Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe un método simplificado para la generación eficiente de plásmidos que expresa tanto la enzima CRISPR como el ARN guía único asociado (sgRNAs). La coexistencia de células de mamíferos con este vector sgRNA/CRISPR y un vector reportero de luciferasa doble que examina la reparación de rotura de doble hebra permite evaluar la eficiencia de la eliminatoria.
Abstract
Aunque es altamente eficiente, la modificación de un sitio genómico por la enzima CRISPR requiere la generación de un sgRNA único para el sitio o sitios objetivo de antemano. Este trabajo describe los pasos clave que conducen a la construcción de vectores de sgRNA eficientes utilizando una estrategia que permite la detección eficiente de las colonias positivas por PCR antes de la secuenciación del ADN. Dado que la edición eficiente del genoma mediante el sistema CRISPR requiere un sgRNA altamente eficiente, es necesaria una preselección de los objetivos candidatos de sgRNA para ahorrar tiempo y esfuerzo. Se ha desarrollado un sistema de reportero de doble luciferasa para evaluar la eficiencia de los golpes examinando la reparación de roturas de doble cadena mediante recocido de una sola cadena. Aquí, utilizamos este sistema de reporteros para recoger el objetivo preferido de xCas9/sgRNA de los vectores sgRNA candidatos para la edición de genes específicos. El protocolo descrito proporcionará un vector enzimático sgRNA/CRISPR preferido en 10 días (comenzando con oligonucleótidos adecuadamente diseñados).
Introduction
Los sgRNAs CRISPR comprenden una secuencia de 20 nucleótidos (el protoespacial), que es complementaria a la secuencia de objetivos genómicos1,2. Aunque es altamente eficiente, la capacidad del sistema CRISPR/Cas para modificar un sitio genómico determinado requiere la generación de un vector que lleve un sgRNA eficiente único en el sitio o sitios de destino2. Este documento describe los pasos clave en la generación de ese vector sgRNA.
Para una edición exitosa del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas, el uso de sgRNAs altamente eficientes es un requisito previo crucial3,4,5. Dado que las nuclelas diseñadas utilizadas en la edición del genoma manifiestan diversas eficiencias en diferentes loci1,es necesaria una preselección de los objetivos de sgRNA candidatos para ahorrar tiempo y esfuerzo6,7,8,9. Se ha desarrollado un sistema de reportero de luciferasa dual para evaluar la eficiencia de los golpes examinando la reparación de roturas de doble hebra a través de recocido de una sola hebra3,10. Aquí utilizamos este sistema de reporteros para elegir un objetivo preferido de SGRNA CRISPR entre diferentes vectores sgRNA candidatos diseñados para la edición de genes específicos. El protocolo aquí establecido se ha implementado en nuestro grupo y laboratorios colaboradores durante los últimos años para generar y evaluar los sgRNAs CRISPR.
El siguiente protocolo resume cómo diseñar sgRNA adecuado a través de software de red. Una vez seleccionados los sgRNAs adecuados, describimos los diferentes pasos para obtener los oligonucleótidos necesarios, así como el enfoque para insertar los oligonucleótidos emparejados en el vector de expresión pX330-xCas9. También presentamos un método para ensamblar vectores de reporteros de srna-expresión y luciferasa dual basados en la ligación de estas secuencias en un vector de expresión predigerido (pasos 2-10, Figura 1A). Finalmente describimos cómo analizar la eficiencia de corte de ADN para cada uno de los sgRNAs (pasos 11-12).
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Protocol
1. diseño de oligonucleótidos sgRNA
- Diseñe sgRNAs utilizando herramientas en línea como la herramienta en línea (http://www.rgenome.net/cas-designer/ de Cas-Designer). La secuencia PAM es importante en función del Cas9 que se está utilizando. Para xCas9, las secuencias PAM relevantes son NG y la antigua herramienta en línea Cas-Designer referida puede generar xCas9 sgRNAs relevantes.
- Utilice herramientas de diseño sgRNA que abarquen algoritmos para la predicción dentro y fuera del objetivo (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. Se prefiere una puntuación de 0,2 o superior.
- Seleccione hasta 3 objetivos de edición de genes para un cribado óptimo (por ejemplo, T1, T2 y T3 fueron diseñados para ovejas DKK2 exón 1 dirigidas al gen [Tabla 1]).
2. Modificación de oligonucleótidos
- Para modificar el oligonucleótido sgRNA, elimine el motivo adyacente del protoespacialista de 3'-NG (PAM), manteniendo la secuencia del protoespacial (por ejemplo, secuencia inicial para T1: TGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Agregue el PENTAnucleótido CACCG al extremo 5'del oligo.
NOTA: Tras la ligadura al esqueleto pX330-xCas9, esta secuencia contendrá el extremo 3'-end del promotor U6 motivando la transcripción de sgRNA. La matriz "CACC" garantiza que el oligo está coincidiendo con los voladizos del plásmido pX330-xCas9 digerido por BbsI. La base "G" es un requisito previo de los promotores de ARN Polimerasa III y garantiza el inicio efectivo de la transcripción de sgRNA (por ejemplo, añadiendo la matriz 5'-CACCG al protoespacialista de T1, logrando T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC [25 nt]). La eficiencia de escote de 21 nt gRNA es significativamente diferente de la de 20 nt gRNA1,12,13,14. Generalmente se recomienda utilizar 20 nt con 5'-G mediante la generación de un protoespacial más corto, si esto no es posible entonces 21 nt con 5'-G extra se puede utilizar. - Cree un complemento inverso (rc) de la secuencia del protoespacial.
NOTA: Por ejemplo, el rc del protoespacial T1 es GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Anexe AAAC al extremo 5' de la secuencia del protoespacialador rc. Añada una C adicional al extremo 3'-del protoespacialista rc.
NOTA: La secuencia "AAAC" garantiza que el oligonucleótido sea adecuado para clonar en el plásmido pX330-xCas9 digerido por BbsI. La "C" adicional en el extremo 3'-end es esencial para recocido con el iniciado "G" para la transcripción sgRNA descrita anteriormente (por ejemplo, AAACGCGGCCAGTAGGAGCGCGCAC [25 nt] es la secuencia final de oligonucleótidos para el protoespacial T1 rc. - Ordene los oligonucleótidos.
3. Recocido de oligonucleótidos
- Diluir los oligonucleótidos liofilizados a una concentración final de 10 oM en agua destilada doble (ddH2O).
- Mezclar oligonucleótidos hacia delante y hacia atrás en un tubo PCR de pared delgada que tiene una relación de 1:1 (por ejemplo, 20 ml cada uno) sin añadir ningún búfer adicional.
- Incubar la mezcla a 95oC durante 5 min y luego bajar la temperatura a 72oC durante 10 min. Siga con un período de enfriamiento a temperatura ambiente (RT) que consiste simplemente en extraer la muestra de la máquina PCR y colocarla en RT.
NOTA: No es necesario fosforilar las mezclas de oligonucleótidos para facilitar la ligadura.
4. digestión vectorial sgRNA/CRISPR
- Digerir 1 g del vector pX330-xCas9 seleccionado con BbsI (10 unidades de enzima por 1 g de plásmido) durante 2 h a 37oC(Figura 2). Llevar a cabo la digestión del vector de expresión de pX330-xCas9 sgRNA en un volumen total de 50 l, que contiene 5 l de tampón de digestión 10x y agua destilada para alcanzar el volumen final.
- Purificar el vector digerido mediante la extracción de banda de un gel de agarosa al 2% bajo 10 V/cm y posteriormente purificar utilizando una columna de sílice utilizando un kit de extracción de gel comercial.
5. Ligadura de los oligonucleótidos sgRNA recocidos al vector de expresión
- Mezclar los oligonucleótidos sgRNA recocidos (5 l de la mezcla del paso 4) con el vector pX330-xCas9 digerido por BbsI (purificado, 100 ng).
- Agregue 1 l de ligasa y 1 l de tampón de ligasa 10x.
- Añadir agua destilada con el volumen adecuado, hasta 10 l.
- Incubar durante la noche a 4oC.
6. Transformación celular competente
- Sacar las células competentes de E. coli DH5 del almacenamiento a -80 oC y descongelarlas sobre hielo.
- Añadir 5 l de la mezcla de ligadura a 50 l de E. coli DH5 competente y mantener la mezcla sobre hielo durante 30 min.
- Choque térmico de la mezcla a 42oC durante 90 s.
- Descanse sobre hielo durante 2 min.
- Recuperar el cultivo en una coctelera giratoria en 500 s de soportes LB durante 1 h a 37 oC.
- Placa 200 l del cultivo sobre una placa de agarosa LB resistente a la ampicilina y la incubar durante la noche a 37oC.
7. Identificación de los plásmidos recombinantes correctos por PCR
- Elija de 5 a 10 colonias bacterianas de la placa LB y utilice cada una de ellas para inocular un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de medios LB con 60 mg/ml de ampicilina.
- Incubar los tubos en una coctelera giratoria durante 2-3 h.
- Llevar a cabo la detección de plásmidos recombinantes correctos mediante el uso de pares de imprimación específicos para los oligonucleótidos sgRNA [por ejemplo, imprimación directa para la construcción de vectores de expresión T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC, imprimación inversa (BbsI-R): AAACCCTATTGGCGTTAC produciendo, un amplicon de 287 bp(Figura 3)].
- Preparar la mezcla de PCR(Tabla 2).
- Utilice las siguientes condiciones de ciclo de PCR: 95 oC durante 5 minutos para la pre-desnaturalización; 30 ciclos de 95oC para 30 s para desnaturalización, 60oC para 30 s para recocido, y 72oC para 30 s para extensión. Una vez completados los 30 ciclos, realice un paso de extensión final calentando durante 5 min a 72 oC.
- Ejecute el producto PCR con un gel de agarosa del 2% bajo 10 V/cm. Una banda del tamaño correcto [por ejemplo, 287 bp] se considera positiva.
8. Validar la secuencia del plásmido de expresión sgRNA
- Verifique la secuencia de colonias positivas de PCR mediante la secuenciación de Sanger15 utilizando la imprimación inversa BbsI-R (véase el paso 7.3). Esta imprimación recocidos en el sitio aguas abajo de la inserción de oligo de sgRNA. Se construyó el pX330-xCas9-T1 que expresa la secuencia sgRNA que contiene el protoespacialista TGCCTCTCTCTCTGGCCGCGG y xCas9.
- Utilice la imprimación delantera T1-F para secuenciar las colonias positivas. El delantero no podía dar información completa de la secuencia para el sitio que rodeaba el sitio de inserción del oligo sgRNA, porque el fragmento de 30-50 bp después de la imprimación de secuenciación no se podía leer exactamente.
9. Construcción de vector reportero de luciferasa dual
- Sintetizar fragmentos de ADN de 300-500 bp que contengan los objetivos de sgRNA y subclone en un vector de reportero de luciferasa dual a través de la doble digestión [por ejemplo, fragmento de subclone 440 bp ovino DKK2 exon1 en plásmido pSSA-Dual16,17 mediante el uso de doble digestión con AscI y SalI, resultando pSSA-Dual-DKK2].
- Sintetice fragmentos de ADN de 300-500 bp que contengan los objetivos de SGRNA. Tenga en cuenta que las secuencias de los fragmentos de ADN deben ser partes de las secuencias genómicas, que podrían obtenerse del sitio web de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o referencias relacionadas.
- Seleccione un vector de reportero de luciferasa dual adecuado como pSSA-Dual16,17 (o dos vectores que expresen la luciasa de la luciérntica y la renilla luciferase respectivamente) y luego digiere este vector y los fragmentos de ADN mencionados anteriormente con dos endonucleasas como AscI y SalI.
- Finalmente ligar estos dos fragmentos con T4 DNA Ligase, resultando en pSSA-Dual-Target. Los detalles de la doble digestión y la ligadura se muestran en la Tabla 3 y la Tabla 4,respectivamente. Vale la pena mencionar que el vector reportero debe amplificarse en cepas de bacterias estables (como Top10), que se recomiendan para ser cultivados con menor velocidad de rotación (normalmente no más de 200 rpm), con el fin de evitar la recombinación del ADN.
10. Transfección celular
- Extraiga plásmidos libres de endotoxinas para los vectores indicados anteriormente. Evaluar la pureza y concentración de los plásmidos utilizando instrumentos adecuados. Para estos plásmidos se recomienda una concentración final de no menos de 500 ng/L y una relación de pureza de 1,7-1,9 a una absorbancia de 260/280 nm (A260/A280).
- Co-transfectar una línea celular apropiada como PIEC18 con los plásmidos en igual proporción (por ejemplo, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2-1:1, 0.5 g plásmido para cada duplicación cuando se utiliza 24 placas de pozo). Utilice un vector vacío como pX330-xCas9 como control negativo.
- Un día antes de la transfección, células de placa en una placa de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 2 x 105 células / pozo. Las células estarán listas para la transfección cuando logren una confluencia de 60-80%.
- Antes del punto de tiempo de transfección, retire el sobrenadante tanto como sea posible y agregue suavemente 0,5 ml de medios frescos para cada pocól.
- Diluir el reactivo de transfección en medios DMEM en la proporción de 1:25 y mezclar bien.
- Preparar la mezcla maestra de ADN diluyendo 0,5 g de ADN en 25 ml de medios DMEM, y luego añadir 1 l de reactivo P3000.
- Añadir ADN diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido (relación 1:1).
- Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente.
- Añadir 50 l de complejo de lípidos de ADN a las células.
- Incubar células durante 24 h a 37oC. Luego, analice las células trans infectadas como en el paso 11.
11. Detección de doble lucifera
- Preparar una cantidad suficiente del tampón de lisis pasiva 1x (PLB) añadiendo 1 volumen de 5x PLB a 4 volúmenes de agua destilada y mezclar bien.
- Lysis pasiva de células cultivadas en placas de cultivo de 24 pozos.
- Retire el medio de crecimiento de las células cultivadas y aplique suavemente un volumen suficiente de solución salina tamponada de fosfato (PBS) para lavar la superficie del recipiente de cultivo. Gire brevemente el recipiente para eliminar las células separadas y el medio de crecimiento residual. Retire completamente la solución de enjuague antes de aplicar el reactivo PLB.
- Dispensar 100 l de 1x PLB en cada pozo de cultivo para cubrir completamente la monocapa celular. Deje que las placas de cultivo se de pie durante 20 minutos.
- Transfiera el izado a un tubo o vial para su posterior manipulación o almacenamiento.
- Preparar el reactivo de ensayo de luciferasa (LAR) resuspendiendo el sustrato de ensayo de luciferasa liofilizado proporcionado en 10 ml del tampón de ensayo de luciferasa suministrado.
- Preparar un volumen adecuado para realizar el número deseado de ensayos de reporteros de doble luciferasa (reactivo de 100 l por ensayo). Agregue 1 volumen de sustrato de tope 50x a 50 volúmenes de tampón de tope en un tubo de vidrio o polipropileno siliconizado.
- Ensayo de reportero de doble luciferasa (DLR)
- Programe luminómetros para proporcionar un retardo de pre-lectura de 2 segundos, seguido de un período de medición de 10 segundos.
- Predispense 100 l de reactivo de ensayo de luciferasa en el número adecuado de tubos luminómetros para completar el número deseado de ensayos DLR.
- Transfiera con cuidado hasta 20 ml de lito de celda al tubo luminómetro que contiene LAR; mezclar por pipeteo 2 o 3 veces. Coloque el tubo en el luminómetro e inicie la lectura.
- Retire el tubo de muestra del luminómetro, añada 100 l de reactivo de tope y vórtice brevemente para mezclar. Sustituya la muestra en el luminómetro e inicie la lectura.
- Registre la actividad de renilla luciferase normalizada a la actividad luciferasa de la luciérntica, es decir, la recíproca de la relación mostrada en la pantalla.
- Deseche el tubo de reacción y proceda al siguiente ensayo.
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Representative Results
Los métodos descritos en este protocolo son para la construcción de vectores de expresión sgRNA y xCas9 y luego para la optimización de los oligos de SGRNA con eficiencias de focalización genética relativamente más altas. Aquí mostramos un ejemplo representativo de 3 objetivos sgRNA a ovinos DKK2 exón 1. Los vectores que expresan SgRNA y xCas9 se pueden construir predigeriendo la columna vertebral del vector (Figura 2) seguida de ligarla en una serie de fragmentos cortos de ADN de doble cadena a través de pares de oligocolladores recocidos. Las colonias positivas podrían detectarse a través de pares de imprimación específicos guiados PCR (Figura 3). Un fragmento de ADN de 440 bp de oveja DKK2 exón 1 fue subclonado en pSSA-Dual plásmido15 mediante el uso de doble digestión con AscI y SalI, resultando en pSSA-Dual-DKK2. El gen que apuntaba a las capacidades de pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 y pX330-xCas9-T3 se detectó simutanusly(Figura 5),y luego se identificó el último vector sgRNA como el relativamente mejor, que recogemos para la investigación de edición de genes de ovejas en el siguiente paso.
Este método de detección combina un mecanismo de recocido de una sola hebra (SSA)(Figura 1B y Figura 4)con un gen de informe de luciferasa para monitorear la eficiencia de corte de ADN. Como se ilustra en la Figura 4,SSA es un proceso iniciado cuando se realiza una rotura de doble hebra entre dos secuencias repetidas orientadas en la misma dirección. Las regiones de una sola hebra se crean adyacentes a los saltos que se extienden a las secuencias repetidas para que las hebras complementarias puedan recocobrarse entre sí. Este recocido intermedio se puede procesar digeriendo las colas de una sola varada y rellenando los huecos. El gen Dual-Luciferase Reporter incluye principalmente los genes luciferasas de la luciérnbala Photinus pyralis y de Renilla reniformis (también conocida como pansy marina). Las actividades de las luciferasas de lucios y la renilla se miden secuencialmente a partir de una sola muestra. Cuando el área de reconocimiento que tiene el codón de terminación no se corta en su medio, el gen en el sistema SSA se bloquea y no se puede traducir en una proteína funcional. Cuando se lleva a cabo el procesamiento, el sistema SSA fusionará la secuencia homóloga automáticamente, y las secuencias superpuestas se convierten en una sola secuencia, el gen se repara y luego se puede leer a lo largo produciendo una proteína funcional.
Figura 1: Representación esquemática de los diferentes pasos del proceso de clonación.
(A) Esquema de la construcción de vectores sgRNA, adaptado de los protocolos de Feng Zhang Lab. (B) Esquema de construcción vectorial de reportero de luciferasa dual (vector selecto pSSA-DKK2 como ejemplo), fragmentos de ADN Rluc-, Rluc-2 y Rluc-3 representan tres partes de la secuencia de codificación de longitud completa de Renilla luciferase. MCS representa "sitio de clonación múltiple". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Predigeriendo la columna vertebral vectorial pX330-xCas9 con BbsI.
1: Marcador de ADN, 2: plásmido pX330-xCas9, 3: plásmido pX330-xCas9 digerido con BbsI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pares de imprimación específicos guiados PCR para la detección vectorial DKK2-T1 sgRNA.
Los carriles 1-7 indican bandas de PCR para 7 colonias de bacterias diferentes por separado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquemas para recocido de una sola hebra (SSA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo de luciferasa dual con vector reportero pSSA-DKK2 en la línea celular PIEC.
Las actividades de La Luciferasa de Ranilla son significativamente inducidas (P<0.01, Prueba t del estudiante) en PIEC por sobreexpresación de pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 o pX330-xCas9-T3 con el cambio de pliegue de 3.15, 5.84 o 13.10, respectivamente. Las barras de error indican desviaciones estándar (SD)(n-3) para cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Objetivos de ADN genómico (5'-3') | oligos de sgRNA (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGGCGGGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGTCCTCTCTGGGCGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTCTGGGGGGGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCGCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCGCGGGC | ||||
Tabla 1: objetivos y oligos de SGRS diseñados para la edición genética de ovejas DKK2.
| Componente PCR | Reacción de 25 l |
| Imprimación delantera de 10 m (p. ej., T1-F) | 1 l |
| 10 M Invertido Primer BbsI-R | 1 l |
| 10x búfer PCR | 2.5 l |
| 2,5 mM de dNTP | 1 l |
| fluido bacteriano | 1 l |
| ADN Taq Polimerasa | 2,5 unidades |
| Agua sin nucleasas | Hasta 25 l |
Tabla 2: Mezcla de PCR para la detección positiva de colonias bacterianas.
| Reactivo | Volumen |
| pSSA-Dual vector (fragmento de ADN sintetizado o producto PCR) | 1-2 g |
| Zona de influencia CutSmart | 5 l |
| Asci | 1 l |
| SalI-HF | 1 l |
| Agua destilada | hasta 50 l |
| Volumen total | 50 l |
Tabla 3: Doble digestión del vector pSSA-Dual y fragmento de ADN sintetizado (o producto PCR).
| Reactivo | Volumen |
| pSSA-Dual vector (predigested) | 0,5 g |
| Fragmentos de ADN que contienen los objetivos de sgRNA (predigestos) | 0,2 g |
| T4 DNA Ligase Buffer (10x) | 1 l |
| T4 DNA Ligase | 1 l |
| Agua destilada | hasta 10 l |
| Volumen total | 10 l |
Tabla 4: Una reacción de ligadura de fragmentos de ADN que contienen los objetivos de sgRNA en un vector pSSA-Dual predigerido.
| Paso 1: Preparación de reactivos | |
| Reactivo de transfección | 2 l |
Tabla 5: Detalles de la transfección celular en una placa de 24 pocillos.
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Discussion
Los procedimientos de clonación vectorial de sgRNA que hemos descrito aquí facilitan la producción eficiente de sgRNAs, con la mayoría de los costos derivados del orden de oligonucleótidos y la secuenciación vectorial. Mientras que el método descrito está diseñado para permitir a los usuarios generar sgRNAs para su uso con CRISPR/Cas9, el protocolo se puede adaptar fácilmente para su uso con ortologues Cas9 u otras endonucleasas guiadas por ARN como Cpf1, introduciendo modificaciones menores en la columna vertebral del vector y las secuencias que sobrevuelan el oligonucleótido.
El protocolo descrito anteriormente proporcionará un objetivo de sgRNA preferido en 10 días cuando comience con oligonucleótidos adecuadamente diseñados. Esto incluye el diseño de sgRNA (1 h, pasos 1 - 2), dilución, alícuota y recocido de los oligonucleótidos (30 min, paso 3), digestión y purificación del vector de expresión sgRNA (3 h, paso 4), clonación de los oligonucleótidos sgRNA en un vector vacío predigerido (durante la noche, pasos 5 - 6), la detección de PCR de las colonias (4-5 h, paso 7) y la validación de la secuencia del plásmido de expresión de ARN sg (24 h , paso 8). Mientras tanto, la construcción y validación de la secuencia del vector de reportero de la luciferasa dual toma 5 – 7 d (paso 9). La preparación de la línea celular, la transfección de plásmido y la detección dual de luciferasa tardan aproximadamente 48 h (pasos 10 - 11). Las tasas de fracaso para generar cada plásmido son casi 0.
El paso más crítico del protocolo es la digestión enzimática restrictiva del vector sgRNA por enzimas como BbsI. Si la digestión no es suficiente, entonces la tasa positiva de colonias de bacteras podría ser muy baja. Mientras que el enfoque de detección basado en PCR podría monitorear sensiblemente la eficiencia de la digestión y la tasa positiva. Las imprimaciones delanteras, anteriormente utilizadas como oligos directos del fragmento de sgRNA insertado, garantizaban una distinción muy eficaz de las inserciones correctas y los vectores vacíos. Una de las ventajas de esta estrategia es precisamente la detección eficiente de las colonias positivas por PCR antes de la secuenciación del ADN. Como se indicó anteriormente, la verificación de la secuencia sigue siendo relativamente más costosa en comparación con la PCR, especialmente cuando se produce una digestión incompleta de BbsI. En términos de ahorro de recursos, emparejamos los oligos hacia adelante para el recocido de fragmentos de sgRNA (como T1-F, T2-F o T3-F) con la imprimación de secuenciación BbsI-R para amplificación de PCR. Más de 500 vectores sgRNA se han construido con éxito en el laboratorio a través de esta estrategia para la identificación de colonias.
Otro mérito del protocolo es la preselección efectiva de los objetivos candidatos de sgRNA utilizando el sistema de reporteros de luciferasa dual. De hecho, existe una enorme varianza de la eficiencia de corte en los diferentes objetivos de sgRNA4. Identificar un objetivo de sRNA altamente eficiente mediante el ensayo T7E1 o el ensayo de nucleasas de Surveyor1 en una línea celular difícil de transfecto consume tiempo y mano de obra. Además, para la amplificación de PCR en el ensayo T7E1 o en el ensayo de nucleasas Surveyor, a veces es difícil amplificar específicamente la secuencia objetivo en el ADN del genoma debido a la falta de pares de imprimación adecuados1. Por el contrario, el ensayo dual de reporteros de luciferasa es independiente de los procedimientos de amplificación del genoma. Anteriormente hemos utilizado este método para obtener sgRNAs altamente activos16,19.
A pesar de las claras ventajas del método descrito en este trabajo, también hay algunas limitaciones que deben señalarse. Aunque garantiza una alta tasa de éxito, el método basado en la luciferasa para la selección de sgRNA propuesto podría ser más caro que otros enfoques (análisis de fusión de encuestador/alta resolución, etc.) debido a la necesidad de sintetizar la secuencia de destino. Además, este enfoque no es más rápido que cualquiera de estos métodos alternativos debido a la necesidad de clonar el plásmido reportero si se llevará a cabo una línea celular fácil de transfecta para la focalización de genes. También es necesario aclarar que el método es adecuado para hacer nocauts, pero no para editar nucleótidos específicos. Además, solo se pueden evaluar los saltos de doble cadena y no los saltos de una sola cadena.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por First Class Grassland Science Discipline Program de la Provincia de Shandong (China), La Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31301936, 31572383), el Fondo Especial para la Investigación Agrocientífica en interés público (201403071), el principal proyecto especial de evaluación de riesgos nacionales de calidad y seguridad de productos lácteos (GJFP201800804) y Proyectos de La Ciencia y Tecnología de La Vida del Pueblo de Qingdao (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
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