Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver en strömlinjeformad metod för effektiv generering av plasmider som uttrycker både CRISPR-enzymet och tillhörande single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection av däggdjursceller med denna sgRNA/ CRISPR vektor och en dubbel luciferase reporter vektor som undersöker dubbel-strand bryta reparation möjliggör utvärdering av knockout effektivitet.
Abstract
Även om det är mycket effektivt, kräver modifiering av en genomisk plats av CRISPR-enzymet att det förr förr för framgjà cks att en sgRNA som är unik fà ng till målplatsen/sarna Ã"ngsãrst. Detta arbete beskriver de viktigaste stegen som leder till byggandet av effektiva sgRNA-vektorer med hjälp av en strategi som möjliggör effektiv detektering av de positiva kolonierna genom PCR före DNA-sekvensering. Eftersom effektiv genomredigering med hjälp av CRISPR-systemet kräver ett mycket effektivt sgRNA, är ett förval av kandidat-sgRNA-mål nödvändigt för att spara tid och ansträngning. En dubbel luciferase reporter system har utvecklats för att utvärdera knockout effektivitet genom att undersöka dubbel-strand bryta reparation via enda strand glödgning. Här använder vi detta reportersystem för att plocka upp det föredragna xCas9/sgRNA-målet från kandidat sgRNA-vektorer för specifik genredigering. Det protokoll som beskrivs kommer att ge en föredragen sgRNA / CRISPR enzym vektor i 10 dagar (börjar med lämpligt utformade oligonukleotider).
Introduction
CRISPR sgRNAs omfattar en 20-nukleotidsekvens (protospacern), som kompletterar den genomiskamålsekvensen 1,2. Även om det är högeffektivt kräver CRISPR/Cas-systemets förmåga att modifiera en given genomisk plats generering av en vektor som bär på ett effektivt sgRNA som är unikt för målplatsen(med)2. Detta dokument beskriver de viktigaste stegen i genereringen av den sgRNA-vektorn.
För framgångsrik genomredigering med hjälp av CRISPR/Cas-systemet är användningen av högeffektiva sgRNAs en avgörande förutsättning3,4,5. Eftersom konstruerade nukleaser som används i genomet redigering uppenbart olika effektivitetsvinster på olika riktade loci1, en pre-urval av kandidat sgRNA mål är nödvändigt för att spara tid och ansträngning6,7,8,9. En dubbel luciferase reporter system har utvecklats för att utvärdera knockout effektivitet genom att undersöka dubbel-strand bryta reparation via enda strand glödgning3,10. Här använder vi detta reportersystem för att välja ett föredraget CRISPR sgRNA-mål från olika kandidat-sgRNA-vektorer som utformats för specifik genredigering. Det protokoll som anges här har implementats i vår grupp och samarbetande laboratorier under de senaste åren för att generera och utvärdera CRISPR sgRNAs.
I följande protokoll sammanfattas hur man utformar lämpliga sgRNA genom nätverksprogramvara. När de lämpliga sgRNAs är valda, beskriver vi de olika stegen för att erhålla de nödvändiga oligonukleotider samt tillvägagångssättet för att infoga de parade oligonukleotider i pX330-xCas9 uttryck vektor. Vi presenterar också en metod för montering av sgRNA-uttryck och dubbla luciferas reportervektorer baserade på ligering av dessa sekvenser i en predigested uttryck vektor (steg 2-10, Figur 1A). Slutligen beskriver vi hur man analyserar DNA-skäreffektiviteten för var och en av sgRNAs (steg 11-12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA oligonukleotid design
- Design sgRNAs med hjälp av online-verktyg såsom Cas-Designer online verktyg (http://www.rgenome.net/cas-designer/). PAM-sekvensen är viktig baserat på att Cas9 används. För xCas9 är de relevanta PAM-sekvenserna NG och det tidigare hänvisade Cas-Designer-onlineverktyget kan generera xCas9 relevanta sgRNAs.
- Använd sgRNA-designverktyg som omfattar algoritmer för prognos på och utanför målet (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. En poäng på 0,2 eller mer är att föredra.
- Välj upp till 3 genredigeringsmål för en optimal screening (t.ex. T1, T2 och T3 utformades för får DKK2 exon 1-geninriktning [Tabell 1]).
2. Oligonukleotid modifiering
- För att modifiera sgRNA oligonukleotiden, radera 3'-NG protospacer intilliggande motiv (PAM), hålla protospacer sekvens (t.ex. startsekvens för T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Lägg pentanucleotide CACCG till 5'-slutet av oligo.
OBS: Vid ligering till pX330-xCas9 skelettet kommer denna sekvens innehålla 3'-slutet av U6 promotorn motiverande sgRNA transkription. Matrisen "CACC" garanterar att oligo matchar med överhäng av BbsI-smält pX330-xCas9 plasmid. Basen "G" är en förutsättning för RNA Polymerase III initiativtagare och garanterar en effektiv start av sgRNA transkription (t.ex., appending den 5'-CACCG array till protospacer av T1, uppnå T1-F: CACCGTCTGCCCTCCTACTGGCC [25 nt]). Klyvningseffektiviteten för 21 nt gRNA skiljer sig avsevärt från den för 20 nt gRNA1,12,13,14. Det är allmänt rekommenderas att använda 20 nt med 5'-G genom att generera en kortare protospacer, om detta inte är möjligt då 21 nt med extra 5'-G kan användas. - Skapa ett omvänt komplement (rc) av protospacer-sekvensen.
OBS: Till exempel är rc av T1 protospacer GCGGCCAGTAGGAGCAGGCACA (20 nt). - Append AAAC till 5'-änden av sekvensen rc protospacer. Bifoga ytterligare ett C till 3'-end av rc protospacer.
OBS: sekvensen "AAAC" säkerställer att oligonukleotiden är lämplig för kloning till den BbsI-rötade pX330-xCas9-plasmiden. Den ytterligare"C"på 3'-end är avgörande för glödgning med inledande "G" för sgRNA transkriptionen som beskrivs ovan (t.ex. är AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCGCGCAC [25 nt] den slutliga oligonukleotide sekvensen för T1 rc protospacer). - Beställ oligonukleotider.
3. Oligonukleotid glödgning
- Späd lyophilized oligonucleotides till en slutlig koncentration av 10 μM i dubbeldestillerat vatten (ddH2O).
- Blanda framåt och bakåt oligonukleotider i en tunn vägg PCR-rör maintaning en 1:1-förhållande (t.ex. 20 μL vardera) utan att lägga till någon extra buffert.
- Inkubera blandningen vid 95 °C i 5 min och ramp sedan ner temperaturen till 72 °C i 10 min. Följ upp med en avkylningsperiod vid rumstemperatur (RT) bestående av att helt enkelt ta bort provet från PCR-maskinen och placera det vid RT.
OBS: Det är inte nödvändigt att fosforylera oligonukleotidblandningarna för att underlätta ligeringen.
4. sgRNA/CRISPR vektor matsmältning
- Digest 1 μg av den valda pX330-xCas9-vektorn med BbsI (10 enzymenheter per 1 μg plasmid) i 2 h vid 37 °C (Figur 2). Genomföra rötning av pX330-xCas9 sgRNA-uttrycksvektorn i en total volym på 50 μL, innehållande 5 μL av 10x rötningsbuffert och destillerat vatten för att uppnå den slutliga volymen.
- Rena den smälta vektorn genom bandutdragning från en 2% agarosgel under 10 V/cm och därefter rena med hjälp av en kiseldioxidkolonn med hjälp av en kommersiell gelextraktionssats.
5. Ligering av den glödgade sgRNA oligonukleotider till uttrycket vektor
- Blanda de glödgade sgRNA-oligonukleotiderna (5 μL av blandningen från steg 4) med den BBSI-rötade pX330-xCas9-vektorn (renad, 100 ng).
- Tillsätt 1 μL av ligase och 1 μL av 10x ligase buffert.
- Tillsätt destillerat vatten med lämplig volym, upp till 10 μL.
- Inkubera över natten vid 4 °C.
6. Kompetent celltransformation
- Ta ut E. coli DH5α kompetenta celler från lagring vid -80 °C och tina den på is.
- Tillsätt 5 μL av ligeringsmixen till 50 μL av kompetent E. coli DH5α och håll blandningen på is i 30 min.
- Värme chock blandningen vid 42 °C i 90 s.
- Vila den på is i 2 min.
- Återvinna kulturen på en roterande shaker i 500 μL av LB-massmedia för 1 h på 37 °C.
- Plätera μL 200 av kulturen på en ampicillin motstånds- LB-agarose pläterar och inkuberar det över natten på °C 37.
7. Identifiering av de korrekta rekombinanta plasmiderna genom PCR
- Välj 5 till 10 bakteriekolonier från LB-plattan och använd var och en av dem för att inokulera ett 1,5 mL-rör som innehåller 1 mL LB-media med 60 mg/mL ampicillin.
- Inkubera rören på en rotationsskakmaskin i 2-3 h.
- Utför detektering av korrekta rekombinanta plasmider genom att använda specifika primerpar för sgRNA-oligonukleotider [t.ex., framåt primer för T1 sgRNA uttryck vektor konstruktion (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, omvänd primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, producerar en 287 bp amplicon (Bild 3)].
- Bereda PCR-blandningen (Tabell 2).
- Använd följande PCR-cykelförhållanden: 95 °C i 5 min för föruppmaningen; 30 cykler på 95 °C för 30 s för denaturering, 60 °C för 30 s för glödgning, och 72 °C för 30 s för förlängning. Efter att de 30 cyklerna är avslutade utför du ett sista förlängningssteg genom uppvärmning i 5 min vid 72 °C.
- Kör PCR-produkten på en 2% agarosgel under 10 V/cm. Ett band i rätt storlek [t.ex., 287 bp] anses som positivt.
8. Validera sekvensen av sgRNA-uttryck plasmid
- Verifiera sekvensen av PCR-positiva kolonier genom Sangersekvensering15 med hjälp av den omvända primern BbsI-R (se steg 7.3). Denna primer glödgning på platsen nedströms sgRNA oligo insats. PX330-xCas9-T1 uttrycker sgRNA sekvens som innehåller protospacer TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG och xCas9 konstruerades.
- Använd den framåt primer T1-F för att sekvens de positiva kolonierna. Den framåtriktat en kunde inte ge färdigt ordnar information för platsen som omger infogningplatsen av sgRNA-oligoen, därför att 30-50 bp fragment efter den sekvensera primeren inte kunde exakt läsas ut.
9. Konstruktion av dubbla luciferas reporter vektor
- Syntetisera 300-500 bp DNA-fragment som innehåller sgRNA-målen och subclone det till en dubbel luciferase reporter vektor genom dubbel matsmältning [t.ex., subclone 440 bp får DKK2 exon1 fragment i pSSA-Dual plasmid16,17 genom att använda dubbel matsmältning med AscI och SalI, resulterande pSSA-Dual-DKK2].
- Syntetisera 300-500 bp DNA-fragment som innehåller sgRNA-målen. Observera att sekvenserna av DNA-fragmenten måste vara delar av de genomiska sekvenserna, som skulle kunna erhållas från NCBI webbplats (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eller relaterade referenser.
- Välj en lämplig dubbla luciferase reporter vektor såsom pSSA-Dual16,17 (eller två vektorer uttrycker firefly luciferase och renilla luciferase respektive) och sedan smälta denna vektor och DNA-fragment som anges ovan med två endonucleases såsom AscI och SalI.
- Slutligen ligate dessa två fragment med T4 DNA Ligase, resulterar i pSSA-Dual-Target. Detaljer för dubbel rötning och ligering visas i tabell 3 respektive tabell 4. Det är värt att nämna att reportern vektor bör förstärkas i stabila bakteriestammar (såsom Top10), som rekommenderas att odlas med lägre rotationshastighet (typiskt inte mer än 200 rpm), i syfte att undvika DNA-rekombination.
10. Cell transfection
- Extrakt endotoxin-free plasmider för vektorer som anges ovan. Utvärdera plasmidernas renhet och koncentration genom att använda lämpliga instrument. En slutlig koncentration på inte mindre än 500 ng/μL och ett renhetsförhållande på 1,7-1,9 vid absorbans 260/280 nm (A260/A280) rekommenderas för dessa plasmider.
- Co-transfect en lämplig cellinje som PIEC18 med plasmiderna i lika stor proportion (t.ex., pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmid för varje dubbelarbete vid användning av 24 brunnsplatta). Använd en tom vektor som pX330-xCas9 som en negativ kontroll.
- En dag före transfektionen, plåtceller i en 24-brunns odlingsplatta vid en densitet av 2 x 105 celler/brunn. Celler kommer att vara redo för transfection när de uppnår en sammanflödet av 60-80%.
- Innan transfektionstidpunkten ska supernatanten tas bort så mycket som möjligt och tillsätt försiktigt 0,5 mL färska medier för varje brunn.
- Späd transfektionsreagens i DMEM-media vid förhållandet 1:25 och blanda väl.
- Förbered master mix av DNA genom att späda 0,5 μg DNA i 25 μL DMEM-media, och tillsätt sedan 1 μL P3000 reagens.
- Tillsätt utspädd DNA till varje rör med utspädd transfektionsreagens (1:1-förhållande).
- Inkubera i 10–15 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 50 μL DNA-lipidkomplex till celler.
- Inkubera celler i 24 h vid 37 °C. Analysera sedan transfekterade celler som i Steg 11.
11. Dubbel-luciferas upptäckt
- Bered en tillräcklig mängd av 1x passiv lysbufferten (PLB) genom att tillsätta 1 volym på 5x PLB till 4 volymer destillerat vatten och blanda väl.
- Passiv lys av celler odlade i 24-brunns odlingsplattor.
- Avlägsna tillväxtmediet från de odlade cellerna, och applicera försiktigt en tillräcklig volym av fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att tvätta ytan på odlingskärlet. Snurra kärlet kort för att avlägsna fristående celler och resttillväxtmedium. Ta helt bort sköljlösningen innan PLB-reagens appliceras.
- Dispensera 100 μL av 1x PLB i varje odlingsvält för att helt täcka cellens monolager. Låt kulturplattorna stå i 20 min.
- Överför lysaten till ett rör eller en injektionsflaska för vidare hantering eller förvaring.
- Förbered luciferasanalysreagens (LAR) genom att återutgöra det försedd med lyofilat luciferasanalyssubstrat i 10 mL av den medföljande luciferasanalysbufferten.
- Förbered en adekvat volym för att utföra det önskade antalet analysanalyser av dubbel-luciferas reporter (100 μL-reagens per analys). Tillsätt 1 volym av 50x stoppsubstrat till 50 volymer stoppbuffert i ett glas eller silikoniserat polypropylenrör.
- Dual-luciferas reporter (DLR) analys
- Programmera luminometrar för att ge en 2-sekunders förläsningsfördröjning, följt av en 10-sekunders mätperiod.
- Predispense 100 μL av luciferas analysreagens till lämpligt antal luminometerrör för att fullborda önskat antal DLR-analyser.
- Överför försiktigt upp till 20 μL cell lysate in i luminometerröret som innehåller LAR; mixa genom pipettering 2 eller 3 gånger. Placera röret i luminometern och initiera avläsning.
- Ta bort provröret från luminometern, tillsätt 100 μL stoppreagens och virvel kort för att blanda. Byt ut provet i luminometern, och initiera avläsning.
- Registrera renilla luciferasaktiviteten som normaliserats till firefly luciferasaktiviteten, nämligen det ömsesidiga av förhållandet som visas på skärmen.
- Kassera reaktionsröret, och fortsätt till nästa analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder som beskrivs i detta protokoll är för konstruktion av sgRNA och xCas9 uttryck vektorer och sedan för optimering screening av sgRNA oligos med relativt högre gen inriktning effektivitetsvinster. Här visar vi ett representativt exempel på 3 sgRNA-mål till får DKK2 exon 1. SgRNA och xCas9 uttrycker vektorer kan byggas genom att predigesting vektorn ryggraden (Figur 2) följt av ligating det i en serie av korta dubbel-strand DNA fragment genom glödgning oligo par. De positiva kolonierna kunde upptäckas genom specifika primerpar guidade PCR (Figur 3). Ett 440 bp DNA-fragment från får DKK2 exon 1 subcloneds i pSSA-Dual plasmid15 genom att använda dubbel rötning med AscI och SalI, vilket resulterar i pSSA-Dual-DKK2. Genen inriktning kapacitet pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 och pX330-xCas9-T3 var simutanusly upptäckts (Figur 5), och sedan den sista sgRNA vektor identifierades som den relativt bättre, som vi plocka upp för får genredigering forskning vid nästa steg.
Denna detektionsmetod kombinerar en SSA-mekanism (Single strand annealing) (figur 1B och figur 4) med en luciferasrapportgen i syfte att övervaka DNA-skäreffektivitet. Som illustreras i figur 4, är SSA en process som inletts när en dubbelsträngsbrytning görs mellan två upprepade sekvenser orienterade i samma riktning. Enstaka delar upp regioner skapas intill de raster som sträcker sig till de upprepade sekvenserna så att de kompletterande strängarna kan glödga till varandra. Denna glödgning mellanliggande kan bearbetas genom att smälta bort den enda strandsatta svansar och fylla i luckorna. Dual-Luciferase Reporter-genen omfattar huvudsakligen luciferasgenerna från firefly Photinus pyralis och från Renilla reniformis (även kallad sea pansy). Verksamheten av firefly och renilla luciferaser mäts sekventiellt från ett enda prov. När det erkännande område som har uppsägningen kodon inte skärs i dess mitten, är genen i SSA-systemet blockeras och kan inte översättas till ett funktionellt protein. När bearbetningen sker kommer SSA-systemet att sammanfoga den homologa sekvensen automatiskt, och överlappande sekvenser blir en enda sekvens, genen får rekombination reparerad och kan sedan läsas igenom producera ett funktionellt protein.
Figur 1: Schematisk återgivning av kloningsprocessens olika steg.
(A) Schematisk av sgRNA vektor konstruktion, anpassad från protokollen i Feng Zhang Lab. (B) Schematiska av dubbla luciferase reporter vektor byggnad (välj vektor pSSA-DKK2 som exempel), DNA-fragment Rluc-, Rluc-2 och Rluc-3 representerar tre delar av fullängds kodning sekvens av Renilla luciferase. MCS representerar "flera kloningsplats". Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Predigesting vektorns stamnät pX330-xCas9 med BbsI.
1: DNA Marker, 2: pX330-xCas9 plasmid, 3: pX330-xCas9 plasmid smält med BbsI. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Specifika primerpar guidade PCR för DKK2-T1-sgRNA-vektordetektering.
Lanes 1-7 indikerar PCR-band för 7 olika bakteriekolonier separat. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Scheman för glödgning av enkelsträng (SSA). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Dubbla luciferas assay med reporter vektor pSSA-DKK2 i cellinje PIEC.
Ranilla luciferasenferasaktiviteterna induceras signifikant (P<0,01, Studentens t test) i PIEC genom överexpröna av pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 eller pX330-xCas9-T3 med vikningsbytet på 3,15, 5,84 respektive 13,10. Felstaplarna anger standardavvikelser (SD)(n=3) för varje grupp. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Namn | Genomiska DNA-mål (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGTCCTCTGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTCTGGGGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGCGGGC | ||||
Tabell 1: SgRNA-mål och oligos utformade för genredigering av får DKK2.
| PCR-komponent | 25 μL-reaktion |
| 10 μM Framåt Primer (t.ex. T1-F) | 1 μL |
| 10 μM Omvänd Primer BbsI-R | 1 μL |
| 10x PCR-buffert | 2,5 μL |
| 2,5 mM dNTPs | 1 μL |
| bakteriell vätska | 1 μL |
| DNA Taq-polymeras | 2.5 enheter |
| Nukleasfritt vatten | Upp till 25 μL |
Tabell 2: PCR-blandning för detektion av positiva bakteriekolonier.
| Reagens | Volym |
| pSSA-Dual vektor (syntetiserat DNA-fragment eller PCR-produkt) | 1-2 μg |
| CutSmart Buffert | 5 μL |
| Asci | 1 μL |
| SalI-HF | 1 μL |
| Destillerat vatten | upp till 50 μL |
| Total volym | 50 μL |
Tabell 3: Dubbel rötning av pSSA-Dual-vektor och syntetiserat DNA-fragment (eller PCR-produkt).
| Reagens | Volym |
| pSSA-Dual vektor(predigested) | 0,5 μg |
| DNA-fragment som innehåller sgRNA-målen (försmält) | 0,2 μg |
| T4 DNA Ligase Buffert (10x) | 1 μL |
| T4 DNA-ligase | 1 μL |
| Destillerat vatten | upp till 10 μL |
| Total volym | 10 μL |
Tabell 4: En ligeringsreaktion av DNA-fragment som innehåller sgRNA-målen till en predigested pSSA-Dual-vektor.
| Steg 1: reagenspreparering | |
| Reagens för transfection | 2 μL |
Tabell 5: Uppgifter om celltransfektion i en 24 brunnsplatta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sgRNA-vektorkloningsförfaranden vi har beskrivit här underlättar effektiv produktion av sgRNAs, med de flesta av kostnaderna som härrör från oligonukleotidens beställning och vektorsekvensering. Medan den skisserade metoden är utformad för att tillåta användare att generera sgRNAs för användning med CRISPR/Cas9, kan protokollet enkelt anpassas för användning med Cas9 ortologer eller andra RNA-styrda endonucleases såsom Cpf1, införa mindre ändringar av vektorns ryggrad och oligonucinotide överhängande sekvenser.
Det protokoll som beskrivs ovan kommer att ge ett föredraget sgRNA-mål om 10 dagar när det börjar med lämpligt utformade oligonukleotider. Detta inkluderar sgRNA-designen (1 h, steg 1 - 2), utspädning, alikvot och glödgning av oligonukleotider (30 min, steg 3), rötning och rening av sgRNA-uttrycksvektorn (3 h, steg 4), kloningen av sgRNA oligonukleotider till en predigested tom vektor (över natten, steg 5 - 6), PCR-detektionen av kolonierna (4-5 h, steg 7) och valideringen av sgRNA-uttrycksplasmidens sekvens (24 h , steg 8). Under tiden, konstruktionen och sekvens validering av dubbla luciferas reporter vektor tar 5 – 7 d (steg 9). Beredningen av cellinjen, plasmid transfektion och dubbla luciferas upptäckt ta ca 48 h (steg 10 - 11). Felfrekvenserna för att generera varje plasmid är nästan 0.
Det mest kritiska steget i protokollet är den restriktiva enzyms digestionen av sgRNA-vektorn genom enzymer som BBSI. Om matsmältningen inte är tillräcklig, då den positiva andelen bactera kolonier kan vara mycket låg. Medan PCR-baserade upptäckt tillvägagångssätt kunde känsligt övervaka matsmältningen effektivitet och den positiva hastigheten. De framåt primrar, förr använt som framåt oligos av det insatta sgRNA-fragmentet, säkerställde mycket effektiv skillnad av högra infogningar och tomma vektorer. En av fördelarna med denna strategi är just en effektiv detektering av de positiva kolonierna genom PCR före DNA-sekvensering. Som anges ovan, sekvensverifiering är fortfarande relativt dyrare jämfört med PCR, särskilt när ofullständig rötning av BbsI inträffar. När det gäller resursbesparing, parade vi framåt oligos för sgRNA fragment glödgning (såsom T1-F, T2-F eller T3-F) med sekvensering primer BbsI-R för PCR förstärkning. Mer än 500 sgRNA-vektorer har framgångsrikt konstruerats i labbet genom denna strategi för koloniidentifiering.
En annan förtjänst med protokollet är det effektiva förvalet av kandidat sgRNA mål med hjälp av dubbla luciferas reporter system. Enorma variansen för skäreffektivitet finns verkligen vid olika sgRNA-mål4. Att identifiera ett högeffektivt sgRNA-mål av T7E1-analys eller Surveyor nuclease assay1 i en svår-till-transfect cellinje är tid och arbete tidskrävande. Dessutom, för PCR förstärkning i T7E1 analys eller Surveyor nuclease analys, är det ibland svårt att specifikt förstärka målsekvensen i arvsmassan DNA på grund av bristen på lämpliga primer par1. Däremot är den dubbla luciferas reporter analysen oberoende av genomförstärkning förfaranden. Tidigare har vi använt denna metod för att få mycket aktiva sgRNAs16,19.
Trots de klara fördelarna med den metod som beskrivs i detta arbete finns det också vissa begränsningar som måste påpekas. Även om det säkerställer en hög framgång, luciferase-baserade metoden för sgRNA urval föreslås skulle kunna vara dyrare än andra tillvägagångssätt (besiktningsman / högupplöst smälta analys, etc.) på grund av behovet av att syntetisera målsekvensen. Dessutom är detta tillvägagångssätt inte snabbare än någon av dessa alternativa metoder på grund av behovet av att klona reportern plasmid om en lätt-till-transfect cellinje kommer att genomföras för gen inriktning. Det är också nödvändigt att klargöra att metoden är lämplig för att göra knockouts men inte att redigera specifika nukleotider. Dessutom kan endast dubbelsträngade raster och inte enkelsträngade raster utvärderas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta projekt finansierades av First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong-provinsen (Kina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), den särskilda fonden för jordbruksvetenskaplig forskning i allmänhetens intresse (201403071), Nationell riskbedömning stort specialprojekt för mjölkproduktkvalitet och -säkerhet (GJFP201800804) och Projekt för Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
