत्वपूर्ण शर्त3,4,5है । चूंकि जीनोम संपादन में उपयोग किए जाने वाले इंजीनियर नाभिक विभिन्न लक्षित लोकी 1 पर विविध क्षमताओं को प्रकट करते हैं, इसलिएसमय और प्रयास6,7,8,9को बचाने के लिए उम्मीदवार एसजीआरएनए लक्ष्यों का पूर्व चयन आवश्यक है। सिंगल स्ट्रैंड एनीलिंग3,10के जरिए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक रिपेयर की जांच करके नॉकआउट दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक दोहरी लूसिफेरेज रिपोर्टर सिस्टम विकसित किया गया है । यहां हम विशिष्ट जीन संपादन के लिए डिज़ाइन किए गए विभिन्न उम्मीदवार sgRNA वैक्टर से एक पसंदीदा CRISPR sgRNA लक्ष्य चुनने के लिए इस रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करते हैं। यहां बताए गए प्रोटोकॉल को हमारे समूह और सहयोग प्रयोगशालाओं में पिछले कुछ वर्षों से CRISPR sgRNAs उत्पन्न करने और मूल्यांकन करने के लिए लागू किया गया है ।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल नेटवर्क सॉफ्टवेयर के माध्यम से उपयुक्त एसजीआरएनए डिजाइन करने का तरीका है। एक बार उपयुक्त sgRNAs का चयन कर रहे हैं, हम आवश्यक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राप्त करने के लिए विभिन्न चरणों के साथ-साथ pX330-xCas9 अभिव्यक्ति वेक्टर में जोड़ा ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डालने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हम इन दृश्यों के लिगेशन के आधार पर sgRNA-एक्सप्रेसिंग और दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर वैक्टर को एक प्रीडिगेस्ट एक्सप्रेशन वेक्टर (कदम 2-10, चित्रा 1A)में कोडांतरण के लिए एक विधि भी पेश करते हैं। अंत में हम वर्णन कैसे sgRNAs (कदम 11-12) में से प्रत्येक के लिए डीएनए काटने दक्षता का विश्लेषण करने के लिए ।

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Protocol

1. sgRNA ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन

  1. कैस-डिजाइनर ऑनलाइन टूल (http://www.rgenome.net/cas-designer/) जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग करके डिजाइन sgRNAs डिजाइन करें। पाम अनुक्रम Cas9 के आधार पर महत्वपूर्ण है इस्तेमाल किया जा रहा है । xCas9 के लिए, प्रासंगिक पाम दृश्य एनजी हैं और पूर्व संदर्भित कैस-डिजाइनर ऑनलाइन टूल xCas9 प्रासंगिक sgRNAs उत्पन्न कर सकता है।
    1. SgRNA डिजाइन उपकरण का उपयोग करें जो ऑन-एंड-टारगेट भविष्यवाणी (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11के लिए एल्गोरिदम को शामिल करते हैं। 0.2 या उससे अधिक का स्कोर पसंद किया जाता है।
  2. एक इष्टतम स्क्रीनिंग के लिए 3 जीन संपादन लक्ष्यों का चयन करें (जैसे, टी 1, टी 2 और टी 3 भेड़ DKK2 exon 1 जीन लक्ष्यीकरण[तालिका 1])के लिए डिजाइन किए गए थे ।

2. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संशोधन

  1. SgRNA ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को संशोधित करने के लिए, प्रोटोस्पेसर अनुक्रम (उदाहरण के लिए, टी 1 के लिए अनुक्रम शुरू: TGCCTTCTCCTACTGGCCGC [20 nt]) को हटा दें।
  2. ओलिगो के 5'-अंत में पेंटान्यूक्लियोटाइड CACCG जोड़ें।
    नोट: pX330-xCas9 कंकाल के लिए बंधन पर, इस अनुक्रम U6 प्रमोटर के 3 'अंत sgRNA प्रतिलेखन प्रेरित शामिल होंगे। सरणी "CACC" की गारंटी देता है कि ओलिगो BBSI के ओवरहैंग के साथ मिलान कर रहा है-pX330-xCas9 प्लाज्मिड पचा । आधार "जी" आरएनए पॉलीमरेज III प्रमोटरों की एक शर्त है और SgRNA प्रतिलेखन के प्रभावी स्टार्टअप की गारंटी देता है (उदाहरण के लिए, T1 के प्रोटोस्पेसर को 5'-CACCG सरणी परिशिष्ट, T1-F प्राप्त: CACCGGCCTTTTCCCCCCCCCCCCCCGGCCGC [25nt]) । 21 एनटी जीआरएनए की दरार दक्षता 20 एनटी जीआरएनए1 , 12,13,14से काफी भिन्न है . आम तौर पर एक छोटे प्रोटोस्पेसर को जेनरेट करके 5'-जी के साथ 20 एनटी का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, यदि यह संभव नहीं है तो अतिरिक्त 5'-जी के साथ 21 एनटी का उपयोग किया जा सकता है।
  3. प्रोटोस्पेसर अनुक्रम का एक रिवर्स पूरक (आरसी) बनाएं।
    नोट: उदाहरण के लिए, टी 1 प्रोटोस्पेसर की आरसी जीसीजीजीसीसीएजीसीए (20 एनटी) है।
  4. आरसी प्रोटोस्पेसर अनुक्रम के 5'-अंत में एएएसी को संलग्न करें। आरसी प्रोटोस्पेसर के 3'-अंत में एक अतिरिक्त सी को संलग्न करें।
    नोट: "AAAC" अनुक्रम यह सुनिश्चित करता है कि ओलिगोन्यूक्लियोटाइड बीबीएसआई-पचाए गए pX330-xCas9 प्लाज्मिड में क्लोनिंग के लिए उपयुक्त है। 3'-अंत पर अतिरिक्त "सी"ऊपर वर्णित एसजीआरएनए ट्रांसक्रिप्शन के लिए "जी" शुरू करने के साथ एनीमलिंग के लिए आवश्यक है (उदाहरण के लिए, AAACGCGGCCAGAGCAGGCAC [25 एनटी] टी 1 आरसी प्रोटोस्पेसर के लिए अंतिम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम है)।
  5. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ऑर्डर करें।

3. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड एनीलिंग

  1. डबल डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीएच2ओ) में 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला लिओफिलाइज्ड ओलिगोन्यूक्लियोट्स।
  2. किसी भी अतिरिक्त बफर को जोड़ने के बिना 1:1 अनुपात (उदाहरण के लिए, 20 माइक्रोन प्रत्येक) को मेनटेन करने वाली पतली दीवार पीसीआर ट्यूब में आगे और रिवर्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड मिलाएं।
  3. मिश्रण को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर 10 मिनट के लिए तापमान को 72 डिग्री सेल्सियस तक रैंप करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर एक ठंडा अवधि के साथ पालन करें बस पीसीआर मशीन से नमूना हटाने और आरटी पर रखने से मिलकर ।
    नोट: लिगेशन को सुविधाजनक बनाने के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड मिश्रण को फॉस्फोरलेट करना आवश्यक नहीं है।

4. sgRNA/CRISPR वेक्टर पाचन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2) पर 2 घंटे के लिए बीबीएसI (प्लाज्मिड के 1 माइक्रोग्राम प्रति 1 माइक्रोग्राम) के साथ चयनित pX330-xCas9 वेक्टर के 1 माइक्रोन कोपचाएं। अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए 10x पाचन बफर और आसुत पानी के 5μL युक्त, 50 माइक्रोन की कुल मात्रा में pX330-xCas9 sgRNA अभिव्यक्ति वेक्टर के पाचन का संचालन करें।
  2. 10 वी/सेमी के तहत 2% एगर उठे जेल से बैंड निष्कर्षण द्वारा पचाने वाले वेक्टर को शुद्ध करें और बाद में एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके सिलिका कॉलम का उपयोग करके शुद्ध करें।

5. अभिव्यक्ति वेक्टर के लिए एनील्ड sgRNA ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का लिगेशन

  1. BBSI-पचा pX330-xCas9 वेक्टर (शुद्ध, १०० एनजी) के साथ annealed sgRNA ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (कदम 4 से मिश्रण के 5 माइक्रोन) मिलाएं ।
  2. लिगाज़ के 1 माइक्रोल और 10x लिगाज़ बफर के 1 माइक्रोल जोड़ें।
  3. 10 माइक्रोल तक, उचित मात्रा के साथ आसुत पानी जोड़ें।
  4. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. सक्षम सेल परिवर्तन

  1. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से ई. कोलाई DH5α सक्षम कोशिकाओं को बाहर निकालें और इसे बर्फ पर गल लें।
  2. लिगेशन मिश्रण के 5 माइक्रोन को सक्षम ई कोलाई डीएच5α के 50 माइक्रोन में जोड़ें और मिश्रण को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को झटका दें।
  4. इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर आराम करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एलबी मीडिया के 500 माइक्रोन में एक रोटरी शेखर पर संस्कृति को ठीक करें।
  6. प्लेट एक एम्पीसिलिन प्रतिरोध पौंड agarose प्लेट पर संस्कृति के 200 μL और यह 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।

7. पीसीआर द्वारा सही पुनर्संयोजन प्लाज्मिड की पहचान

  1. एलबी प्लेट से 5 से 10 बैक्टीरियल कॉलोनियों का चयन करें और उनमें से प्रत्येक का उपयोग 60 मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलिन के साथ एलबी मीडिया के 1 एमएल युक्त एक 1.5 एमएल ट्यूब को टीका लगाने के लिए करें।
  2. 2-3 घंटे के लिए एक रोटरी शेखर पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  3. SgRNA ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग करके सही पुनर्संयोजन प्लाज्मिड का पता लगाएं [उदाहरण के लिए, T1 sgRNA अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण (T1-F) के लिए फॉरवर्ड प्राइमर): CACCGTGCCTGCTCCCCCCCCCCCCCCGC, रिवर्स प्राइमर (BBSI-R): AAAGTCCCTTGGCGTTAC, एक २८७ बीपी amplicon(चित्रा 3)]का उत्पादन ।
    1. पीसीआर मिश्रण(टेबल 2)तैयार करें।
    2. निम्नलिखित पीसीआर साइकिलिंग स्थितियों का उपयोग करें: पूर्व-डेनैचेशन के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; डेनैचेशन के लिए 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, एनीलिंग के लिए 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और विस्तार के लिए 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। 30 चक्र ों के पूरा होने के बाद, 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म करके अंतिम विस्तार चरण करें।
    3. 10 वी/सेमी के तहत 2% एगरेज जेल पर पीसीआर प्रोडक्ट चलाएं। सही आकार का एक बैंड [जैसे, 287 बीपी] को सकारात्मक माना जाता है।

8. SgRNA अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के अनुक्रम को मान्य करें

  1. रिवर्स प्राइमर बीबीएसआई-आर (चरण7.3 देखें) का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण 15 द्वारा पीसीआर सकारात्मक कॉलोनियों के अनुक्रम को सत्यापित करें। SgRNA ओलिगो डालने के स्थल के नीचे पर यह प्राइमर एनील्स। PX330-xCas9-T1 प्रोटोपेसर TGCCTTCTCCCCCCCCCCGCGG और xCas9 युक्त sgRNA अनुक्रम व्यक्त करने का निर्माण किया गया था ।
  2. सकारात्मक उपनिवेशों को अनुक्रम करने के लिए फॉरवर्ड प्राइमर टी1-एफ का उपयोग करें। आगे एक sgRNA ओलिगो के सम्मिलन साइट आसपास की साइट के लिए पूरी अनुक्रम जानकारी नहीं दे सकता है, क्योंकि 30-50 अनुक्रम प्राइमर के बाद बीपी टुकड़ा बिल्कुल बाहर नहीं पढ़ा जा सकता है ।

9. डुअल लूसिफेरेज रिपोर्टर वेक्टर का निर्माण

  1. संश्लेषण 300-500 बीपी डीएनए टुकड़े sgRNA लक्ष्य युक्त और यह डबल पाचन के माध्यम से एक दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर वेक्टर में उपकस्तर [उदाहरण के लिए, उपक्लोन ४४० बीपी भेड़ DKK2 एक्सॉन1 टुकड़ा पीएसए-डुअल प्लाज्मिड16,17 AscI और साली के साथ दोहरे पाचन का उपयोग करके, जिसके परिणामस्वरूप पीएसए-डुअल-डीके
  2. SgRNA लक्ष्यों से युक्त 300-500 बीपी डीएनए टुकड़े संश्लेषण । ध्यान दें कि डीएनए टुकड़ों के दृश्य जीनोमिक दृश्यों के कुछ हिस्से होने चाहिए, जिन्हें एनसीबीआई वेबसाइट (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) या संबंधित संदर्भों से प्राप्त किया जा सकता है।
  3. एक उपयुक्त ड्यूल लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर वेक्टर जैसे पीएसए-डुअल16, 17 (या दो वैक्टर क्रमशः जुगनू लूसिफ़ेरेस और रेनिला लूसिफ़ेरेस व्यक्त करते हैं) का चयन करें और फिर इस वेक्टर और डीएनए टुकड़ों को दो एंडोक्यूक्लिस जैसे एएससीआई और साली जैसे दो एंडोक्यूक्लिस के साथ बताया जाता है।
  4. अंत में T4 डीएनए Ligase के साथ इन दो टुकड़ों ligate, पीएसए-दोहरी लक्ष्य में जिसके परिणामस्वरूप । डबल पाचन और लिगामेंट के लिए विवरण क्रमशः तालिका 3 और तालिका 4में प्रदर्शित किए जाते हैं। यह उल्लेखनीय है कि रिपोर्टर वेक्टर को स्थिर बैक्टीरिया उपभेदों (जैसे Top10) में परिलक्षित किया जाना चाहिए, जिन्हें डीएनए पुनर्संयोजन से बचने के उद्देश्य से कम घूर्णन गति (आमतौर पर 200 आरपीएम से अधिक नहीं) के साथ सुसंस्कृत होने की सिफारिश की जाती है।

10. सेल ट्रांसफैक्शन

  1. ऊपर बताए गए वैक्टर के लिए एंडोटॉक्सिन-फ्री प्लाज्मिड निकालें। उपयुक्त उपकरणों का उपयोग करके प्लाज्मिड की शुद्धता और एकाग्रता का मूल्यांकन करें। इन प्लाज्मिड्स के लिए 500 एनजी/माइक्रोन से कम की अंतिम सांद्रता और अवशोषण 260/280 एनएम (A260/A280) पर 1.7-1.9 का शुद्धता अनुपात की सिफारिश की जाती है।
  2. समान अनुपात में प्लाज्मिड्स के साथ पीईसी18 जैसी उपयुक्त सेल लाइन को सह-ट्रांसेक्ट करें (उदाहरण के लिए, pX330-xCas9-T1: पीएसएसए-ड्यूल-डीकेके 2 = 1:1, 0.5 μg प्लाज्मिड प्रत्येक दोहराव के लिए जब 24 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करते हैं)। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में pX330-xCas9 जैसे एक खाली वेक्टर का उपयोग करें।
    1. ट्रांसफैक्शन से एक दिन पहले, 24-अच्छी संस्कृति प्लेट में प्लेट कोशिकाएं 2 x 105 कोशिकाओं/ 60-80% का संगम हासिल करने पर कोशिकाएं ट्रांसफेक्शन के लिए तैयार होंगी।
    2. ट्रांसफेक्शन टाइम पॉइंट से पहले, जितना संभव हो सुपरनेट को हटा दें और धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं के लिए ताजा मीडिया के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. 1:25 के अनुपात में DMEM मीडिया में पतला ट्रांसफेक्शन अभिकर्ण और अच्छी तरह से मिश्रण।
    4. डीएमईएम मीडिया के 25 माइक्रोन में डीएनए के 0.5 माइक्रोग्राम को कमजोर करके डीएनए का मास्टर मिश्रण तैयार करें, और फिर P3000 रिएजेंट के 1 माइक्रोन जोड़ें।
    5. पतला ट्रांसफेक्शन रिएजेंट (1:1 अनुपात) की प्रत्येक ट्यूब में पतला डीएनए जोड़ें।
    6. कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    7. कोशिकाओं में डीएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स के 50 माइक्रोन जोड़ें।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं। फिर, चरण 11 के रूप में संक्रमित कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

11. ड्यूल-लूसिफ़ेरेस डिटेक्शन

  1. 1x निष्क्रिय लाइसिस बफर (पीएलबी) की पर्याप्त मात्रा में 5x पीएलबी की 1 मात्रा को 4 वॉल्यूम आसुत पानी में जोड़कर तैयार करें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. 24-अच्छी संस्कृति प्लेटों में सुसंस्कृत कोशिकाओं की निष्क्रिय लाइसिस।
    1. सुसंस्कृत कोशिकाओं से विकास माध्यम निकालें, और धीरे-धीरे संस्कृति पोत की सतह को धोने के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) की पर्याप्त मात्रा लागू करें। अलग कोशिकाओं और अवशिष्ट विकास माध्यम को हटाने के लिए पोत संक्षेप में भंवर। पीएलबी रिएजेंट लगाने से पहले कुल्ला समाधान को पूरी तरह से हटा दें।
    2. सेल मोनोलेयर को पूरी तरह से कवर करने के लिए प्रत्येक संस्कृति में 1x पीएलबी के 100 माइक्रोन को अच्छी तरह से वितरित करें। संस्कृति प्लेटों को 20 मिनट के लिए खड़े होने दें।
    3. आगे की हैंडलिंग या स्टोरेज के लिए lysate को ट्यूब या शीशी में स्थानांतरित करें।
  3. आपूर्ति की लूसिफ़ेरेस परख बफर के 10 एमएल में प्रदान की गई ल्योफिलाइज्ड लूसिफ़ेरेस परख सब्सट्रेट को फिर से खर्च करके लूसिफ़ेरेस परख रिएजेंट (एलएएल) तैयार करें।
  4. ड्यूल-लूसिफेरेज रिपोर्टर परख (100 माइक्रोल रिएजेंट प्रति परख) की वांछित संख्या को करने के लिए पर्याप्त मात्रा तैयार करें। एक गिलास या सिलिकॉनाइज्ड पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्टॉप बफर के 50 वॉल्यूम में 50x स्टॉप सब्सट्रेट की 1 वॉल्यूम जोड़ें।
  5. दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर (डीएलआर) परख
    1. कार्यक्रम ल्यूमिनोमीटर एक 2 सेकंड पूर्व पढ़ने में देरी प्रदान करने के लिए, एक 10 सेकंड की माप अवधि के बाद ।
    2. DLR परख की वांछित संख्या को पूरा करने के लिए ल्यूसिफ़ेरेस परख के 100 माइक्रोन को ल्यूसिफ़ोमीटर ट्यूबों की उचित संख्या में रिएजेंट करें।
    3. सावधानी से सेल के 20 माइक्रोन को एलआर युक्त ल्यूमिनोमीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें; 2 या 3 बार पाइपिंग करके मिलाएं। ट्यूब को ल्यूमिनोमीटर में रखें और पढ़ना शुरू करें।
    4. ल्यूमिनोमीटर से नमूना ट्यूब निकालें, मिश्रण करने के लिए संक्षेप में स्टॉप रिएजेंट और भंवर के 100 माइक्रोल जोड़ें। ल्यूमिनोमीटर में नमूने को बदलें, और पढ़ना शुरू करें।
    5. जुगनू लूसिफ़ेरेस गतिविधि के लिए सामान्य रूप से रेनिला लूसिफ़ेरेस गतिविधि रिकॉर्ड करें, अर्थात् स्क्रीन पर प्रदर्शित अनुपात का पारस्परिक।
    6. प्रतिक्रिया ट्यूब को त्यागें, और अगले परख पर आगे बढ़ें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तरीके एसजीआरएनए और xCas9 अभिव्यक्ति वैक्टर के निर्माण के लिए और फिर अपेक्षाकृत अधिक जीन लक्ष्यीकरण क्षमता के साथ sgRNA oligos के अनुकूलन स्क्रीनिंग के लिए कर रहे हैं । यहां हम भेड़ DKK2 exon 1 करने के लिए 3 sgRNA लक्ष्यों का एक प्रतिनिधि उदाहरण प्रदर्शित करते हैं । SgRNA और xCas9 व्यक्त वैक्टररीढ़ (चित्रा 2)की पूर्वनिर्धारित करके बनाया जा सकता है और इसके बाद यह एनीलिंग ओलिगो जोड़े के माध्यम से कम डबल-स्ट्रैंड डीएनए टुकड़ों की एक श्रृंखला में लिगाइंग द्वारा बनाया जा सकता है। विशिष्ट प्राइमर जोड़े निर्देशित पीसीआर(चित्रा 3)के माध्यम से सकारात्मक कॉलोनियों का पता लगाया जा सकता है। भेड़ DKK2 exon 1 से एक ४४० बीपी डीएनए टुकड़ा ASCI और साली के साथ दोहरे पाचन का उपयोग करके पीएसए-दोहरी प्लाजा15 में उपसा किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप पीएसए-दोहरी-DKK2 । pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 और pX330-xCas9-T3 की जीन लक्ष्यीकरण क्षमताओं को सि्युटनसली(चित्रा 5)का पता लगाया गया था, और फिर अंतिम sgRNA वेक्टर अपेक्षाकृत बेहतर एक है, जो हम अगले कदम पर जीन संपादन अनुसंधान के लिए लेने के रूप में पहचान की गई थी ।

यह पता लगाने की विधि डीएनए काटने की दक्षता की निगरानी के लिए एक लूसिफ़ेरेस रिपोर्ट जीन के साथ एक एकल स्ट्रैंड एनीलिंग (एसएसए) तंत्र(चित्रा 1B और चित्रा 4)को जोड़ती है। जैसा कि चित्रा 4में दर्शाया गया है, एसएसए एक प्रक्रिया शुरू की गई है जब एक ही दिशा में उन्मुख दो दोहराए गए दृश्यों के बीच डबल स्ट्रैंड ब्रेक किया जाता है। एकल कतरा क्षेत्रों को ब्रेक के निकट बनाया जाता है जो दोहराए गए दृश्यों तक विस्तारित होते हैं ताकि पूरक किस्में एक दूसरे के लिए एनील कर सकें। इस एनीलिंग इंटरमीडिएट को एकल फंसे पूंछ को पचाने और अंतराल में भरने से संसाधित किया जा सकता है। ड्यूल-लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर जीन में मुख्य रूप से जुगनू फोटिनस पाइरालिस से और रेनिला रेनीफॉर्मिस (जिसे समुद्री पैन्सी के रूप में भी जाना जाता है) से लूसिफ़ेरेस जीन शामिल हैं। जुगनू और रेनिला लूसिफेरेस की गतिविधियों को एक ही नमूने से क्रमिक रूप से मापा जाता है। जब मान्यता क्षेत्र है कि समाप्ति codon अपने बीच में कटौती नहीं है, एसएसए प्रणाली में जीन अवरुद्ध है और एक कार्यात्मक प्रोटीन में अनुवाद नहीं किया जा सकता है । जब प्रसंस्करण होता है, तो एसएसए प्रणाली अपने आप समरूप अनुक्रम को मर्ज कर देगी, और ओवरलैपिंग अनुक्रम एक ही अनुक्रम बन जाता है, जीन की मरम्मत की जाती है और फिर एक कार्यात्मक प्रोटीन का उत्पादन करते हुए पढ़ा जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: क्लोनिंग प्रक्रिया के विभिन्न चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
(A)SgRNA वेक्टर निर्माण की योजनाबद्ध, फेंग झांग लैब के प्रोटोकॉल से अनुकूलित ।(B)दोहरी ल्यूसिफ़ेरेस रिपोर्टर वेक्टर बिल्डिंग के योजनाबद्ध (एक उदाहरण के रूप में वेक्टर पीएसए-डीकेके 2 का चयन), डीएनए टुकड़े आरएलयूसी-, आरएलयूसी-2 और आरयूसीयूसी-3 रेनिला ल्यूसिफेरेस के पूर्ण लंबाई कोडिंग अनुक्रम के तीन भागों का प्रतिनिधित्व करते हैं । एमसीएस "मल्टीपल क्लोनिंग साइट" का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: BbsI के साथ वेक्टर रीढ़ pX330-xCas9 Predigesting ।
1: डीएनए मार्कर, 2: pX330-xCas9 प्लाज्मिड, 3: pX330-xCas9 प्लाज्मिड BBSI के साथ पचा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: विशिष्ट प्राइमर जोड़े DKK2-T1 sgRNA वेक्टर का पता लगाने के लिए पीसीआर निर्देशित ।
लेन 1-7 अलग-अलग बैक्टीरिया कॉलोनियों के लिए पीसीआर बैंड को अलग-अलग इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एकल कतरा annealing (एसएसए) के लिए योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सेल लाइन PIEC में रिपोर्टर वेक्टर पीएसएसए-DKK2 के साथ दोहरी लूसिफ़ेरेस परख ।
रैनिला लूसिफ़ेरेस लूसिफ़ेरेस गतिविधियां काफी प्रेरित हैं (पीएंडटीटी;0.01, पीईसी में छात्र का टी टेस्ट) क्रमशः 3.15, 5.84 या 13.10 के गुना परिवर्तन के साथ pX330-xCas9-T2 या pX330-xCas9-T3 का अतिउपंत्रण द्वारा। त्रुटि सलाखों प्रत्येक समूह के लिए मानक विचलन (एसडी) (n= 3) का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम जीनोमिक डीएनए लक्ष्य (5'-3') sgRNA ओलिगोस (5'-3')
T1 TGCCTGCTCCCCCCCCCCGGGG T1-F: CACCGTGCCTTTCTCCCCCCCCCCGGC
T1-R: AAACGCGGCCAGTAAGCAGGCAC
टी2 एटेकाजीटीसीसीटीसीसीटीसीजी T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTCTGGGGGG
T2-R: AAACCCGCCCAAGAAGAGATACTTGATC
टी 3 GCCCGGGCTGCCGAACTGG T3-F: CACCGCCCGGGCTGCCGAACTG
T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGGGGC

तालिका 1: भेड़ DKK2 के जीन संपादन के लिए डिज़ाइन किए गए sgRNA लक्ष्य और ओलिगोस।

पीसीआर कंपोनेंट 25 माइक्रोल प्रतिक्रिया
10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर (जैसे टी 1-एफ) 1 माइक्रोल
10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर बीबीएसआई-आर 1 माइक्रोल
10x पीसीआर बफर 2.5 माइक्रोन
2.5 एमएम डीएनटीपीएस 1 माइक्रोल
बैक्टीरियल फ्लूइड 1 माइक्रोल
डीएनए टैक पॉलीमरेज 2.5 यूनिट
नाभिक मुक्त पानी 25 माइक्रोल तक

तालिका 2: सकारात्मक बैक्टीरियल कॉलोनियों का पता लगाने के लिए पीसीआर मिश्रण।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन
पीएसए-डुअल वेक्टर (संश्लेषित डीएनए टुकड़ा या पीसीआर उत्पाद) 1-2 माइक्रोन
कटस्मार्ट बफर 5 माइक्रोन
एएससीआई 1 माइक्रोल
साली-एचएफ 1 माइक्रोल
आसुत जल 50 माइक्रोल तक
कुल मात्रा 50 माइक्रोन

तालिका 3: पीएसए-डुअल वेक्टर और संश्लेषित डीएनए टुकड़ा (या पीसीआर उत्पाद) का दोहरा पाचन।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन
पीएसए-डुअल वेक्टर (प्रीडिगेस्टेड) 0.5 माइक्रोग्राम
डीएनए टुकड़े sgRNA लक्ष्य युक्त (predigested) 0.2 माइक्रोग्राम
T4 डीएनए लिगाज़ बफर (10x) 1 माइक्रोल
T4 डीएनए लिगाज़ 1 माइक्रोल
आसुत जल 10 माइक्रोल तक
कुल मात्रा 10 माइक्रोल

तालिका 4: डीएनए के टुकड़ों की एक लिगेशन प्रतिक्रिया जिसमें sgRNA एक पूर्वनिर्धारित पीएसएसए-डुअल वेक्टर में लक्ष्य होता है।

चरण 1: अभिकर् ता तैयारी
ट्रांसफैक्शन रीएजेंट 2 माइक्रोन

तालिका 5: 24 अच्छी प्लेट में सेल ट्रांसफैक्शन का विवरण।

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Discussion

हमारे यहां वर्णित एसजीआरएनए वेक्टर क्लोनिंग प्रक्रियाएं एसजीआरएनए के कुशल उत्पादन की सुविधा प्रदान करती हैं, जिसमें अधिकांश लागत ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ऑर्डरिंग और वेक्टर अनुक्रमण से प्राप्त होती है। जबकि उल्लिखित विधि उपयोगकर्ताओं को CRISPR/Cas9 के साथ उपयोग के लिए sgRNAs उत्पन्न करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन की गई है, प्रोटोकॉल को आसानी से Cas9 ऑर्थोलॉग या अन्य आरएनए-निर्देशित एंडोन्यूक्लियस जैसे Cpf1 के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, वेक्टर बैकबोन और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ओवरहैंगिंग दृश्यों में मामूली संशोधनों को पेश करना।

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल उचित रूप से डिजाइन किए गए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ शुरू करते समय 10 दिनों में एक पसंदीदा एसजीआरएनए लक्ष्य प्रदान करेगा। इसमें एसजीआरएनए डिजाइन (1 एच, चरण 1 - 2), कमजोर पड़ने, एलिकोट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (30 मिनट, चरण 3), sgRNA अभिव्यक्ति वेक्टर (3 घंटे, चरण 4) का पाचन और शुद्धिकरण, एक पूर्वनिर्धारित खाली वेक्टर (रात, चरण 5 - 6) में sgRNA ओलिगोन्यूक्लियॉटाइड्स की क्लोनिंग, कालोनियों का पीसीआर डिटेक्शन (4-5 एच, चरण 7) और sgRNA अभिव्यक्ति के अनुक्रम का सत्यापन (24 एच , चरण 8)। इस बीच, दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर वेक्टर का निर्माण और अनुक्रम सत्यापन 5 - 7 डी (चरण 9) लेता है। सेल लाइन, प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन और ड्यूल लूसिफ़ेरेस डिटेक्शन की तैयारी लगभग 48 एच (चरण 10 - 11) लेती है। प्रत्येक प्लाज्मिड पैदा करने के लिए विफलता दर लगभग 0 हैं।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम बीबीएसआईजैसे एंजाइमों द्वारा एसजीआरएनए वेक्टर का प्रतिबंधात्मक एंजाइम पाचन है। यदि पाचन पर्याप्त नहीं है, तो बैक्टीरिया उपनिवेशों की सकारात्मक दर बहुत कम हो सकती है। जबकि पीसीआर आधारित पहचान दृष्टिकोण संवेदनशीलता से पाचन दक्षता और सकारात्मक दर की निगरानी कर सकता है। फॉरवर्ड प्राइमर, पूर्व में डाला sgRNA टुकड़ा के आगे ओलिगोस के रूप में इस्तेमाल किया, सही सम्मिलन और खाली वैक्टर के अत्यधिक प्रभावी अंतर सुनिश्चित किया । इस रणनीति के फायदों में से एक डीएनए अनुक्रमण से पहले पीसीआर द्वारा सकारात्मक कॉलोनियों का कुशल पता लगाना है। जैसा कि ऊपर कहा गया है, पीसीआर की तुलना में अनुक्रम सत्यापन अभी भी अपेक्षाकृत अधिक महंगा है, खासकर जब बीबीएसआई का अधूरा पाचन होता है। संसाधन बचत के मामले में, हमने पीसीआर प्रवर्धन के लिए अनुक्रमण प्राइमर बीबीएसआई-आर के साथ sgRNA टुकड़ा एनीलिंग (जैसे टी 1-एफ, टी-एफ या टी 3-एफ) के लिए फॉरवर्ड ओलिगोस को जोड़ा। कॉलोनी की पहचान के लिए इस रणनीति के माध्यम से लैब में 500 से अधिक एसजीआरएनए वैक्टर का सफलतापूर्वक निर्माण किया गया है।

प्रोटोकॉल की एक और योग्यता दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके उम्मीदवार sgRNA लक्ष्यों का प्रभावी पूर्व चयन है। विभिन्न एसजीआरएनएलक्ष्योंपर कार्यकुशलता में कटौती का भारी अंतर वास्तव में मौजूद है . T7E1 परख या सर्वेयर नाभिक परख1 द्वारा एक अत्यधिक कुशल sgRNA लक्ष्य की पहचान करने के लिए एक मुश्किल से ट्रांसफेक्ट सेल लाइन में समय और श्रम लेने वाला है । इसके अलावा, T7E1 परख या सर्वेयर नाभिक परख में पीसीआर प्रवर्धन के लिए, उपयुक्त प्राइमर जोड़े 1 की कमी के कारण जीनोम डीएनए में लक्ष्य अनुक्रम को विशेष रूप से बढ़ानाकभी-कभीमुश्किल होता है। इसके विपरीत, दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर परख जीनोम प्रवर्धन प्रक्रियाओं से स्वतंत्र है। पहले हम इस विधि का उपयोग अत्यधिक सक्रिय एसजीआरएनए16,19प्राप्त करने के लिएकरते थे.

इस काम में वर्णित विधि के स्पष्ट फायदों के बावजूद, कुछ सीमाएं भी हैं जिन्हें इंगित किया जाना चाहिए। हालांकि यह सफलता की एक उच्च दर सुनिश्चित करता है, sgRNA चयन के लिए लूसिफ़ेरेस आधारित विधि अंय दृष्टिकोण (सर्वेयर/उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण, आदि) के लिए लक्ष्य अनुक्रम संश्लेषण की आवश्यकता के कारण अधिक महंगा हो सकता है । इसके अलावा, यह दृष्टिकोण रिपोर्टर प्लाज्मिड क्लोन करने की आवश्यकता के कारण इन वैकल्पिक तरीकों में से किसी से भी तेज नहीं है यदि जीन लक्ष्यीकरण के लिए एक आसान-से-ट्रांसफेक्ट सेल लाइन आयोजित की जाएगी। यह स्पष्ट करना भी आवश्यक है कि विधि नॉकआउट बनाने के लिए उपयुक्त है लेकिन विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड को संपादित करने के लिए नहीं। इसके अतिरिक्त, केवल डबल फंसे ब्रेक और एकल फंसे ब्रेक का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को शेंडोंग प्रांत (चीन), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31301936) के प्रथम श्रेणी चरागाह विज्ञान अनुशासन कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था, 31572383), लोक हित में कृषि वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए विशेष कोष (201403071), राष्ट्रीय जोखिम आकलन दुग्ध उत्पाद की गुणवत्ता और सुरक्षा की प्रमुख विशेष परियोजना (GJFP201800804) और चिंगदाओ पीपुल्स लाइवलीहुड साइंस एंड टेक्नोलॉजी (19-6-1-68-एनएसएच, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument LongGene A200 Target gene amplification
AscI restriction enzymes New England Biolabs R0558V Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme New England Biolabs R0539S Cutting target vectors
Clean workbench AIRTECH SW-CJ-2FD/VS-1300L-U A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells TaKaRa K613 Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System Promega E1910 Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath Sanfa Scientific Instruments DK-S24 Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. DYY-6C Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2 Eppendorf China Ltd. Reference 2 Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. WD-9413B For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer Promega E5311 Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge BMH sigma 3K15 Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator Sanfa Scientific Instruments SHP-160 Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar Sangon Biotech A507003-0250 For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit Thermo Fisher L3000015 DNA Transfection
SalI restriction enzymes New England Biolabs R3138V Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit Sangon Biotech B518131-0050 Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit Sangon Biotech B518191-0100 Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202V Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 TaKaRa 9761 DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer JIBIMED LS-50LD High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. SHZ-82 Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 166 CRISPR सिंगल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) जीन एडिटिंग डुअल लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर सिस्टम सिंगल स्ट्रैंड एनीलिंग पीसीआर बेस्ड डिटेक्शन
CRISPR प्लाज्मिड्स का निर्माण और एक दोहरी लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर सिस्टम के माध्यम से स्तनधारी कोशिकाओं में नॉकआउट दक्षता का पता लगाना
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Li, H., Qin, H., Zhang, N., Zhao,… More

Li, H., Qin, H., Zhang, N., Zhao, J., Xin, J., Perez-Campo, F. M., Liu, H. Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System. J. Vis. Exp. (166), e59639, doi:10.3791/59639 (2020).

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