Summary
Hier presenteren we een protocol dat een gestroomlijnde methode beschrijft voor het efficiënt genereren van plasmiden die zowel het CRISPR-enzym als het bijbehorende single guide RNA (sgRNAs) uitdrukken. Co-transfectie van zoogdiercellen met deze sgRNA / CRISPR vector en een dubbele luciferase reporter vector die dubbelstreng breuk reparatie onderzoekt maakt evaluatie van knock-out efficiëntie.
Abstract
Hoewel zeer efficiënt, wijziging van een genomic site door de CRISPR enzym vereist de generatie van een sgRNA uniek voor de doelsite (s) vooraf. Dit werk beschrijft de belangrijkste stappen die leiden tot de bouw van efficiënte sgRNA-vectoren met behulp van een strategie die het mogelijk maakt de positieve kolonies efficiënt te detecteren door PCR voorafgaand aan DNA-sequencing. Aangezien een efficiënte genoombewerking met behulp van het CRISPR-systeem een zeer efficiënte sgRNA vereist, is een voorselectie van kandidaat-sgRNA-doelen noodzakelijk om tijd en moeite te besparen. Een dubbele luciferase reporter systeem is ontwikkeld om knock-out efficiëntie te evalueren door het onderzoeken van double-strand break reparatie via single strand annealing. Hier gebruiken we dit reportersysteem om het gewenste xCas9/sgRNA-doel op te pikken van kandidaat-sgRNA-vectoren voor specifieke genbewerking. Het geschetste protocol biedt binnen 10 dagen een voorkeur sgRNA/CRISPR enzymvector (te beginnen met de juiste ontworpen oligonucleotiden).
Introduction
De CRISPR sgRNAs bestaan uit een 20-nucleotide sequentie (de protospacer), die complementair is aan de genomische doelvolgorde1,2. Hoewel zeer efficiënt, vereist het vermogen van het CRISPR/Cas-systeem om een bepaalde genomische site te wijzigen de generatie van een vector die een efficiënte sgRNA draagt die uniek is voor de doellocatie(s)2. Dit artikel beschrijft de belangrijkste stappen in het genereren van die sgRNA-vector.
Voor succesvolle genoombewerking met behulp van het CRISPR/Cas-systeem is het gebruik van zeer efficiënte sgRNAs een cruciale voorwaarde3,4,5. Aangezien de nucleases die worden gebruikt bij genoombewerking, verschillende efficiëntieverbeteringen bij verschillende gerichte loci1,is een voorselectie van kandidaat-sgRNA-doelstellingen noodzakelijk om tijd en moeite te besparen6,7,8,9. Een dubbele luciferase reporter systeem is ontwikkeld om knock-out efficiëntie te evalueren door het onderzoeken van double-strand break reparatie via single strand annealing3,10. Hier gebruiken we dit reporter systeem om een voorkeur CRISPR sgRNA doel te kiezen uit verschillende kandidaat sgRNA vectoren ontworpen voor specifieke genbewerking. Het hier vermelde protocol is de afgelopen jaren geïmplementeerd in onze groep en samenwerkende laboratoria om CRISPR-sgRNAS te genereren en te evalueren.
Het volgende protocol vat samen hoe geschikte sgRNA te ontwerpen via netwerksoftware. Zodra de geschikte sgRNAs zijn geselecteerd, beschrijven we de verschillende stappen om de vereiste oligonucleotiden te verkrijgen, evenals de aanpak voor het invoegen van de gepaarde oligonucleotiden in de pX330-xCas9 expressievector. We presenteren ook een methode voor het assembleren van sgRNA-expressing en dual luciferase reporter vectoren op basis van de ligatie van deze sequenties in een voorverterde expressie vector (stappen 2-10, Figuur 1A). Tot slot beschrijven we hoe de DNA-snijefficiëntie voor elk van de sgRNAs (stap 11-12) te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA oligonucleotide ontwerp
- Ontwerp sgRNAs met behulp van online tools zoals de Cas-Designer online tool (http://www.rgenome.net/cas-designer/). De PAM-sequentie is belangrijk op basis van de Cas9 die wordt gebruikt. Voor xCas9 zijn de relevante PAM-sequenties NG en kan de voormalige verwezen Cas-Designer online tool xCas9 relevante sgRNAS genereren.
- Gebruik sgRNA-ontwerptools die algoritmen omvatten voor on- en off-target voorspelling (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. Een score van 0,2 of hoger heeft de voorkeur.
- Selecteer maximaal 3 genbewerkingsdoelen voor een optimale screening (bijvoorbeeld T1, T2 en T3 zijn ontworpen voor schapen DKK2 exon 1 gentargeting [Tabel 1]).
2. Wijziging van oligonucleotide
- Om de sgRNA oligonucleotide te wijzigen, verwijdert u het aangrenzende motief 3'-NG (PAM), waarbij de protospacer-sequentie behouden blijft (bijvoorbeeld de beginreeks voor T1: TGCCTCTCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Voeg de pentanucleotide CACCG toe aan de 5'-einde van de oligo.
OPMERKING: Na ligatie van het pX330-xCas9 skelet, zal deze sequentie de 3'-end van de U6-promotor bevatten die sgRNA-transcriptie motiveert. De array "CACC" garandeert dat de oligo overeenkomt met de uitsteeklengten van de BbsI-verteerde pX330-xCas9 plasmid. De basis "G" is een voorwaarde van RNA Polymerase III promotors en garandeert de effectieve opstarten van sgRNA transcriptie (bijvoorbeeld, het toevoegen van de 5'-CACCG array aan de protospacer van T1, het bereiken van T1-F: CACCGTCTGCTCCTACTGGCCGC [25 NT]). De decolleté-efficiëntie van 21 nt gRNA verschilt aanzienlijk van die van 20 nt gRNA1,12,13,14. Het wordt over het algemeen aangeraden om 20 nt met 5'-G te gebruiken door het genereren van een kortere protospacer, als dit niet mogelijk is dan kan 21 nt met extra 5'-G worden gebruikt. - Maak een omgekeerde aanvulling (rc) van de protospacer sequentie.
OPMERKING: De rc van de T1 protospacer is bijvoorbeeld GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Toe te rekenen AAAC aan de 5'-end van de rc protospacer sequentie. Plaats een extra C aan de 3'-end van de rc protospacer.
OPMERKING: De "AAAC" sequentie zorgt ervoor dat de oligonucleotide geschikt is om te klonen in de BbsI-verteerde pX330-xCas9 plasmide. De aanvullende "C"op de 3'end is essentieel voor annealing met de initiërende "G" voor de sgRNA transcriptie hierboven beschreven (bijvoorbeeld AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] is de laatste oligonucleotide sequentie voor T1 rc protospacer). - Bestel de oligonucleotiden.
3. Oligonucleotide annealing
- Verdun lyophilized oligonucleotiden tot een uiteindelijke concentratie van 10 μM in dubbel gedestilleerd water (ddH2O).
- Meng oligonucleotiden naar voren en achteruit in een dunne wand-PCR-buis met een 1:1-verhouding (bijvoorbeeld 20 μL per stuk) zonder extra buffer toe te voegen.
- Broed het mengsel gedurende 5 minuten op 95 °C en raast vervolgens 10 min naar 72 °C. Volg met een afkoelingsperiode op kamertemperatuur (RT) bestaande uit het eenvoudig verwijderen van het monster uit de PCR-machine en het plaatsen van het op RT.
OPMERKING: Het is niet nodig om de oligonucleotidemengsels te fosforyleren om de ligatie te vergemakkelijken.
4. sgRNA/CRISPR vectorvertering
- Verprevert 1 μg van de geselecteerde pX330-xCas9 vector met BbsI (10 enzymeenheden per 1 μg plasmide) gedurende 2 uur bij 37 °C (figuur 2). Voer de vertering van de pX330-xCas9 sgRNA expressievector uit in een totaal volume van 50 μL, met 5 μL 10x spijsverteringsbuffer en gedestilleerd water om het uiteindelijke volume te bereiken.
- Zuiver de verteerde vector door bandextractie uit een 2% agarosegel onder 10 V/cm en zuiver vervolgens met behulp van een silicakolom met behulp van een commerciële gelextractiekit.
5. Ligatie van de geannealed sgRNA oligonucleotiden aan de expressievector
- Meng de geannealed sgRNA oligonucleotiden (5 μL van het mengsel vanaf stap 4) met de BbsI-verteerde pX330-xCas9 vector (gezuiverd, 100 ng).
- Voeg 1 μL ligase en 1 μL 10x ligase buffer toe.
- Voeg gedestilleerd water toe met het juiste volume, tot 10 μL.
- Incubeer 's nachts bij 4 °C.
6. Competente celtransformatie
- Haal e. coli DH5α-bevoegde cellen uit de opslag bij -80 °C en ontdooi het op ijs.
- Voeg 5 μL van het ligatiemengsel toe aan 50 μL van de bevoegde E. coli DH5α en houd het mengsel 30 minuten op ijs.
- Verwarm het mengsel op 42 °C voor 90 s.
- Laat het 2 minuten op ijs rusten.
- Herstel de cultuur op een roterende shaker in 500 μL LB-media voor 1 h bij 37 °C.
- Plaat 200 μL van de cultuur op een ampicilline weerstand LB agaroseplaat en incubatie het 's nachts bij 37 °C.
7. Identificatie van de juiste recombinant plasmiden door PCR
- Kies 5 tot 10 bacteriële kolonies uit de LB-plaat en gebruik elk van hen om een 1,5 mL buis met 1 mL LB-media met 60 mg/mL ampicilline in te enten.
- Broed de buizen op een roterende shaker voor 2-3 h.
- Voer detectie uit van correcte recombinant plasmiden met behulp van specifieke primerparen voor de sgRNA oligonucleotiden [bijvoorbeeld voorwaartse primer voor T1 sgRNA expression vector constructie (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, reverse primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, het produceren van een 287 bp amplicon (figuur 3)].
- Bereid het PCR-mengsel(tabel 2) voor.
- Gebruik de volgende PCR-fietsomstandigheden: 95 °C gedurende 5 minuten voor pre-denaturatie; 30 cycli van 95 °C voor 30 s voor denaturatie, 60 °C voor 30 s voor annealing en 72 °C voor 30 s voor uitbreiding. Na de 30 cycli zijn voltooid, voert u een laatste uitbreidingsstap uit door 5 min te verwarmen bij 72 °C.
- Voer het PCR-product uit op een 2% agarose gel onder de 10 V/cm. Een band op de juiste grootte [bijvoorbeeld 287 bp] wordt als positief beschouwd.
8. Valideer de volgorde van sgRNA expressie plasmide
- Controleer de volgorde van PCR positieve kolonies door Sanger sequencing15 met behulp van de omgekeerde primer BbsI-R (zie stap 7.3). Deze primer anneals op de site stroomafwaarts van de sgRNA oligo insert. De pX330-xCas9-T1 uitdrukken sgRNA sequentie met protospacer TGCCTGCCTACTGGGG EN xCas9 werd gebouwd.
- Gebruik de voorwaartse primer T1-F om de positieve kolonies te sequencen. De voorwaartse kon niet geven volledige sequentie informatie voor de site rond de invoeging site van de sgRNA oligo, omdat 30-50 bp fragment na de sequencing primer kon niet precies worden uitgelezen.
9. Bouw van dubbele luciferase reporter vector
- Synthetiseer 300-500 bp DNA-fragmenten met de sgRNA-doelen en subclone het in een dubbele luciferase reporter vector door middel van dubbele spijsvertering [bijvoorbeeld, subclone 440 bp schapen DKK2 exon1 fragment in pSSA-Dual plasmid16,17 met behulp van dubbele spijsvertering met AscI en SalI, resulterend pSSA-Dual-DKK2].
- Synthetiseer 300-500 bp DNA fragmenten met de sgRNA doelen. Merk op dat de sequenties van de DNA-fragmenten delen van de genomische sequenties moeten zijn, die kunnen worden verkregen op de NCBI-website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) of gerelateerde referenties.
- Selecteer een geschikte dubbele luciferase reporter vector zoals pSSA-Dual16,17 (of twee vectoren uitdrukken firefly luciferase en renilla luciferase respectievelijk) en vervolgens verteren deze vector en de DNA-fragmenten hierboven vermeld met twee endonucleases zoals AscI en SalI.
- Ten slotte ligate deze twee fragmenten met T4 DNA Ligase, wat resulteert in pSSA-Dual-Target. Details voor dubbele vertering en ligatie worden weergegeven in respectievelijk tabel 3 en tabel 4. Het is vermeldenswaard dat de reporter vector moet worden versterkt in stabiele bacteriën stammen (zoals Top10), die worden aanbevolen om te worden gekweekt met een lagere rotatiesnelheid (meestal niet meer dan 200 rpm), met het oog op het vermijden van DNA recombinatie.
10. Celtransfectie
- Extract endotoxinevrije plasmiden voor vectoren hierboven vermeld. Evalueer de zuiverheid en concentratie van de plasmiden met behulp van geschikte instrumenten. Voor deze plasmiden worden een eindconcentratie van maar liefst 500 ng/μL en een zuiverheidsverhouding van 1,7-1,9 bij absorptie van 260/280 nm (A260/A280) aanbevolen.
- Co-transfect een geschikte cellijn zoals PIEC18 met de plasmiden in gelijke verhouding (bijvoorbeeld pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmid voor elke duplicatie bij gebruik van 24 putplaat). Gebruik een lege vector zoals pX330-xCas9 als negatief besturingselement.
- Een dag voor de transfectie, plaatcellen in een 24-well kweekplaat bij een dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Cellen zullen klaar zijn voor transfectie wanneer ze een samenvloeiing van 60-80% bereiken.
- Verwijder voor het transfectietijdpunt de supernatant zoveel mogelijk en voeg voorzichtig 0,5 mL verse media toe voor elke put.
- Verdun transfectiereagens in DMEM-media met een verhouding van 1:25 en meng goed.
- Bereid de mastermix van DNA voor door 0,5 μg DNA in 25 μL DMEM-media te verdunnen en voeg vervolgens 1 μL P3000-reagens toe.
- Voeg verdund DNA toe aan elke buis van verdund transfectiereagens (1:1-verhouding).
- Incubeer gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 50 μL DNA-lipidecomplex toe aan cellen.
- Incubeercellen voor 24 uur bij 37 °C. Analyseer vervolgens transfected cellen zoals in stap 11.
11. Dual-luciferase detectie
- Bereid een voldoende hoeveelheid van de 1x passieve lyse buffer (PLB) door 1 volume van 5x PLB toe te voegen aan 4 volumes gedestilleerd water en meng goed.
- Passieve lysis van cellen gekweekt in 24-well cultuurplaten.
- Verwijder het groeimedium uit de gekweekte cellen en breng voorzichtig een voldoende volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan om het oppervlak van het kweekvat te wassen. Draai het vat kort om losstaande cellen en restgroeimedium te verwijderen. Verwijder de spoeloplossing volledig voordat u PLB-reagens aanbrengt.
- Doe 100 μL 1x PLB in elke cultuur goed om de celmonolaag volledig te bedekken. Laat de cultuurplaten 20 minuten staan.
- Breng het lysaat over op een buis of flesje voor verdere behandeling of opslag.
- Bereid luciferase assay reagens (LAR) voor door het voorziene lyophilized luciferase assay substraat in 10 mL van de meegeleverde luciferase testbuffer opnieuw in te dienen.
- Bereid een voldoende volume voor om het gewenste aantal dual-luciferase reporter tests uit te voeren (100 μL reagens per test). Voeg 1 volume van 50x stopsubstraat toe aan 50 volumes stopbuffer in een glas of geconsliceerde polypropyleenbuis.
- Dual-luciferase reporter (DLR) test
- Programmeer luminometers om een voorgelezen vertraging van 2 seconden te bieden, gevolgd door een meetperiode van 10 seconden.
- Predispense 100 μL luciferase assay reagens in het juiste aantal luminometerbuizen om het gewenste aantal DLR Assays te voltooien.
- Breng voorzichtig tot 20 μL cellysaat over in de luminometerbuis met LAR; meng door pipetting 2 of 3 keer. Plaats de buis in de luminometer en start met meten.
- Verwijder de monsterbuis van de luminometer, voeg 100 μL stopreagens toe en draaikolk kort om te mengen. Vervang het monster in de luminometer en start meten.
- Nota van de renilla luciferase activiteit genormaliseerd tot de firefly luciferase activiteit, namelijk de wederkerigheid van de verhouding weergegeven op het scherm.
- Gooi de reactiebuis weg en ga naar de volgende test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in dit protocol beschreven methoden zijn voor de bouw van sgRNA- en xCas9-expressievectoren en vervolgens voor de optimalisatiescreening van sgRNA-oligo's met relatief hogere gentargeting-efficiëntie. Hier tonen we een representatief voorbeeld van 3 sgRNA doelen aan schapen DKK2 exon 1. SgRNA en xCas9 uitdrukken vectoren kunnen worden gebouwd door het voorverteren van de vector ruggengraat (Figuur 2) gevolgd door het ligating in een reeks van korte double-streng DNA fragmenten door het gloeien oligo paren. De positieve kolonies kunnen worden gedetecteerd door middel van specifieke primer paren geleide PCR(figuur 3). Een 440 bp DNA fragment van schapen DKK2 exon 1 werd subcloned in pSSA-Dual plasmid15 met behulp van dubbele spijsvertering met AscI en SalI, wat resulteert in pSSA-Dual-DKK2. De gen gericht capaciteiten van pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 en pX330-xCas9-T3 werden simutanusly gedetecteerd (Figuur 5), en vervolgens de laatste sgRNA vector werd geïdentificeerd als de relatief betere, die we oppikken voor schapen gen bewerken onderzoek bij de volgende stap.
Deze detectiemethode combineert een enkelstreng annealing (SSA) mechanisme(figuur 1B en figuur 4) met een luciferase rapportgen om de efficiëntie van DNA-snijmethoden te monitoren. Zoals geïllustreerd in figuur 4, SSA is een proces gestart wanneer een dubbele streng pauze wordt gemaakt tussen twee herhaalde sequenties georiënteerd in dezelfde richting. Er worden enkele strengen gemaakt naast de pauzes die zich uitstrekken tot de herhaalde sequenties, zodat de complementaire strengen aan elkaar kunnen worden verbonden. Deze annealing intermediate kan worden verwerkt door het verteren van de enkele gestrande staarten en het invullen van de gaten. Het Dual-Luciferase Reporter gen omvat voornamelijk de luciferase genen van de vuurvlieg Photinus pyralis en van Renilla reniformis (ook bekend als zeepansy). De activiteiten van vuurvlieg en renilla luciferases worden achtereenvolgens gemeten uit één monster. Wanneer het herkenningsgebied met de beëindigingscodon niet in het midden wordt gesneden, wordt het gen in het SSA-systeem geblokkeerd en kan het niet worden vertaald in een functioneel eiwit. Wanneer de verwerking plaatsvindt, zal het SSA-systeem de homologe sequentie automatisch samenvoegen en worden overlappende sequenties één sequentie, gen wordt recombinatie gerepareerd en kan vervolgens worden gelezen tijdens het produceren van een functioneel eiwit.
Figuur 1: Schematische weergave van de verschillende stappen van het klonen.
(A) Schematisch van sgRNA vectorbouw, aangepast aan de protocollen van Feng Zhang Lab. (B) Schematisch van dual luciferase reporter vector building (select vector pSSA-DKK2 als voorbeeld), DNA-fragmenten Rluc-, Rluc-2 en Rluc-3 vertegenwoordigen drie delen van full-length codering sequentie van Renilla luciferase. MCS staat voor "multiple cloning site". Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Predigesting the vector backbone pX330-xCas9 with BbsI.
1: DNA Marker, 2: pX330-xCas9 plasmid, 3: pX330-xCas9 plasmid verteerd met BbsI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Specifieke primerpars geleide PCR voor DKK2-T1 sgRNA vectordetectie.
Lanes 1-7 geven PCR-banden voor 7 verschillende bacteriën kolonies afzonderlijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Schema's voor single strand annealing (SSA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Dual luciferase test met reporter vector pSSA-DKK2 in cellijn PIEC.
De Ranilla luciferase luciferase activiteiten worden aanzienlijk geïnduceerd (P<0.01, Student's t-test) in PIEC door pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 of pX330-xCas9-T3 te overbesteden met de vouwwissel van respectievelijk 3,15, 5,84 of 13,10. De foutbalken geven standaarddeviaties (SD)(n=3) voor elke groep aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam | Genomic DNA Targets (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGAGAC | ||||
| T2 | ATCAAGCTCTCTGGGGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGCGGGC | ||||
Tabel 1: sgRNA-doelen en oligo's die zijn ontworpen voor genbewerking van schapen DKK2.
| PCR-component | 25 μL reactie |
| 10 μM Forward Primer (bijv. T1-F) | 1 μL |
| 10 μM Reverse Primer BbsI-R | 1 μL |
| 10x PCR-buffer | 2,5 μL |
| 2,5 mM dNVP's | 1 μL |
| bacteriële vloeistof | 1 μL |
| DNA Taq Polymerase | 2,5 stuks |
| Nuclease-vrij water | Tot 25 μL |
Tabel 2: PCR mengsel voor positieve bacteriële kolonies detectie.
| Reagens | Volume |
| pSSA-Dual Vector (gesynthetiseerd DNA-fragment of PCR-product) | 1-2 μg |
| CutSmart Buffer | 5 μL |
| Asci | 1 μL |
| Sali-HF | 1 μL |
| Gedestilleerd water | tot 50 μL |
| Totaal volume | 50 μL |
Tabel 3: Dubbele vertering van pSSA-Dual vector en gesynthetiseerd DNA fragment (of PCR product).
| Reagens | Volume |
| pSSA-Dual Vector(voorverteerd) | 0,5 μg |
| DNA-fragmenten die de sgRNA-doelen bevatten (voorverteerd) | 0,2 μg |
| T4 DNA Ligase Buffer (10x) | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| Gedestilleerd water | tot 10 μL |
| Totaal volume | 10 μL |
Tabel 4: Een ligatiereactie van DNA-fragmenten die de sgRNA-doelen bevatten in een voorverteerde pSSA-Dual vector.
| Stap 1: reagensvoorbereiding | |
| Transfectiereagens | 2 μL |
Tabel 5: Details van celtransfectie in een 24 putplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sgRNA vector klonen procedures die we hier hebben beschreven vergemakkelijkt een efficiënte productie van sgRNAs, met de meeste van de kosten afgeleid van de oligonucleotide bestellen en vector sequencing. Hoewel de geschetste methode is ontworpen om gebruikers in staat te stellen sgRNAs te genereren voor gebruik met CRISPR/Cas9, kan het protocol eenvoudig worden aangepast voor gebruik met Cas9-orthologues of andere RNA-geleide endonucleases zoals Cpf1, waarbij kleine wijzigingen worden aangebracht in de vectorbackbone en de oligonucleotide overhangende sequenties.
Het hierboven beschreven protocol biedt binnen 10 dagen een voorkeurssgRNA-doel wanneer u begint met de juiste oligonucleotiden. Dit omvat het sgRNA-ontwerp (1 h, stap 1 - 2), verdunning, aliquot en annealing van de oligonucleotiden (30 min, stap 3), vertering en zuivering van de sgRNA expressievector (3 h, stap 4), het klonen van de sgRNA oligonucleotiden in een voorverteerde lege vector ('s nachts, stap 5 - 6), de PCR-detectie van de kolonies (4-5 uur, stap 7) en de validatie van de volgorde van het sgRNA-expressie plasmid (24 uur , stap 8). Ondertussen, de bouw en volgorde validatie van dubbele luciferase reporter vector duurt 5 – 7 d (stap 9). De voorbereiding van de cellijn, plasmide transfectie en dubbele luciferase detectie duurt ongeveer 48 uur (stappen 10 - 11). De mislukking tarieven voor het genereren van elke plasmide zijn bijna 0.
De meest kritieke stap van het protocol is de beperkende enzymvertering van sgRNA-vector door enzymen zoals BbsI. Als de spijsvertering niet voldoende is, dan is de positieve snelheid van bactera kolonies zou kunnen zijn zeer laag. Terwijl de PCR-gebaseerde detectiebenadering de efficiëntie van de spijsvertering en de positieve snelheid gevoelig kan controleren. De voorwaartse primers, vroeger gebruikt als voorwaartse oligo's van het ingevoegde sgRNA-fragment, zorgden voor een zeer effectief onderscheid van juiste invoegingen en lege vectoren. Een van de voordelen van deze strategie is juist de efficiënte detectie van de positieve kolonies door PCR vóór DNA-sequencing. Zoals hierboven vermeld, sequentie verificatie is nog steeds relatief duurder in vergelijking met PCR, vooral wanneer onvolledige vertering van BbsI optreedt. In termen van resource saving, hebben we de voorwaartse oligo's voor sgRNA fragment annealing (zoals T1-F, T2-F of T3-F) gekoppeld aan de sequencing primer BbsI-R voor PCR versterking. Meer dan 500 sgRNA vectoren zijn met succes gebouwd in het lab door middel van deze strategie voor kolonie identificatie.
Een andere verdienste van het protocol is de effectieve voorselectie van kandidaat-sgRNA-doelen met behulp van een dubbel luciferase reporter-systeem. Enorme variantie van snijefficiëntie bestaat inderdaad op verschillende sgRNA-doelstellingen4. Het identificeren van een zeer efficiënt sgRNA-doel door T7E1-test of Surveyor nuclease-test1 in een moeilijk te transfecte cellijn is tijd en arbeid verbruikend. Bovendien is het voor PCR-versterking in de T7E1-test of Surveyor nuclease-test soms moeilijk om de doelsequentie in het genoom-DNA specifiek te versterken vanwege het ontbreken van geschikte primerparen1. In tegenstelling, de dubbele luciferase reporter test is onafhankelijk van genoom versterking procedures. Voorheen hebben we deze methode gebruikt om zeer actieve sgRNAs16,19te krijgen.
Ondanks de duidelijke voordelen van de methode die in dit werk wordt beschreven, zijn er ook enkele beperkingen die moeten worden opgemerkt. Hoewel het zorgt voor een hoog slagingspercentage, zou de op luciferase gebaseerde methode voor sgRNA-selectie duurder kunnen zijn dan andere benaderingen (landmeter/hoge-resolutie smeltanalyse, enz.) vanwege de noodzaak om de doelsequentie te synthetiseren. Bovendien is deze aanpak niet sneller dan een van deze alternatieve methoden als gevolg van de noodzaak om de reporter plasmid kloon als een gemakkelijk te transfecte cellijn zal worden uitgevoerd voor gen targeting. Het is ook noodzakelijk om te verduidelijken dat de methode geschikt is voor het maken van knock-outs, maar niet om specifieke nucleotiden te bewerken. Bovendien kunnen alleen dubbelstrengs pauzes en niet enkelstrengs pauzes worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door First Class Grassland Science Discipline Program van de provincie Shandong (China), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), het Speciaal Fonds voor Agro-wetenschappelijk Onderzoek in het Algemeen Belang (201403071), Nationaal risicobeoordeling groot speciaal project van kwaliteit en veiligheid van melkproducten (GJFP201800804) en projecten van Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
