Summary
هنا، نقدم بروتوكول يصف طريقة مبسطة لتوليد كفاءة البلازميدات التعبير عن كل من الانزيم CRISPR ودليل واحد المرتبطة RNA (sgRNAs). co-transfection من خلايا الثدييات مع هذا الناقل sgRNA / CRISPR وseiferase مزدوجة لوسيفيراز مراسل الناقل الذي يدرس مزدوجة حبلا كسر إصلاح يسمح بتقييم كفاءة خروج المغلوب.
Abstract
على الرغم من كفاءة عالية، تعديل موقع الجينوم من قبل انزيم CRISPR يتطلب توليد sgRNA فريدة من نوعها إلى الموقع المستهدف (المواقع) مسبقا. يصف هذا العمل الخطوات الرئيسية التي تؤدي إلى بناء ناقلات SgRNA فعالة باستخدام استراتيجية تسمح بالكشف الفعال للمستعمرات الإيجابية بواسطة PCR قبل تسلسل الحمض النووي. وبما أن تحرير الجينوم الفعال باستخدام نظام CRISPR يتطلب SgRNA عالية الكفاءة ، فإن الاختيار المسبق لأهداف SgRNA المرشحة ضروري لتوفير الوقت والجهد. وقد تم تطوير نظام مراسل luciferase مزدوجة لتقييم كفاءة خروج المغلوب من خلال دراسة إصلاح كسر حبلا مزدوجة عن طريق حبلا وحيد. هنا ، نستخدم نظام المراسل هذا لالتقاط الهدف المفضل xCas9/sgRNA من ناقلات sgRNA المرشحة لتحرير جينات محددة. وسيوفر البروتوكول المبين ناقل إنزيم SgRNA/CRISPR المفضل في 10 أيام (بدءًا من oligonucleotides المصمم بشكل مناسب).
Introduction
و CRISPR sgRNAs تضم تسلسل 20-النيوكليوتيدات (بروتوسبر), وهو مكمل لتسلسل الهدف الجينومي1,2. على الرغم من كفاءة عالية، فإن قدرة نظام CRISPR/Cas على تعديل موقع الجينوم معين يتطلب توليد ناقل يحمل sgRNA كفاءة فريدة من نوعها إلى الموقع المستهدف (ق)2. هذه الورقة تصف الخطوات الرئيسية في توليد هذا المتجه sgRNA.
لنجاح تحرير الجينوم باستخدام نظام CRISPR / Cas ، فإن استخدام sgRNAs عالية الكفاءة هو شرط أساسي حاسم3و4و5. منذ النوى المهندسة المستخدمة في تحرير الجينوم تظهر كفاءات متنوعة في مختلف loci المستهدفة1، واختيار مسبق من أهداف sgRNA مرشح ضروري من أجل توفير الوقت والجهد6،7،8،9. وقد تم تطوير نظام مراسل luciferase المزدوج لتقييم كفاءة خروج المغلوب من خلال دراسة إصلاح كسر حبلا مزدوجة عن طريق حبلا واحد التلاهم3,10. هنا نستخدم هذا النظام مراسل لاختيار هدف كريسبر SgRNA المفضل من مختلف ناقلات sgRNA مرشح مصممة لتحرير الجينات محددة. تم تنفيذ البروتوكول المذكور هنا في مجموعتنا والمختبرات المتعاونة على مدى السنوات القليلة الماضية لتوليد وتقييم SgRNAs كريسبر.
يلخص البروتوكول التالي كيفية تصميم sgRNA مناسبة من خلال برامج الشبكة. بمجرد تحديد sgRNAs مناسبة، ونحن وصف الخطوات المختلفة للحصول على oligonucleotides المطلوبة، فضلا عن نهج لإدراج oligonucleotides المقترنة في ناقلات التعبير pX330-xCas9. ونحن نقدم أيضا طريقة لتجميع sgRNA التعبير عن وseiferase مزدوجة ناقلات مراسل استنادا إلى ربط هذه التسلسلات في ناقلات التعبير قبل هضم (الخطوات 2-10، الشكل 1A). وأخيراً، فإننا نُصف كيفية تحليل كفاءة قطع الحمض النووي لكل من الـ sgRNAs (الخطوات 11-12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SGRNA oligonucleotide تصميم
- تصميم sgRNAs باستخدام أدوات على الإنترنت مثل أداة Cas-Designer عبر الإنترنت (http://www.rgenome.net/cas-designer/). تسلسل PAM مهم استناداً إلى Cas9 قيد الاستخدام. لxCas9 ، وتسلسل PAM ذات الصلة هي NG والسابق المشار إليها كاس مصمم أداة على الانترنت يمكن أن تولد xCas9 sgRNAs ذات الصلة.
- استخدام أدوات تصميم sgRNA التي تشمل خوارزميات للتنبؤ على وخارج الهدف (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. ويفضل درجة 0.2 أو أكبر.
- حدد ما يصل إلى 3 أهداف لتحرير الجينات لإجراء فحص أمثل (على سبيل المثال، T1 و T2 و T3 تم تصميمها لاستهداف جينات DKK2 EXON 1 [الجدول 1]).
2. تعديل أوليغونوكليوتيد
- لتعديل oligonucleotide sgRNA، حذف 3'-NG protospacer ازرفر المجاورة (بام)، والحفاظ على تسلسل protospacer (على سبيل المثال، تسلسل البداية لـ T1: TGCCTGCCTCTGGCCGC [20 nt]).
- إضافة خماسي ينوكليوتيد CACCG إلى 5'نهاية من oligo.
ملاحظة: عند الربط إلى الهيكل العظمي pX330-xCas9، سوف يحتوي هذا التسلسل على 3'-نهاية المروج U6 تحفيز النسخ sgRNA. مجموعة "CACC" يضمن أن oligo هو مطابقة مع التراكمات من pX330-xCas9 يبسي هضم. القاعدة "G" هو شرط مسبق للرنا بوليميراز الثالث المروجين ويضمن بدء التشغيل الفعال للنسخ sgRNA (على سبيل المثال، إلحاق 5'CACCG صفيف إلى protospacer من T1، وتحقيق T1-F: CACCGTGCGCGCCTCTCTCCCTGC [25 nt]). إن كفاءة الانقسام 21 NT GRNA يختلف بشكل كبير عن 20 NT GRNA1,12,13,14. ينصح عموما لاستخدام 20 NT مع 5'-G عن طريق توليد protospacer أقصر، إذا لم يكن ذلك ممكنا ثم 21 NT مع 5 إضافية'-G يمكن استخدامها. - إنشاء تكملة عكسي (rc) من تسلسل protospacer.
ملاحظة: على سبيل المثال، RC من protospacer T1 هو GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - إلحاق AAAC إلى 5 'نهاية تسلسل protospacer rc. إلحاق ج إضافية إلى 3 'نهاية protospacer rc.
ملاحظة: يضمن تسلسل "AAAC" أن oligonucleotide مناسب للاستنساخ في pX330-xCas9 Bbsi هضم. "ج" إضافية على 3'-نهاية ضروري لالحن مع بدء "G" ل النسخ sgRNA المذكورة أعلاه (على سبيل المثال، AAACGCGGCCAGTAGGAGGGCAC [25 nt] هو تسلسل oligonucleotide النهائي ل T1 rc protospacer). - اطلبي القلاغوت
3. أوليغونوكليوتيد الصلب
- تخفيف القلة القل سنوية الميوفيلية إلى تركيز نهائي 10 ميكرومتر في الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
- مزيج إلى الأمام وعكس oligonucleotides في جدار رقيقة أنبوب PCR maintaning نسبة 1:1 (على سبيل المثال، 20 ميكرولتر لكل من) دون إضافة أي عازلة إضافية.
- احتضان الخليط في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم منحدر إلى أسفل درجة الحرارة إلى 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. اتبع مع فترة التبريد في درجة حرارة الغرفة (RT) تتكون من مجرد إزالة العينة من آلة PCR ووضعها في RT.
ملاحظة: ليس من الضروري أن تُفسّر خلائط القلونويكلوتيد لتسهيل الربط.
4. sgRNA / CRISPR هضم ناقلات
- اجسّغ 1 ميكروغرام من متجه pX330-xCas9 المحدد مع BbsI (10 وحدات من الإنزيم لكل 1 ميكروغرام من البلازميد) لـ 2 ساعة عند 37 درجة مئوية(الشكل 2). إجراء عملية الهضم من pX330-xCas9 sgRNA التعبير ناقلات في حجم إجمالي 50 ميكرولتر, تحتوي على 5 ميكرولتر من 10x الهضم العازلة والمياه المقطرة لتحقيق حجم النهائي.
- تنقية ناقلات هضم بواسطة استخراج الفرقة من هلام agarose 2٪ تحت 10 V / سم وتنقية في وقت لاحق باستخدام عمود السيليكا باستخدام مجموعة استخراج هلام التجارية.
5. ربط من القلة sgRNA oligonucleotides إلى ناقلات التعبير
- اخلطي حمض sgRNA القلوي (5 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 4) مع المتجه pX330-xCas9 المهضم ببيساي (المنقي، 100 نانوغرام).
- إضافة 1 ميكرولتر من الرباط و 1 ميكرولتر من 10x عازلة.
- إضافة الماء المقطر مع حجم مناسب، تصل إلى 10 ميكرولتر.
- احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
6. تحويل الخلايا المختصة
- إخراج الخلايا المختصة E. coli DH5α من التخزين عند -80 درجة مئوية وذوبانها على الجليد.
- أضف 5 ميكرولتر من مزيج الربط إلى 50 ميكرولتر من الإشريكية القولونية المختصة DH5α والاحتفاظ بالخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- سخني الخليط عند 42 درجة مئوية لمدة 90 درجة مئوية.
- بقية على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- استعادة الثقافة على شاكر دوارة في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام LB لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- لوحة 200 μL من الثقافة على مقاومة ampicillin LB ازهري لوحة واحتضانه بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
7. تحديد البلازميدات المؤتلفة الصحيحة بواسطة PCR
- اختيار 5 إلى 10 مستعمرات بكتيرية من لوحة LB واستخدام كل واحد منهم لتطعيم أنبوب واحد 1.5 مل تحتوي على 1 مل من وسائل الاعلام LB مع 60 ملغم / مل أمبيسيلين.
- احتضان الأنابيب على شاكر دوار لمدة 2-3 ساعة.
- تنفيذ الكشف عن البلازميدات المؤتلفة الصحيحة باستخدام أزواج التمهيدي محددة لـ sgRNA oligonucleotides [على سبيل المثال، التمهيدي الأمامي لبناء ناقلات التعبير T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTCTCTCTCCGC، التمهيدي العكسي (BbsI-R): AAAGTCCCTCTGGTCGTTAC، وإنتاج 287 bplicon (الشكل 3)).
- تحضير خليط PCR(الجدول 2).
- استخدام شروط ركوب الدراجات PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ل مرحلة ما قبل denaturation; 30 دورات من 95 درجة مئوية ل 30 s لdenaturation، 60 درجة مئوية ل 30 s للحن، و 72 درجة مئوية ل 30 s للتمديد. بعد الانتهاء من 30 دورات، تنفيذ خطوة التمديد النهائي عن طريق التدفئة لمدة 5 دقائق في 72 درجة مئوية.
- تشغيل المنتج PCR على 2٪ agarose هلام تحت 10 V/cm. ويعتبر النطاق في الحجم المناسب [على سبيل المثال، 287 bp] إيجابية.
8. التحقق من صحة تسلسل التعبير sgRNA plasmid
- تحقق من تسلسل مستعمرات PCR الإيجابية بواسطة سانجر تسلسل15 باستخدام التمهيدي العكسي BbsI-R(راجع الخطوة 7.3). هذا التمهيدي الصلب في الموقع المصب من إدراج هتكوري sgRNA. تم بناء pX330-xCas9-T1 التعبير عن تسلسل sgRNA تحتوي على protospacer TGCCTGCCTCTCTGGCCGCGG وxCas9.
- استخدام التمهيدي إلى الأمام T1-F لتسلسل المستعمرات الإيجابية. لا يمكن أن تعطي إلى الأمام واحدة معلومات تسلسل كاملة للموقع المحيط موقع الإدراج من oligo sgRNA، لأن 30-50 bp جزء بعد التمهيدي تسلسل لا يمكن أن تقرأ بالضبط.
9. بناء ثنائي لوسيفيراز مراسل ناقلات
- توليف 300-500 BP شظايا الحمض النووي التي تحتوي على أهداف sgRNA و subclone إلى ناقل مراسل لوسيفيراز المزدوج من خلال الهضم المزدوج [على سبيل المثال، subclone 440 BP الأغنام DKK2 exon1 جزء في pSSA-Dual plasmid16،17 باستخدام الهضم المزدوج مع AscI وسالى، مما أدى إلى PSSA-Dual-DKK2].
- توليف 300-500 شظايا الحمض النووي BP التي تحتوي على أهداف sgRNA. لاحظ أن تسلسل أجزاء الحمض النووي يجب أن يكون أجزاء من التسلسلات الجينومية، والتي يمكن الحصول عليها من موقع NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) أو المراجع ذات الصلة.
- حدد مناسبة مزدوجة لوسيفيراز مراسل ناقلات مثل PSSA-Dual16،17 (أو اثنين من ناقلات التعبير عن لوسيفراز اليراعات ورينيلا لوسيفراز على التوالي) ومن ثم هضم هذا الناقل وشظايا الحمض النووي المذكورة أعلاه مع اثنين endonucleases مثل AscI وسالى.
- أخيرا ligate هذه الشظايا اثنين مع T4 الحمض النووي Ligase، مما أدى إلى pSSA-الهدف المزدوج. يتم عرض تفاصيل الهضم المزدوج واللبل في الجدول 3 والجدول 4، على التوالي. ومن الجدير بالذكر أن ناقلات المراسل ينبغي أن تضخّم في سلالات البكتيريا المستقرة (مثل Top10)، والتي يوصى بزرعها بسرعة دورانية أقل (عادة لا تزيد عن 200 دورة في الدقيقة)، لغرض تجنب إعادة التكتّن في الحمض النووي.
10. خلية نقل
- استخراج البلازميدات الخالية من الـ endotoxin للمواتجهات المذكورة أعلاه. تقييم نقاء وتركيز البلازميدات باستخدام أدوات مناسبة. ويوصى بتركيز نهائي لا يقل عن 500 نانوغرام/ميكرولتر ونسبة نقاء 1.7-1.9 عند الامتصاص 260/280 نانومتر (A260/A280) لهذه البلازميدات.
- شارك في نقل خط خلية مناسب مثل PIEC18 مع البلازميدات في نسبة متساوية (على سبيل المثال، pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1، 0.5 ميكروغرام بلاسميد لكل ازدواجية عند استخدام 24 لوحة جيدة). استخدام ناقل فارغ مثل pX330-xCas9 كتحكم سالب.
- قبل يوم واحد من transfection، خلايا لوحة في لوحة ثقافة 24-جيدا في كثافة 2 × 105 خلايا / جيدا. وستكون الخلايا جاهزة لتحول الدم عندما تحقق التقاء 60-80٪.
- قبل نقطة الوقت transfection، إزالة ناظر أكبر قدر ممكن وإضافة بلطف 0.5 مل من وسائل الإعلام الطازجة لكل بئر.
- تخفيف كاشف transfection في وسائل الاعلام DMEM في نسبة 1:25 ومزيج جيد.
- إعداد مزيج رئيسي من الحمض النووي عن طريق تخفيف 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي في 25 ميكرولتر من وسائل الاعلام DMEM، ثم إضافة 1 ميكرولتر من كاشف P3000.
- إضافة الحمض النووي المخفف إلى كل أنبوب من كاشف transfection المخفف (نسبة 1:1).
- احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 50 ميكرولتر من الحمض النووي الدهون المعقدة إلى الخلايا.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية. ثم، تحليل الخلايا المُصابة كما في الخطوة 11.
11. الكشف المزدوج لوسيفراز
- إعداد كمية كافية من 1x السلبي تحلل العازلة (PLB) عن طريق إضافة 1 حجم من 5x PLB إلى 4 كميات من الماء المقطر وخلط جيدا.
- تحلل سلبي من الخلايا المستزرعة في لوحات ثقافة 24-well.
- إزالة متوسطة النمو من الخلايا المستزرعة، وتطبيق بلطف كمية كافية من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لغسل سطح وعاء الثقافة. دوامة السفينة لفترة وجيزة لإزالة الخلايا المنفصلة ومتوسطة النمو المتبقية. إزالة تماما حل شطف قبل تطبيق كاشف PLB.
- الاستغناء 100 μL من 1x PLB في كل ثقافة بشكل جيد لتغطية الخلية تماما monolayer. دع لوحات الثقافة تقف لمدة 20 دقيقة.
- نقل lysate إلى أنبوب أو قارورة لمزيد من التعامل معها أو تخزينها.
- إعداد كاشف luciferase (LAR) عن طريق resuspending المقدمة مُقدس luciferase مُقدَّمًا في 10 مل من مخزن فحص luciferase المورد.
- إعداد حجم مناسب لأداء العدد المطلوب من مزدوجة لوسيفايراس المراسلة المقايسة (100 μL الكاشف لكل مُسَاَنَة). إضافة 1 حجم الركيزة 50x وقف إلى 50 وحدات تخزين من وقف العازلة في الزجاج أو سيليكون أنابيب البولي بروبلين.
- ثنائي لوسيفراز مراسل (DLR) مقايسة
- برنامج المقاييس الضوئية لتوفير تأخير ما قبل القراءة 2 ثانية، تليها فترة قياس 10 ثانية.
- Predispense 100 μL من كاشف luciferase في العدد المناسب من أنابيب luminometer لإكمال العدد المطلوب من DLR Assays.
- نقل بعناية تصل إلى 20 ميكرولتر من الخلية lysate في أنبوب مضيئة تحتوي على LAR; مزيج من الأنابيب 2 أو 3 مرات. ضع الأنبوب في المضيء وابدأ القراءة.
- إزالة أنبوب عينة من مضيئة، إضافة 100 ميكرولتر من كاشف وقف ودوامة لفترة وجيزة لخلط. استبدل العينة في المضيء، ثم ابدأ القراءة.
- سجل نشاط رينيلا لوسيفراز تطبيعها إلى نشاط لوسيفراز اليراعات، وهي تبادلية من نسبة المعروضة على الشاشة.
- تجاهل أنبوب رد الفعل، والمضي قدما في الفحص المقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأساليب المبينة في هذا البروتوكول هي لبناء ناقلات التعبير sgRNA وxCas9 ومن ثم للفحص الأمثل من oligos sgRNA مع زيادة نسبيا الجينات استهداف الكفاءة. هنا نعرض مثالا تمثيليا من أهداف 3 sgRNA للخراف DKK2 exon 1. SgRNA و xCas9 التعبير عن يمكن أن يبنى ناقلات قبل هضم العمود الفقري ناقلات(الشكل 2)تليها ربط ذلك في سلسلة من شظايا قصيرة مزدوجة حبلا الحمض النووي من خلال أزواج القلة. ويمكن الكشف عن المستعمرات الإيجابية من خلال أزواج التمهيدي محددة موجهة PCR(الشكل 3). تم وضع جزء من الحمض النووي 440 BP من الأغنام DKK2 exon 1 تحت الملابس الفرعية في pSSA-Dual plasmid15 باستخدام الهضم المزدوج مع AscI و SalI ، مما أدى إلى PSSA-Dual-DKK2. تم الكشف عن قدرات استهداف الجينات pX330-xCas9-T1، pX330-xCas9-T2 وpX330-xCas9-T3 بشكل سيزاز(الشكل 5)،ومن ثم تم تحديد آخر متجه sgRNA على أنه أفضل نسبيا، والتي نلتقطها لأبحاث تحرير جينات الأغنام في الخطوة التالية.
هذا الكشف عن طريقة تجمع بين وحيد حبلا الضم (SSA) آلية(الشكل 1B والشكل 4)مع تقرير لوسيفيراز الجينات من أجل رصد كفاءة خفض الحمض النووي. كما هو موضح في الشكل 4، SSA هي عملية بدأت عندما يتم إجراء كسر حبلا مزدوج بين تسلسلين المتكررة الموجهة في نفس الاتجاه. يتم إنشاء مناطق حبلا واحد المتاخمة للفواصل التي تمتد إلى تسلسل المتكررة حتى يمكن خيوط تكميلية متهاد لبعضها البعض. يمكن معالجة هذا الوسيط الصلب عن طريق هضم ذيول واحدة الذين تقطعت بهم السبل وملء الثغرات. جين مراسل ثنائي لوسيفراز يشمل أساسا الجينات luciferase من اليراعات Photinus pyralis ومن رينيفورميس رينايلا (المعروف أيضا باسم pansy البحر). يتم قياس أنشطة اليراعات ورينيلا لوسيفراس بشكل متسلسل من عينة واحدة. عندما لا يتم قطع منطقة التعرف على أن له إنهاء كودون في منتصفها، يتم حظر الجين في نظام SSA ولا يمكن ترجمته إلى بروتين وظيفي. عندما تتم المعالجة، فإن نظام SSA دمج تسلسل متجانسة تلقائيا، وتسلسل متداخلة يصبح تسلسل واحد، الجينات يحصل على إصلاح إعادة التركيب ويمكن بعد ذلك قراءة في جميع أنحاء إنتاج البروتين وظيفية.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لمختلف خطوات عملية الاستنساخ.
(أ)التخطيطي للبناء ناقلات sgRNA، مقتبس من بروتوكولات مختبر فنغ تشانغ.(ب) التخطيطي من ثنائي luciferase ناقلات بناء المراسل (حدد ناقلات PSSA-DKK2 كمثال)، شظايا الحمض النووي Rluc-، Rluc-2 وRluc-3 تمثل ثلاثة أجزاء من كامل طول تسلسل الترميز رينيها luciferase. يمثل MCS "موقع استنساخ متعددة". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الهدغ المسبق لعمود الفقر المتجه pX330-xCas9 مع BBSI.
1: ماركر الحمض النووي، 2: pX330-xCas9 plasmid، 3: pX330-xCas9 plasmid هضم مع BBSI. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أزواج التمهيدي محددة موجهة PCR للكشف عن ناقلات DKK2-T1 SgRNA.
تشير الممرات 1-7 إلى نطاقات PCR لـ 7 مستعمرات بكتيريا مختلفة بشكل منفصل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التخطيطات لقطّر واحد (SSA). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقايسة لوسيفيراز المزدوجة مع مراسل ناقلات PSSA-DKK2 في خط الخلية PIEC.
يتم إحداث أنشطة لوسيفراز رانيلا لوسيفيراز بشكل كبير (P<0.01, اختبار الطالب t) في PIEC عن طريق الإفراط في الإفراط في pX330-xCas9-T1، pX330-xCas9-T2 أو pX330-xCas9-T3 مع تغيير أضعاف 3.15، 5.84 أو 13.10، على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية (SD) (n =3) لكل مجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | أهداف الحمض النووي الجينومي (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTGGCCGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGCTCTCTGGGCGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | مجلس التعاون الخليجيCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCGCGCGCGC | ||||
الجدول 1: أهداف sgRNA و oligos مصممة لتحرير الجينات من الأغنام DKK2.
| مكون PCR | 25 ميكرولتر رد فعل |
| 10 ميكرومتر تمهيدي أمامي (على سبيل المثال T1-F) | 1 ميكرولتر |
| 10 μM عكس التمهيدي BbsI-R | 1 ميكرولتر |
| 10x PCR العازلة | 2.5 ميكرولتر |
| 2.5 mM dNTPs | 1 ميكرولتر |
| السائل البكتيري | 1 ميكرولتر |
| الحمض النووي طق بوليميراز | 2.5 وحدات |
| مياه خالية من النوى | حتى 25 ميكرولتر |
الجدول 2: خليط PCR للكشف عن المستعمرات البكتيرية الإيجابية.
| الكاشف | حجم |
| PSSA-ثنائي المتجه (تجزئة الحمض النووي المركب أو منتج PCR) | 1-2 ميكروغرام |
| مخزن كصّة مؤقت | 5 ميكرولتر |
| AscI | 1 ميكرولتر |
| سالي-HF | 1 ميكرولتر |
| الماء المقطر | حتى 50 ميكرولتر |
| الحجم الإجمالي | 50 ميكرولتر |
الجدول 3: الهضم المزدوج لـ pSSA-Dual vector وجزئ الحمض النووي المركب (أو منتج PCR).
| الكاشف | حجم |
| pSSA-ثنائي المتجه (قبل هضم) | 0.5 ميكروغرام |
| شظايا الحمض النووي التي تحتوي على أهداف sgRNA (هضم) | 0.2 ميكروغرام |
| T4 الحمض النووي Ligase العازلة (10x) | 1 ميكرولتر |
| T4 الحمض النووي Ligase | 1 ميكرولتر |
| الماء المقطر | حتى 10 ميكرولتر |
| الحجم الإجمالي | 10 ميكرولتر |
الجدول 4: تفاعل ربط لشظايا الحمض النووي التي تحتوي على أهداف الحمض النووي الريبي (SgRNA) في متجه pSSA-Dual تم هضمه مسبقاً.
| الخطوة 1: إعداد الكاشف | |
| كاشف نقل | 2 ميكرولتر |
الجدول 5: تفاصيل نقل الخلايا في لوحة 24 بئر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إجراءات استنساخ ناقلات sgRNA التي وصفناها هنا تسهل الإنتاج الفعال للـ sgRNAs ، مع معظم التكاليف المستمدة من طلب القلة وترتيب ناقلات. في حين أن الطريقة الموضحة مصممة للسماح للمستخدمين بتوليد sgRNAs للاستخدام مع CRISPR/Cas9 ، يمكن بسهولة تكييف البروتوكول للاستخدام مع تقويم Cas9 أو غيرها من عمليات الاستندق الموجهة من قبل RNA مثل Cpf1 ، وإدخال تعديلات طفيفة على العمود الفقري للنواقل وتسلسلات معلقة فوق القلووكليوتيدات.
وسيوفر البروتوكول المبين أعلاه هدفا مفضلا من الـ sgRNA في 10 أيام عندما يبدأ بـ oligonucleotides المصممة بشكل مناسب. وهذا يشمل تصميم sgRNA (1 ح، والخطوات 1-2)، وتخفيف، aliquot وحن من oligonucleotides (30 دقيقة، الخطوة 3) ، والهضم وتنقية متجه التعبير sgRNA (3 ح ، الخطوة 4) ، واستنساخ oligonucleotides sgRNA في ناقل فارغ قبل هضم (بين عشية وضحاها ، والخطوات 5- 6) ، وكشف PCR للمستعمرات (4-5 ح ، الخطوة 7) والتحقق من تسلسل التعبير sgRNA plasmid (24 ساعة) ، الخطوة 8). وفي الوقت نفسه، فإن التحقق من صحة البناء والتسلسل من ناقل مراسل لوسيفيراز المزدوج يأخذ 5 - 7 د (الخطوة 9). إعداد خط الخلية، transfection plasmid والكشف عن لوسيفيراز المزدوج تأخذ حوالي 48 ساعة (الخطوات 10-11). معدلات الفشل لتوليد كل بلازميد ما يقرب من 0.
الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هو الهضم الانزيم التقييدية من متجه sgRNA بواسطة الإنزيمات مثل BBSI. إذا كان الهضم غير كاف، ثم المعدل الإيجابي للمستعمرات البكتيريا قد تكون منخفضة جدا. في حين أن نهج الكشف PCR القائم يمكن أن ترصد بحساسية كفاءة الهضم ومعدل إيجابي. ال التمهيدية إلى الأمام، التي كانت تستخدم سابقا كأكية أمامية من جزء sgRNA المدرجة، ضمان التمييز فعالة للغاية من الإدراجات الحق والمواقل الفارغة. واحدة من مزايا هذه الاستراتيجية هي على وجه التحديد الكشف الفعال للمستعمرات الإيجابية بواسطة PCR قبل تسلسل الحمض النووي. وكما ذكر أعلاه، فإن التحقق من التسلسل لا يزال أكثر تكلفة نسبيا مقارنة بال PCR، خاصة عندما يحدث هضم غير كامل لـ BBSI. من حيث توفير الموارد، قمنا بإقران oligos إلى الأمام لتجزئة sgRNA (مثل T1-F، T2-F أو T3-F) مع التمهيدي تسلسل BbsI-R لتضخيم PCR. وقد تم بنجاح أكثر من 500 ناقلات sgRNA في المختبر من خلال هذه الاستراتيجية لتحديد مستعمرة.
ومن المزايا الأخرى للبروتوكول الاختيار المسبق الفعال لأهداف المرشحين من وكالة الممارسات الجنسية باستخدام نظام مراسلي لوسيفيراز المزدوج. تباين كبير من خفض الكفاءة موجود بالفعل في أهداف SgRNA مختلفة4. لتحديد هدف SgRNA عالية الكفاءة من قبل T7E1 مقايسة أو مساحنيات المقايسة 1 في خط خلية يصعب نقلها هو الوقت والمستهلكة للعمل. وبالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لتضخيم PCR في مقايسة T7E1 أو مقايسة النوى مساح، فإنه من الصعب في بعض الأحيان لتضخيم التسلسل المستهدف تحديدا في الحمض النووي الجينوم بسبب عدم وجود أزواج التمهيدي مناسبة1. وعلى النقيض من ذلك، فإن مقايسة مراسل لوسيفراز الثنائية مستقلة عن إجراءات تضخيم الجينوم. سابقا لقد استخدمنا هذا الأسلوب للحصول على sgRNAs نشطة للغاية16،19.
وعلى الرغم من المزايا الواضحة للأسلوب الموصوف في هذا العمل، هناك أيضا بعض القيود التي يجب الإشارة اِيضْرها. على الرغم من أنه يضمن معدل نجاح عال، فإن الطريقة القائمة على لوسيفيراز لاختيار sgRNA المقترحة يمكن أن تكون أكثر تكلفة من النهج الأخرى (مساح / تحليل تذوب عالية الدقة، الخ) نظرا للحاجة إلى توليف تسلسل الهدف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج ليس أسرع من أي من هذه الطرق البديلة نظرا للحاجة إلى استنساخ plasmid مراسل إذا كان سيتم إجراء خط خلية سهلة إلى transfect لاستهداف الجينات. ومن الضروري أيضا توضيح أن الأسلوب هو مناسبة لجعل خروج المغلوب ولكن ليس لتحرير النيوكليوتيدات محددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم فواصل مزدوجة فقط وفواصل لم تقطعت بها السبل واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع من قبل الدرجة الأولى برنامج العلوم في الأراضي العشبية من مقاطعة شاندونغ (الصين)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31301936، 31572383)، الصندوق الخاص للبحوث الزراعية العلمية في المصلحة العامة (201403071)، وتقييم المخاطر الوطنية المشروع الخاص الرئيسي لجودة وسلامة منتجات الحليب (GJFP201800804) ومشاريع تشينغداو سبل العيش للشعب العلم والتكنولوجيا (19-6-1-68-nsh، 14-2-3-45-nsh، 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
