Summary
Ici, nous présentons un protocole décrivant une méthode rationalisée pour la génération efficace de plasmides exprimant à la fois l’enzyme CRISPR et l’ARN guide unique associé (SGARN). La co-transfection des cellules mammifères avec ce vecteur sgRNA/CRISPR et un double vecteur de reporter luciferase qui examine la réparation de rupture à double brin permet d’évaluer l’efficacité des KNOCKOUT.
Abstract
Bien que très efficace, la modification d’un site génomique par l’enzyme CRISPR nécessite la génération d’un sgRNA unique au site cible(s) à l’avance. Ces travaux décrivent les étapes clés menant à la construction de vecteurs sgRNA efficaces à l’aide d’une stratégie qui permet la détection efficace des colonies positives par PCR avant le séquençage de l’ADN. Étant donné que l’édition efficace du génome à l’aide du système CRISPR nécessite un SGRNA hautement efficace, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire pour gagner du temps et des efforts. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par annealing simple brin. Ici, nous utilisons ce système de reporter pour ramasser la cible préférée xCas9/sgRNA à partir des vecteurs candidats sgRNA pour l’édition génétique spécifique. Le protocole décrit fournira un vecteur d’enzyme sgRNA/CRISPR préféré en 10 jours (en commençant par des oligonucléotides convenablement conçus).
Introduction
Les SGARN CRISPR comprennent une séquence de 20 nucléotides (le protospacer), qui est complémentaire à la séquencecible génomique 1,2. Bien que très efficace, la capacité du système CRISPR/Cas à modifier un site génomique donné nécessite la génération d’un vecteur porteur d’un SGRNA efficace unique au site cible(s)2. Cet article décrit les étapes clés de la génération de ce vecteur sgRNA.
Pour réussir l’édition du génome à l’aide du système CRISPR/Cas, l’utilisation de sgARN hautement efficaces est une condition préalable cruciale3,4,5. Étant donné que les nucléases modifiées utilisées dans l’édition du génome manifestent diverses efficacités à différents loci1ciblés, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire afin de gagner du temps et des efforts6,7,8,9. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par l’intermédiaire de l’annealingsimple de brin 3,10. Ici, nous utilisons ce système de reporter pour choisir une cible crispr sgRNA préférée parmi différents vecteurs candidats sgRNA conçus pour l’édition de gènes spécifiques. Le protocole indiqué ici a été mis en œuvre dans notre groupe et les laboratoires collaborateurs au cours des dernières années pour générer et évaluer crispr sgRNAs.
Le protocole suivant résume comment concevoir sgRNA approprié par le biais de logiciels réseau. Une fois que les sgARN appropriés sont sélectionnés, nous décrivons les différentes étapes pour obtenir les oligonucléotides requis ainsi que l’approche pour insérer les oligonucléotides appariés dans le vecteur d’expression pX330-xCas9. Nous présentons également une méthode pour assembler des vecteurs de reporter sgRNA-expressing et double luciferase basés sur la ligature de ces séquences dans un vecteur d’expression prédigesté (étapes 2-10, figure 1A). Enfin, nous décrivons comment analyser l’efficacité de coupe de l’ADN pour chacun des SGARN (étapes 11-12).
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Protocol
1. conception d’oligonucléotide de sgRNA
- Concevoir des sgARN à l’aide d’outils en ligne tels que l’outil en ligne Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). La séquence PAM est importante en fonction du Cas9 utilisé. Pour xCas9, les séquences PAM pertinentes sont NG et l’ancien outil en ligne Cas-Designer référé peut générer xCas9 sgRNAs pertinents.
- Utilisez des outils de conception sgRNA qui englobent des algorithmes pour la prédiction sur et hors cible (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. Un score de 0,2 ou plus est préféré.
- Sélectionnez jusqu’à 3 cibles d’édition génétique pour un dépistage optimal (p. ex., T1, T2 et T3 ont été conçus pour le ciblage génétique exon 1 du mouton DKK2 exon 1 [tableau 1]).
2. Modification oligonucléotide
- Pour modifier l’oligonucléotide sgRNA, supprimez le motif adjacent protospacer de 3'NG (PAM), en conservant la séquence protospacer (par exemple, séquence de départ pour T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Ajouter le pentanucleotide CACCG à l’extrémité 5'de l’oligo.
REMARQUE: Lors de la ligature vers le squelette pX330-xCas9, cette séquence contiendra le 3'-end du promoteur U6 motivant la transcription sgRNA. Le tableau « CACC » garantit que l’oligo correspond aux surplombs du plasmide pX330-xCas9 digéré par BbsI. La base « G » est une condition préalable des promoteurs de RNA Polymerase III et garantit le démarrage effectif de la transcription sgRNA (par exemple, l’appétire le tableau 5'-CACCG au protospacer de T1, la réalisation T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). L’efficacité de clivage de 21 nt gRNA est significativement différente de celle de 20 nt gRNA1,12,13,14. Il est généralement conseillé d’utiliser 20 nt avec 5'-G en générant un protospacer plus court, si cela n’est pas possible, puis 21 nt avec 5'-G supplémentaire peut être utilisé. - Créez un complément inverse (rc) de la séquence protospacer.
REMARQUE: Par exemple, le rc du protospacer T1 est GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Annexe AAAC à la fin de 5'de la séquence protospacer rc. Annexez un C supplémentaire à l’extrémité 3'du protospacer rc.
REMARQUE : La séquence « AAAC » garantit que l’oligonucléotide convient au clonage dans le plasmide pX330-xCas9 digéré par BbsI. L’addition « C » sur le 3'-end est essentielle pour annealing avec l’initiation « G » pour la transcription sgRNA décrite ci-dessus (par exemple, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] est la séquence oligonucléotide finale pour protospacer T1 rc). - Commandez les oligonucléotides.
3. Annealing oligonucléotide
- Diluer les oligonucléotides lyophilisés à une concentration finale de 10 μM dans de l’eau distillée double (ddH2O).
- Mélanger les oligonucléotides avant et arrière dans un tube PCR à parois minces, avec un rapport de 1:1 (p. ex., 20 μL chacun) sans ajouter de tampon supplémentaire.
- Incuber le mélange à 95 °C pendant 5 min, puis baisser la température à 72 °C pendant 10 min. Suivez avec une période de refroidissement à température ambiante (RT) consistant simplement à retirer l’échantillon de la machine PCR et à le placer à RT.
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de phosphorer les mélanges oligonucléotides pour faciliter la ligature.
4. digestion vectorielle sgRNA/CRISPR
- Digérer 1 μg du vecteur pX330-xCas9 sélectionné avec bbsI (10 unités d’enzyme par 1 μg de plasmide) pendant 2 h à 37 °C (figure 2). Effectuer la digestion du vecteur d’expression pX330-xCas9 sgRNA dans un volume total de 50 μL, contenant 5 μL de tampon de digestion 10x et de l’eau distillée pour atteindre le volume final.
- Purifier le vecteur digéré par extraction en bande à partir d’un gel d’agarose de 2 % de moins de 10 V/cm et purifier par la suite à l’aide d’une colonne de silice à l’aide d’un kit commercial d’extraction de gel.
5. Ligation des oligonucléotides annelés de sgRNA au vecteur d’expression
- Mélanger les oligonucléotides annelés sgRNA (5 μL du mélange de l’étape 4) avec le vecteur pX330-xCas9 digéré par BbsI (purifié, 100 ng).
- Ajouter 1 μL de ligase et 1 μL de tampon ligase 10x.
- Ajouter l’eau distillée avec un volume approprié, jusqu’à 10 μL.
- Incuber toute la nuit à 4 °C.
6. Transformation cellulaire compétente
- Sortez les cellules compétentes E. coli DH5α du stockage à -80 °C et décongelez-les sur la glace.
- Ajouter 5 μL du mélange de ligature à 50 μL d’E. coli DH5α compétent et garder le mélange sur la glace pendant 30 min.
- Chauffer le mélange à 42 °C pendant 90 s.
- Reposez-le sur la glace pendant 2 min.
- Récupérer la culture sur un shaker rotatif en 500 μL de supports LB pendant 1 h à 37 °C.
- Plaque 200 μL de la culture sur une plaque d’agarose de résistance à l’ampicilline LB et l’incuber toute la nuit à 37 °C.
7. Identification des plasmides recombinants corrects par PCR
- Choisissez 5 à 10 colonies bactériennes de la plaque LB et utilisez chacune d’entre elles pour inoculer un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de lb de médias avec ampicilline de 60 mg/mL.
- Incuber les tubes sur un shaker rotatif pendant 2-3 h.
- Effectuer la détection de plasmides recombinants corrects en utilisant des paires d’amorce spécifiques pour les oligonucléotides sgRNA [p. ex., amorce avant pour la construction vectorielle d’expression T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTGCCTCTCTACTGGCCGC, amorce inverse (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, produisant un amplicon de 287 bp(figure 3)].
- Préparer le mélange PCR (Tableau 2).
- Utilisez les conditions de cyclisme PCR suivantes : 95 °C pendant 5 min pour la prénaturation; 30 cycles de 95 °C pour 30 s pour la dénaturation, 60 °C pour 30 s pour l’annealage et 72 °C pour 30 s pour l’extension. Une fois les 30 cycles terminés, effectuez une dernière étape d’extension en chauffant pendant 5 min à 72 °C.
- Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose de 2 % de moins de 10 V/cm. Une bande de la bonne taille [p. ex., 287 pb] est considérée comme positive.
8. Valider la séquence de l’expression sgRNA plasmide
- Vérifiez la séquence des colonies positives pcr par sanger séquençage15 à l’aide de l’amorce inverse BbsI-R (voir étape 7.3). Cette amorce anneals sur le site en aval de l’insert oligo sgRNA. Le pX330-xCas9-T1 exprimant la séquence sgRNA contenant le protospacer TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGGGGGGGGGGGGGG et xCas9 a été construit.
- Utilisez l’amorce avant T1-F pour séquencer les colonies positives. L’avant ne pouvait pas donner l’information complète de séquence pour le site entourant le site d’insertion de l’oligo de sgRNA, parce que le fragment de 30-50 bp suivant l’amorce de séquençage ne pouvait pas être exactement lu dehors.
9. Construction d’un double vecteur de journaliste luciferase
- Synthétiser des fragments d’ADN de 300 à 500 pb contenant les cibles sgRNA et les subcloner en un double vecteur de reporter luciferase par double digestion [p. ex., sous-vêtements 440 bp moutons DKK2 exon1 fragment en pSSA-Dual plasmid16,17 en utilisant une double digestion avec AscI et SalI, résultant pSSA-Dual-DKK2].
- Synthétiser 300-500 bp fragments d’ADN contenant les cibles sgRNA. Notez que les séquences des fragments d’ADN doivent faire partie des séquences génomiques, qui pourraient être obtenues à partir du site Web du NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou de références connexes.
- Choisissez un vecteur de reporter à double luciferase approprié tel que pSSA-Dual16,17 (ou deux vecteurs exprimant respectivement luciferase et renilla luciferase) et digérer ce vecteur et les fragments d’ADN énoncés ci-dessus avec deux endonucleases tels que AscI et SalI.
- Enfin ligate ces deux fragments avec T4 ADN Ligase, résultant en pSSA-Dual-Target. Les détails de la double digestion et de la ligature sont affichés respectivement dans le tableau 3 et le tableau 4. Il convient de mentionner que le vecteur reporter doit être amplifié dans des souches bactériennes stables (telles que Top10), qui sont recommandées pour être cultivés avec une vitesse de rotation inférieure (généralement pas plus de 200 rpm), dans le but d’éviter la recombinaison de l’ADN.
10. Transfection cellulaire
- Extraire les plasmides sans endotoxine pour les vecteurs indiqués ci-dessus. Évaluer la pureté et la concentration des plasmides à l’aide d’instruments appropriés. Une concentration finale d’au moins 500 ng/μL et un rapport de pureté de 1,7-1,9 à absorption 260/280 nm (A260/A280) sont recommandés pour ces plasmides.
- Co-transfecter une lignée cellulaire appropriée telle que PIEC18 avec les plasmides en proportion égale (pX330-xCas9-T1 : pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmide pour chaque duplication lors de l’utilisation de 24 plaques de puits). Utilisez un vecteur vide tel que pX330-xCas9 comme un contrôle négatif.
- Un jour avant la transfection, plaques dans une plaque de culture de 24 puits à une densité de 2 x 105 cellules/puits. Les cellules seront prêtes pour la transfection quand elles atteignent une confluence de 60-80%.
- Avant le point de temps de transfection, retirez le supernatant autant que possible et ajoutez doucement 0,5 mL de médias frais pour chaque puits.
- Diluer le réaccente de transfection dans les supports DMEM au rapport de 1:25 et bien mélanger.
- Préparez un mélange maître d’ADN en diluant 0,5 μg d’ADN dans 25 μL de supports DMEM, puis ajoutez 1 μL de réagençage P3000.
- Ajouter de l’ADN dilué à chaque tube de réaccente de transfection diluée (rapport 1:1).
- Incuber de 10 à 15 min à température ambiante.
- Ajouter 50 μL de complexe ADN-lipide aux cellules.
- Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C. Ensuite, analyser les cellules transfected comme dans l’étape 11.
11. Détection de la double luciferase
- Préparer une quantité suffisante du tampon de lyse passive 1x (PLB) en ajoutant 1 volume de 5x PLB à 4 volumes d’eau distillée et bien mélanger.
- Lyse passive des cellules cultivés dans des plaques de culture de 24 puits.
- Retirez le milieu de croissance des cellules de culture et appliquez doucement un volume suffisant de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) pour laver la surface du récipient de culture. Faites tourbillonner brièvement le vaisseau pour enlever les cellules détachées et le milieu de croissance résiduel. Retirez complètement la solution de rinçage avant d’appliquer le réaccentiage PLB.
- Distribuez 100 μL de 1x PLB dans chaque culture bien pour couvrir complètement le monocouche cellulaire. Laissez reposer les plaques de culture pendant 20 min.
- Transférez le lysate dans un tube ou un flacon pour une manipulation ou un stockage plus long.
- Préparez le réagenage d’essai de luciferase (LAR) en résuspendant le substrat d’essai lyophilisé fourni de luciferase dans 10 mL du tampon fourni d’essai de luciferase.
- Préparez un volume suffisant pour effectuer le nombre désiré d’analyses de journaliste à double luciferase (100 μL de réacomplament par essai). Ajouter 1 volume de substrat d’arrêt de 50 x à 50 volumes de tampon d’arrêt dans un tube en verre ou en polypropylène siliconisé.
- Essai du journaliste à double luciferase (DLR)
- Luminomètres du programme pour fournir un délai de 2 secondes avant la lecture, suivi d’une période de mesure de 10 secondes.
- Predispense 100 μL de réagencé luciferase dans le nombre approprié de tubes luminomètres pour compléter le nombre désiré d’analyses DLR.
- Transférer soigneusement jusqu’à 20 μL de lysate cellulaire dans le tube de luminomètre contenant du LAR; mélanger par pipetting 2 ou 3 fois. Placez le tube dans le luminomètre et initiez la lecture.
- Retirer brièvement le tube d’échantillon du luminomètre, ajouter 100 μL de réageni d’arrêt et de vortex pour mélanger. Remplacez l’échantillon dans le luminomètre et initiez la lecture.
- Enregistrez l’activité de la renilla luciferase normalisée à l’activité luciferase de la lide de feu, à savoir la réciprocité du rapport affiché à l’écran.
- Jetez le tube de réaction et passez à l’analyse suivante.
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Representative Results
Les méthodes décrites dans ce protocole sont pour la construction de vecteurs d’expression sgRNA et xCas9, puis pour le dépistage d’optimisation des oligos sgRNA avec des efficacités de ciblage génétique relativement plus élevées. Ici, nous affichons un exemple représentatif de 3 cibles sgRNA pour les moutons DKK2 exon 1. SgRNA et xCas9 exprimant des vecteurs peuvent être construits en prédigestant l’épine dorsale vectorielle (Figure 2) suivie par ligating dans une série de courts fragments d’ADN à double brin à travers des paires d’oligo annealing. Les colonies positives pourraient être détectées par des paires d’amorce spécifiques guidées PCR( Figure 3). Un fragment d’ADN de 440 bp du mouton DKK2 exon 1 a été subcloned dans pSSA-Dual plasmid15 en utilisant la double digestion avec AscI et SalI, ayant pour résultat pSSA-Dual-DKK2. Les capacités de ciblage génétique de pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 et pX330-xCas9-T3 ont été simutanusly détectés (Figure 5), puis le dernier vecteur sgRNA a été identifié comme le relativement meilleur, que nous ramassons pour la recherche d’édition de gènes ovins à l’étape suivante.
Cette méthode de détection combine un mécanisme d’annealage à brin unique (SSA) (figure 1B et figure 4) avec un gène de rapport de luciferase afin de surveiller l’efficacité de coupe d’ADN. Comme l’illustre la figure 4, l’ASS est un processus amorcé lorsqu’une rupture de double brin est effectuée entre deux séquences répétées orientées dans la même direction. Des régions à brin unique sont créées à côté des ruptures qui s’étendent aux séquences répétées afin que les brins complémentaires puissent s’anneal les uns aux autres. Cet intermédiaire annealing peut être traité en digérant les queues échouées simples et en comblant les lacunes. Le gène Dual-Luciferase Reporter comprend principalement les gènes de luciferase de la lèblée Photinus pyralis et de Renilla reniformis (également connu sous le nom de pensée marine). Les activités des luciferases firefly et renilla sont mesurées séquentiellement à partir d’un seul échantillon. Lorsque la zone de reconnaissance qui a le codon de terminaison n’est pas coupée dans son milieu, le gène dans le système SSA est bloqué et ne peut pas être traduit en une protéine fonctionnelle. Lorsque le traitement a lieu, le système SSA fusionnera automatiquement la séquence homologue, et les séquences qui se chevauchent deviennent une séquence unique, le gène est réparé de recombinaison et peut ensuite être lu tout au long de la production d’une protéine fonctionnelle.
Figure 1 : Représentation schématique des différentes étapes du processus de clonage.
(A) Schéma de construction vectorielle sgRNA, adapté des protocoles de Feng Zhang Lab. ( B )Schémade construction vectorielle à double luciferase reporter (sélectionnez vecteur pSSA-DKK2 à titre d’exemple), fragments d’ADN Rluc-, Rluc-2 et Rluc-3 représentent trois parties de la séquence de codage pleine longueur de Renilla luciferase. McS représente « site de clonage multiple ». S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Prédégestion de l’épine dorsale vectorielle pX330-xCas9 avec BbsI.
1: Marqueur ADN, 2: pX330-xCas9 plasmide, 3: pX330-xCas9 plasmide digéré avec BbsI. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Paires d’amorce spécifiques guidées PCR pour la détection des vecteurs sgRNA DKK2-T1.
Les voies 1-7 indiquent des bandes PCR pour 7 colonies bactériennes différentes séparément. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Schémas pour annealing simple brin (SSA). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Essai de luciferase double avec le vecteur de reporter pSSA-DKK2 dans la ligne cellulaire PIEC.
Les activités ranilla luciferase luciferase sont significativement induites (P<0.01, Test de l’étudiant) dans PIEC par surexposition de pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 ou pX330-xCas9-T3 avec le changement de pli de 3,15, 5,84 ou 13,10, respectivement. Les barres d’erreur indiquent les écarts types (SD)(n=3) pour chaque groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom | Cibles d’ADN génomique (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGGCGGGCGG | T1-F: CACCGTGCCTCTCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 (T2) | ATCAAGTCCTCTCTGGGGGGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTCTGGGCGGGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 (en) | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGAGCTCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGCGGGCGCGCGCGC | ||||
Tableau 1 : cibles et oligos sgRNA conçus pour l’édition génétique des moutons DKK2.
| Composant PCR | Réaction de 25 μL |
| Amorce avant de 10 μM (p. ex. T1-F) | 1 μL |
| 10 μM Amorce inversée BbsI-R | 1 μL |
| Tampon PCR 10x | 2,5 μL |
| 2,5 mM de PNT | 1 μL |
| liquide bactérien | 1 μL |
| ADN Taq Polymése | 2,5 unités |
| Eau sans nucléase | Jusqu’à 25 μL |
Tableau 2 : Mélange pcr pour la détection positive des colonies bactériennes.
| Réactif | Volume |
| vecteur pSSA-Dual (fragment d’ADN synthétisé ou produit PCR) | 1-2 μg |
| Tampon CutSmart | 5 μL |
| Asci | 1 μL |
| SalI-HF | 1 μL |
| Eau distillée | jusqu’à 50 μL |
| Volume total | 50 μL |
Tableau 3 : Double digestion du vecteur pSSA-Dual et du fragment d’ADN synthétisé (ou produit PCR).
| Réactif | Volume |
| vecteur pSSA-Dual (prédigesté) | 0,5 μg |
| Fragments d’ADN contenant les cibles sgRNA (prédigestes) | 0,2 μg |
| T4 ADN Ligase Buffer (10x) | 1 μL |
| T4 ADN Ligase | 1 μL |
| Eau distillée | jusqu’à 10 μL |
| Volume total | 10 μL |
Tableau 4 : Réaction de ligature des fragments d’ADN contenant les cibles sgRNA en un vecteur prédigeste pSSA-Dual.
| Étape 1 : préparation des reagents | |
| Réavant transfection | 2 μL |
Tableau 5 : Détails de la transfection cellulaire dans une plaque de 24 puits.
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Discussion
Les procédures de clonage vectoriel sgRNA que nous avons décrites ici facilitent la production efficace de sgARN, avec la plupart des coûts dérivés de la commande d’oligonucléotide et du séquençage vectoriel. Alors que la méthode décrite est conçue pour permettre aux utilisateurs de générer des sgARN pour une utilisation avec CRISPR/Cas9, le protocole peut facilement être adapté pour une utilisation avec des orthologues Cas9 ou d’autres endonucleases guidés par l’ARN tels que Cpf1, introduisant des modifications mineures à l’épine dorsale vectorielle et les séquences de surplomb oligonucléotide.
Le protocole décrit ci-dessus fournira une cible sgRNA préférée en 10 jours lorsqu’il commence avec des oligonucléotides bien conçus. Cela inclut la conception sgRNA (1 h, étapes 1 - 2), dilution, aliquot et annealing des oligonucléotides (30 min, étape 3), digestion et purification du vecteur d’expression sgRNA (3 h, étape 4), clonage des oligonucléotides sgRNA en vecteur vide prédigesté (nuit, étapes 5 à 6), détection PCR des colonies (4-5 h, étape 7) et validation de la séquence de l’expression sgRNA plasmide (24 h , étape 8). Pendant ce temps, la construction et la validation de séquence du vecteur double luciferase reporter prend 5 - 7 d (étape 9). La préparation de la lignée cellulaire, la transfection plasmide et la détection de la double luciferase prennent environ 48 h (étapes 10 à 11). Les taux d’échec pour générer chaque plasmide sont de près de 0.
L’étape la plus critique du protocole est la digestion enzymatique restrictive du vecteur sgRNA par des enzymes telles que BbsI. Si la digestion n’est pas suffisante, alors le taux positif de colonies de bactéries pourrait être très faible. Alors que l’approche de détection basée sur pcr pourrait surveiller avec sensibilité l’efficacité de digestion et le taux positif. Les amorces avant, autrefois utilisées comme oligos avant du fragment inséré de sgRNA, assuraient une distinction très efficace entre les insertions droites et les vecteurs vides. L’un des avantages de cette stratégie est précisément la détection efficace des colonies positives par PCR avant séquençage de l’ADN. Comme indiqué ci-dessus, la vérification des séquences est encore relativement plus coûteuse par rapport à la PCR, surtout lorsque la digestion incomplète de BbsI se produit. En termes d’économie de ressources, nous avons jumelé les oligos avant pour l’annealing fragment sgRNA (tels que T1-F, T2-F ou T3-F) avec l’amorce de séquençage BbsI-R pour l’amplification PCR. Plus de 500 vecteurs sgRNA ont été construits avec succès en laboratoire grâce à cette stratégie d’identification des colonies.
Un autre mérite du protocole est la présélection efficace des cibles sgRNA candidat en utilisant le système de journaliste double luciferase. L’écart énorme de l’efficacité de coupe existe en effet à différentes cibles de sgRNA4. Identifier une cible sgRNA très efficace par test T7E1 ou test de nucléase arpenteur1 dans une lignée cellulaire difficile à transfecter prend du temps et du travail. En outre, pour l’amplification PCR dans l’analyse T7E1 ou l’essai de nucléase arpenteur, il est parfois difficile d’amplifier spécifiquement la séquence cible dans l’ADN du génome en raison de l’absence de paires d’amorcesappropriées 1. En revanche, l’essai double de journaliste de luciferase est indépendant des procédures d’amplification de génome. Auparavant, nous avons utilisé cette méthode pour obtenir sgRNAs très actif16,19.
Malgré les avantages évidents de la méthode décrite dans ce travail, il y a aussi certaines limites qui doivent être soulignées. Bien qu’elle assure un taux élevé de réussite, la méthode basée sur la luciferase pour la sélection sgRNA proposée pourrait être plus coûteuse que d’autres approches (analyse de fusion arpenteur/haute résolution, etc.) en raison de la nécessité de synthétiser la séquence cible. En outre, cette approche n’est pas plus rapide que l’une ou l’autre de ces méthodes alternatives en raison de la nécessité de cloner le plasmide reporter si une lignée cellulaire facile à transfect sera menée pour le ciblage génétique. Il est également nécessaire de préciser que la méthode est appropriée pour faire des KO, mais pas pour modifier des nucléotides spécifiques. En outre, seules les ruptures à double brin et non les ruptures à un seul brin peuvent être évaluées.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par le Programme de discipline scientifique des prairies de première classe de la province du Shandong (Chine), la National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), le Fonds spécial pour la recherche agro-scientifique dans l’intérêt public (201403071), l’évaluation nationale des risques d’un grand projet spécial de qualité et de sécurité des produits laitiers (GJFP201800804) et les projets de Qingdao People’s Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
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