Summary
Burada, hem CRISPR enzimini hem de ilişkili tek kılavuz RNA'ları (sgRNA) ifade eden verimli plazmid üretimi için aerodinamik bir yöntemi açıklayan bir protokol salıyoruz. Memeli hücrelerinin bu sgRNA/CRISPR vektörü ve çift iplikli break onarımını inceleyen çift luciferase muhabiri vektörü ile birlikte transfeksiyonu nakavt etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Yüksek verimli olmasına rağmen, crispr enzimi ile genomik bir alanın değiştirilmesi, önceden hedef bölgeye özgü bir sgRNA(lar) oluşturmayı gerektirir. Bu çalışma, DNA dizilimi öncesinde PCR tarafından pozitif kolonilerin etkin bir şekilde algılanmasını sağlayan bir strateji kullanarak verimli sgRNA vektörlerinin inşasına giden önemli adımları açıklamaktadır. CRISPR sistemi kullanılarak verimli genom düzenleme sgRNA gerektirdiğinden, zaman ve çabadan tasarruf etmek için aday sgRNA hedeflerinin önceden seçilmesi gereklidir. Çift iplikçikli break onarımı tek iplikçikli annealing ile inceleyerek nakavt verimliliğini değerlendirmek için çift luciferase muhabir sistemi geliştirilmiştir. Burada, belirli gen düzenleme için aday sgRNA vektörlerinden tercih edilen xCas9/sgRNA hedefini almak için bu muhabir sistemini kullanıyoruz. Belirtilen protokol 10 gün içinde tercih edilen bir sgRNA/CRISPR enzim vektörü sağlayacaktır (uygun şekilde tasarlanmış oligonükleotidlerden başlayarak).
Introduction
CRISPR sgRNA'lar 20 nükleotit dizisini (protospacer) oluşturur ve bu dizi1,2'yitamamlar. Son derece verimli olmasına rağmen, CRISPR/Cas sisteminin belirli bir genomik siteyi değiştirebilme yeteneği, hedef bölgeye özgü verimli bir sgRNA taşıyan bir vektörün üretilmesi için2. Bu makalede, sgRNA vektörünün oluşumundaki önemli adımlar açıklanmaktadır.
CRISPR/Cas sistemi kullanılarak başarılı genom düzenleme için, yüksek verimli sgRNA kullanımı önemli bir ön koşul3,4,5. Genom düzenlemede kullanılan mühendislik çekirdekleri farklı hedeflenen loci1'defarklı verimlilikler gösterdiğinden, zaman ve çabadan tasarruf etmek için aday sgRNA hedeflerinin ön seçimigereklidir 6,7,8,9. Çift luciferase muhabir sistemi tek iplikçik annealing 3 ,10ile çift iplikçik break onarım inceleyerek nakavt verimliliğini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Burada bu muhabir sistemini, belirli gen düzenleme için tasarlanmış farklı aday sgRNA vektörlerinden tercih edilen CRISPR sgRNA hedefini seçmek için kullanıyoruz. Burada belirtilen protokol, CRISPR SGRNA'ları oluşturmak ve değerlendirmek için son birkaç yıldır grubumuzda ve işbirliği laboratuvarlarımızda uygulanmaktadır.
Aşağıdaki protokol, ağ yazılımı aracılığıyla uygun sgRNA'nın nasıl tasarılabildiğini özetleyin. Uygun sgRNA'lar seçildikten sonra, gerekli oligonükleotidleri elde etmek için farklı adımları ve eşleştirilmiş oligonükleotidlerin pX330-xCas9 ekspresyon vektörüne eklenmesi için farklı adımları anlatıyoruz. Ayrıca, bu dizilerin önceden sindirilmiş bir ifade vektörü içine bağlanmasına dayalı sgRNA-ekspres ve çift luciferase muhabiri vektörlerinin biraraya getirilmesi için bir yöntem satıyoruz (2-10 adım, Şekil 1A). Son olarak, sgRNA'ların her biri için DNA kesme veriminin nasıl analiz edilebildiğini anlatıyoruz (11-12. adım).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA oligonükleotid tasarımı
- Cas-Designer çevrimiçi aracı (http://www.rgenome.net/cas-designer/) gibi çevrimiçi araçları kullanarak sgRNA'ları tasarla. PAM dizisi, Cas9'un kullanılmasına göre önemlidir. xCas9 için, ilgili PAM dizileri NG'dir ve eski başvuruyapılan Cas-Designer çevrimiçi aracı xCas9 ilgili sgRNA'lar oluşturabilir.
- Hedef te ve hedef dışı tahmin (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11için algoritmaları kapsayan sgRNA tasarım araçlarını kullanın. 0,2 veya daha büyük bir puan tercih edilir.
- Optimum tarama için en fazla 3 gen düzenleme hedefi seçin (örneğin, T1, T2 ve T3 koyun DKK2 ekson 1 gen hedeflemesi için tasarlanmıştır [Tablo 1]).
2. Oligonükleotid modifikasyonu
- SgRNA oligonükleotidini değiştirmek için, 3'-NG protospacer bitişik motifini (PAM) silmek için, protospacer dizisini (örneğin, T1 için başlangıç sırası: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]) saklar.
- Pentanükleotid CACCG'yi oligonun 5'ucuna ekleyin.
NOT: pX330-xCas9 iskeletinin bağlanması üzerine bu sekans, SgRNA transkripsiyonunu motive eden U6 organizatörün 3'-sonunu içerecektir. "CACC" dizisi, oligonun BbsI sindirilmiş pX330-xCas9 plazmidin çıkıntılarıyla eşleşin. Temel "G" RNA Polimeraz III organizatörleri bir ön koşuldur ve sgRNA transkripsiyon etkili başlangıç garanti (örneğin, T1 protospacer için 5'-CACCG dizi ekleyen, T1-F elde: CACCGTGCCTGCtCTCTTACTGGCCGC [25 nt]). 21 nt gRNA'nın dekolte verimi 20 nt gRNA 1,12,13,14'ündenönemli ölçüde farklıdır. Genellikle daha kısa bir protospacer üreterek 5'-G ile 20 nt kullanılması tavsiye edilir, bu mümkün değilse o zaman ekstra 5'-G ile 21 nt kullanılabilir. - Protospacer dizisinin ters tamamlayıcısı (rc) oluşturun.
NOT: Örneğin, T1 protospacer rc GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt) olduğunu. - Rc protospacer dizisinin 5'-sonuna AAAC'yi ekle. RC protospacer'In 3'ucuna ek bir C ekle.
NOT: "AAAC" dizisi, oligonükleotidin BbsI sindirilmiş pX330-xCas9 plazmidine klonlama için uygun olmasını sağlar. 3'-end üzerinde ek "C", yukarıda açıklanan sgRNA transkripsiyonu için "G" ile annealing için gereklidir (örneğin, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] T1 rc protospacer için son oligonükleotid dizisidir). - Oligonükleotidleri sipariş et.
3. Oligonükleotid tavlama
- Seyreltilmiş lyophilized oligonükleotidler 10 μM çift distile suda son konsantrasyon (ddH2O).
- Herhangi bir ekstra tampon eklemeden 1:1 oranı (örneğin, 20°L her) ana-ince bir duvar PCR tüp ileri ve ters oligonükleotidkarıştırın.
- Karışımı 95 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın ve sıcaklığı 10 dk boyunca 72 °C'ye kadar düşürün. Numuneyi PCR makinesinden çıkarıp RT'ye yerleştirmekten oluşan oda sıcaklığında (RT) bir soğuma süresi uygulayın.
NOT: Ligasyonunu kolaylaştırmak için oligonükleotid karışımlarının fosforilasyonunu yapmak gerekli değildir.
4. sgRNA/CRISPR vektör sindirim
- Seçilen pX330-xCas9 vektörünün 1 μg'ini BbsI ile (1 μg plazmid başına 10 birim enzim) 37 °C'de 2 saat boyunca sindirin(Şekil 2). PX330-xCas9 sgRNA ekspresyon vektörünün toplam hacmi50 μL, 5 μL 10x sindirim tamponu ve distile su içeren son hacmi elde etmek için sindirimini gerçekleştirin.
- 10 V/cm'nin altındaki %2'lik agarose jelden bant çıkarımı ile sindirilmiş vektörü arındırın ve daha sonra ticari bir jel çıkarma kiti kullanarak silika sütunu kullanarak arındırın.
5. Eklenmiş sgRNA oligonükleotidlerin ekspresyon vektörüne bağlanması
- BbsI sindirilmiş pX330-xCas9 vektörü (saflaştırılmış, 100 ng) ile annealed sgRNA oligonükleotidleri (4. adımdan karışımın 5 μL'si) karıştırın.
- 1 μL ligaz ve 1 0x ligaz tampon 1 μL ekleyin.
- 10 μL'ye kadar uygun hacimde distile su ekleyin.
- Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
6. Yetkin hücre dönüşümü
- E. coli DH5α yetkili hücreleri -80 °C'deki depodan çıkarın ve buzüzerinde eritin.
- 50 μL'lik e. coli DH5α'ya 5 μL ligasyon karışımı ekleyin ve karışımı 30 dakika boyunca buzüzerinde tutun.
- Isı 90 s için 42 °C karışımı şok.
- 2 dakika buz üzerinde dinlendirin.
- 37 °C'de 1 saat boyunca 500 μL LB ortamdaki bir döner çalkalayıcıda kültürü kurtarın.
- Plaka 200 μL bir ampisilin direnci LB agarose plaka üzerinde kültür ve 37 °C gecede kuluçka.
7. DOĞRU rekombinant plazmidlerin PCR ile tanımlanması
- LB plakasından 5 ila 10 bakteri kolonisi seçin ve her birini 60 mg/mL ampisilin içeren 1 mL'lik bir 1,5 mL tüp içeren bir tüpü aşılamak için kullanın.
- Tüpleri 2-3 saat döner çalkalayıcıya inküler.
- SgRNA oligonükleotidler için spesifik astar çiftleri kullanarak doğru rekombinant plazmidlerin saptanması gerçekleştirin [örn. T1 sgRNA ekspresyon vektör konstrüksiyonu için ileri astar (T1-F): CACCGTGCCTGGCTCTTACTGGCCGC, ters astar (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, üreten 287 bp amplicon (Şekil 3)].
- PCR karışımını hazırlayın (Tablo 2).
- Aşağıdaki PCR bisiklet koşullarını kullanın: Ön denatürasyon için 5 dk için 95 °C; Denatürasyon için 30 s için 95 °C' lik 30 devir, annelik için 30 s için 60 °C ve uzatma için 30 s için 72 °C. 30 döngü tamamlandıktan sonra, 72 °C'de 5 dakika ısıtılarak son bir uzatma adımı atın.
- PCR ürününü 10 V/cm'nin altında %2'lik agarose jel üzerinde çalıştırın. Doğru boyutta bir bant [örneğin, 287 bp] pozitif olarak kabul edilir.
8. SgRNA ekspresyonu plazmid dizisini doğrulayın
- Ters astar BbsI-R kullanarak15 Sanger sıralama (adım 7.3 bakınız) pcr pozitif kolonilerin sırasını doğrulayın. Bu astar sgRNA oligo eklemek aşağı sitede anneals. PX330-xCas9-T1 ifade sgRNA dizisi protospacer TGCCTGCTCTTACTGGCCGCGG ve xCas9 içeren inşa edilmiştir.
- Pozitif kolonileri sıralamak için ileri astar T1-F'yi kullanın. SgRNA oligo ekleme sitesini çevreleyen site için tam sıra bilgisi veremedi, çünkü sıralama astarını takip eden 30-50 bp'lik parça tam olarak okunamadı.
9. Çift luciferase muhabir vektörü yapımı
- SgRNA hedeflerini içeren 300-500 bp DNA parçalarını sentezleyin ve çift sindirim yoluyla çift luciferase muhabiri vektöre batırın [örneğin, subclone 440 bp koyun DKK2 ekson1 parçası pSSA-Dual plasmid16,17 AscI ve SalI ile çift sindirim kullanarak, sonuçlanan pSSA-Dual-DKK2].
- SGRNA hedeflerini içeren 300-500 bp DNA parçasını sentezleyin. DNA parçalarının dizilerinin, NCBI web sitesinden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) veya ilgili referanslardan elde edilebilen genomik dizilerin parçaları olması gerektiğini unutmayın.
- PSSA-Dual16,17 (veya sırasıyla firefly luciferase ve renilla luciferase ifade eden iki vektör) gibi uygun bir çift luciferase muhabir vektör seçin ve sonra bu vektör ve DNA parçaları AscI ve SalI gibi iki endonucleases ile yukarıda belirtilen sindirmek.
- Son olarak bu iki parçayı T4 DNA Ligase ile bağlayarak pSSA-Dual-Target'a dönüştürün. Çift sindirim ve ligasyon için ayrıntılar sırasıyla Tablo 3 ve Tablo 4'tegörüntülenir. Bu muhabir vektör dna rekombinasyon önlemek amacıyla, daha düşük dönme hızı (genellikle en fazla 200 rpm) ile kültüre önerilir istikrarlı bakteri suşları (Top10 gibi) güçlendirilmiş olması gerektiğini belirtmekte değerlidir.
10. Hücre transfeksiyonu
- Yukarıda belirtilen vektörler için endotoksiniçermeyen plazmidleri ayıklayın. Plazmidlerin saflığını ve konsantrasyonu uygun aletler kullanarak değerlendirin. Bu plazmidler için en az 500 ng/μL'lik bir konsantrasyon ve 260/280 nm (A260/A280) saflık oranı 1.7-1.9 olarak önerilir.
- Piec18 gibi uygun bir hücre hattını, plazmidler ile eşit oranda (örneğin, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 24 kuyu plakası kullanırken her çoğaltma için 0,5 μg plazmid) eş-transfect. Negatif kontrol olarak pX330-xCas9 gibi boş bir vektör kullanın.
- Transfeksiyondan bir gün önce, 2x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 24 kuyulu bir kültür plakasında plaka hücreleri. Hücreler %60-80'lik bir birleşme elde ettiklerinde transfeksiyona hazır olurlar.
- Transfeksiyon zaman noktasından önce, supernatant'ı mümkün olduğunca çıkarın ve her kuyu için 0,5 mL taze ortam ekleyin.
- DMEM ortamlarında seyreltik transfeksiyon reaktifi 1:25 oranında ve iyice karıştırın.
- 25 μL DMEM ortamlarında 0,5 μg DNA seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın ve sonra 1 μL P3000 reaktifi ekleyin.
- Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi (1:1 oranı) her tüp seyreltilmiş DNA ekleyin.
- Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçka.
- Hücrelere 50 μL DNA-lipid kompleksi ekleyin.
- 37 °C'de 24 saat kuluçka hücreleri. Daha sonra, Adım 11'deki gibi transfected hücreleri analiz edin.
11. Çift luciferase algılama
- 4 hacimdist suya 1 hacim 5x PLB ekleyerek 1x pasif lisis tampon (PLB) yeterli miktarda hazırlayın ve iyice karıştırın.
- 24 kuyulu kültür plakalarında kültürlenmiş hücrelerin pasif lysis.
- Kültür hücrelerinden büyüme ortamını çıkarın ve kültür kabının yüzeyini yıkamak için yeterli miktarda fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın. Müstakil hücreleri ve artık büyüme ortamı kaldırmak için kısa bir süre gemi girdap. PLB reaktifini uygulamadan önce durulama çözeltisini tamamen çıkarın.
- Hücre monokatmanını tamamen kapsayacak şekilde her kültüre 100°L 1x PLB dağıtın. Kültür tabakları 20 dk bekletin.
- Daha fazla kullanım veya depolama için bir tüp veya şişe için lysate aktarın.
- Verilen luciferase issay arabelleği 10 mL'de sağlanan lyiferase ispat alt tabakasını yeniden sulandırarak luciferase issay reaktifini (LAR) hazırlayın.
- İstenilen çift luciferase muhabir tahlillerini (tahlil başına 100 μL reaktif) gerçekleştirmek için yeterli hacim hazırlayın. Bir cam veya silikonlu polipropilen tüp içinde stop tampon 50 hacimli 50 x stop substrat 1 hacim ekleyin.
- Çift luciferase muhabiri (DLR) teşp
- Program luminometreler 2 saniyelik önceden okuma gecikmesi sağlamak için, ardından 10 saniyelik bir ölçüm dönemi.
- İstenilen sayıda DLR Tahlil'i tamamlamak için uygun sayıda luminosmetre tüpüne 100 μL luciferase tahlil reaktifi öndispense.
- 20°L'ye kadar hücre lisatını LAR içeren luminometre tüpüne dikkatlice aktarın; 2 veya 3 kez pipetleme ile karıştırın. Tüpü luminometreye yerleştirin ve okumaya başla.
- Örnek tüpü luminometreden çıkarın, karıştırmak için 100 μL stop reaktifi ve girdap ekleyin. Luminometredeki örneği değiştirin ve okumayı başlatın.
- Firefly luciferase aktivitesi, yani ekranda görüntülenen oranın karşılıklı olarak normalleştirilmiş renilla luciferase aktivitesini kaydedin.
- Reaksiyon tüpünü atın ve bir sonraki tgörünüşe devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde belirtilen yöntemler sgRNA ve xCas9 ekspresyon vektörlerinin yapımı ve daha sonra nispeten daha yüksek gen hedefleme verimliliğine sahip sgRNA oligolarının optimizasyon taraması içindir. Burada koyun DKK2 ekson 1 için 3 sgRNA hedeflerinin temsili bir örnek görüntüler. SgRNA ve xCas9 ifade vektörleri vektör omurgasının önceden sindirilmesi yle(Şekil 2)oluşturulabilir ve ardından oligo çiftçifti aracılığıyla kısa çift iplikli DNA parçaları bir dizi bağlanabilir. Pozitif koloniler belirli astar çiftleri güdümlü PCR(Şekil 3)ile tespit edilebilir. Koyun DKK2 ekson 1'den 440 bp DNA parçası AscI ve SalI ile çift sindirim kullanılarak pSSA-Dual plazmid15'e batırıldı ve pSSA-Dual-DKK2 sonuçlandı. pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 ve pX330-xCas9-T3'ün gen hedefleme kapasiteleri simutanusly tespit edildi(Şekil 5), ve daha sonra son sgRNA vektörü nispeten daha iyi olarak tanımlandı, bir sonraki adımda koyun gen düzenleme araştırması için aldığımız.
Bu algılama yöntemi, DNA kesme verimliliğini izlemek için tek bir iplikçik annealing (SSA) mekanizmasını(Şekil 1B ve Şekil 4)luciferase report geni ile birleştirir. Şekil 4'tegösterildiği gibi, SSA aynı yöne yönlendirilmiş iki tekrarlanan dizi arasında çift iplikçik kopuşu yapıldığında başlatılan bir işlemdir. Tek iplikçikli bölgeler, birbirini tamamlayan iplikçiklerin birbirini anlayabilmesi için tekrarlanan dizilere kadar uzanan sonları bitişik olarak oluşturulur. Bu annealing ara tek iplikçikli kuyrukları sindirerek ve boşlukları doldurarak işlenebilir. Çift-Luciferase Reporter geni esas olarak ateş böceği Photinus pyralis ve Renilla reniformis (deniz pansisi olarak da bilinir) gelen luciferase genleri içerir. Firefly ve renilla luciferases faaliyetleri tek bir örnekten sırayla ölçülür. Sonlandırma kodonuna sahip tanıma alanı nın ortasında kesilmediğinde, SSA sistemindeki gen bloke edilir ve fonksiyonel bir proteine dönüştürülemez. İşlem gerçekleştiğinde, SSA sistemi homolog diziyi otomatik olarak birleştirir ve üst üste binen diziler tek bir dizi haline gelir, gen rekombinasyon onarılır ve daha sonra fonksiyonel bir protein insadan okunabilir.
Şekil 1: Klonlama sürecinin farklı adımlarının şematik gösterimi.
(A) SgRNA vektör konstrüksiyon şeması, Feng Zhang Lab protokollerinden uyarlanmıştır. (B) Şematik çift luciferase muhabiri vektör oluşturma (örnek olarak vektör pSSA-DKK2 seçin), DNA parçaları Rluc-, Rluc-2 ve Rluc-3 Renilla luciferase tam uzunlukta kodlama dizisinin üç bölümünü temsil eder. MCS "birden çok klonlama sitesi"ni temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BbsI ile vektör omurgapX330-xCas9 predigesting.
1: DNA Marker, 2: pX330-xCas9 plazmid, 3: pX330-xCas9 plazmid BbsI ile sindirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DKK2-T1 sgRNA vektör tespiti için pcr güdümlü özel astar çiftleri.
Lanes 1-7 ayrı ayrı 7 farklı bakteri kolonileri için PCR bantları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek iplikçik annealing (SSA) için şemalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücre hattı PIEC muhabir vektör pSSA-DKK2 ile çift luciferase tsay.
Ranilla luciferase etkinlikleri, sırasıyla 3.15, 5.84 veya 13.10 kat değişimi ile piec'te pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 veya pX330-xCas9-T3'ün aşırı eksiltülmesiyle (P<0.01, Student's t testi) önemli ölçüde indüklenir. Hata çubukları her grup için standart sapmaları (SD)(n=3) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | Genomik DNA Hedefleri (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGTCCTCTGGGGGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGCGGGC | ||||
Tablo 1: Koyun DKK2 gen düzenleme için tasarlanmış sgRNA hedefleri ve oligolar.
| PCR Bileşeni | 25 μL reaksiyonu |
| 10 μM İleri Astar (örn. T1-F) | 1 μL |
| 10 μM Ters Astar BbsI-R | 1 μL |
| 10x PCR Tampon | 2,5 μL |
| 2,5 mM dNTPs | 1 μL |
| bakteriyel sıvı | 1 μL |
| DNA Tak Polimeraz | 2,5 adet |
| Nükleaziçermeyen su | 25 μL'ye kadar |
Tablo 2: Pozitif bakteri kolonilerinin saptanması için PCR karışımı.
| Reaktif | Birim |
| pSSA-Dual vektör (sentezlenmiş DNA parçası veya PCR ürünü) | 1-2 μg |
| CutSmart Arabellek | 5 μL |
| Asci | 1 μL |
| Sali-HF | 1 μL |
| Distile su | 50 μL'ye kadar |
| Toplam hacim | 50 μL |
Tablo 3: pSSA-Dual vektörün ve sentezlenmiş DNA parçasının (veya PCR ürününün) çift sindirimi.
| Reaktif | Birim |
| pSSA-Çift vektör (önceden sindirilmiş) | 0,5 g |
| SGRNA hedeflerini içeren DNA parçaları (önceden sindirilmiş) | 0,2 μg |
| T4 DNA Ligase Tampon (10x) | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| Distile su | 10 μL'ye kadar |
| Toplam hacim | 10 μL |
Tablo 4: SGRNA hedeflerini içeren DNA parçalarının önceden sindirilmiş bir pSSA-Dual vektöre bağlanması.
| Adım 1: reaktif hazırlama | |
| Transfeksiyon reaktifi | 2 μL |
Tablo 5: 24 kuyu plakasında hücre transfeksiyonu ayrıntıları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tanımladığımız sgRNA vektör klonlama prosedürleri, maliyetlerin çoğu oligonükleotid siparişi ve vektör diziliminden elde edilen sgRNA'ların verimli üretimini kolaylaştırır. Ana hatlarıyla anlatılan yöntem, kullanıcıların CRISPR/Cas9 ile kullanılmak üzere sgRNA'lar oluşturmasına olanak sağlamak üzere tasarlanmış olsa da, protokol, Cas9 ortologları veya Cpf1 gibi diğer RNA güdümlü endoklezazlarla kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir ve vektör omurgasında ve oligonükleotid sarkan dizilerde küçük değişiklikler yapabilir.
Yukarıda özetlenen protokol, uygun şekilde tasarlanmış oligonükleotidlerle başlarken 10 gün içinde tercih edilen bir sgRNA hedefi sağlayacaktır. Buna sgRNA tasarımı (1 saat, adım 1 - 2), seyreltme, aliquot ve oligonükleotidlerin tavallanması (30 dk, adım 3), sgRNA ekspresyon vektörünün (3 saat, adım 4), sgRNA oligonükleotidlerinin önceden sindirilmiş boş bir vektöre klonlanması (geceleme, adım 5 - 6), kolonilerin PCR tespiti (4-5 saat, adım 7) ve sgRNA ekspresyon plasmid dizisinin doğrulanması (24 saat , adım 8). Bu arada, çift luciferase muhabir vektör inşaat ve dizi doğrulama alır 5 - 7 d (adım 9). Hücre hattı, plazmid transfeksiyonu ve çift luciferase tespiti hazırlanması yaklaşık 48 saat (adım 10 - 11) alır. Her plazmid üretmek için başarısızlık oranları neredeyse 0'dır.
Protokolün en kritik adımı BbsIgibi enzimler tarafından sgRNA vektörünün kısıtlayıcı enzim sindirimidir. Sindirim yeterli değilse, o zaman bakteri kolonilerinin pozitif oranı çok düşük olabilir. PCR tabanlı algılama yaklaşımı hassas sindirim verimliliği ve pozitif oranı izleyebilirsiniz iken. Daha önce eklenen sgRNA parçasının ileri oligoları olarak kullanılan ileri astarlar, doğru eklemelerin ve boş vektörlerin son derece etkili bir şekilde ayrımını sağlamıştır. Bu stratejinin avantajlarından biri dna dizilimi önce PCR tarafından pozitif kolonilerin verimli bir şekilde tespit olmasıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, dizi doğrulama hala pcr göre nispeten daha pahalı, BbsI eksik sindirim özellikle oluşur. Kaynak tasarrufu açısından, sgRNA parça tavlama (T1-F, T2-F veya T3-F gibi) için ileri oligoları PCR amplifikasyon için sıralama astarı BbsI-R ile eşledik. 500'den fazla sgRNA vektörü koloni tanımlama stratejisi ile laboratuvarda başarıyla inşa edilmiştir.
Protokolün bir diğer değeri de çift luciferase muhabir sistemi kullanılarak aday sgRNA hedeflerinin etkili bir şekilde ön seçilmesidir. Kesme verimliliği büyük varyans gerçekten farklı sgRNA hedefleri4var . T7E1 tetkik veya Surveyor nükleaz tsay1 ile transfect zor hücre hattında yüksek verimli bir sgRNA hedefi belirlemek için zaman ve emek alıcıdır. Buna ek olarak, T7E1 testi veya Surveyor nükleaz testinde PCR amplifikasyonu için, uygun astar çiftleri1eksikliği nedeniyle genom DNA'sındaki hedef diziyi özel olarak yükseltmek bazen zordur. Buna karşılık, çift luciferase muhabir tsay genom amplifikasyon prosedürleri bağımsızdır. Daha önce biz son derece aktif sgRNA16,19almak için bu yöntemi kullandık.
Bu çalışmada açıklanan yöntemin net avantajlarına rağmen, işaret edilmesi gereken bazı sınırlamalar da vardır. Yüksek bir başarı oranı sağlasa da, önerilen sgRNA seçimi için luciferase tabanlı yöntem, hedef sıranın sentezlenmesi gereği nden dolayı diğer yaklaşımlardan (surveyor/high resolution melt analysis, vb.) daha pahalı olabilir. Buna ek olarak, gen hedeflemesi için kolay transfect hücre hattı yapılacaksa, muhabir plazmidinklonlanması gerektiğinden dolayı bu alternatif yöntemlerden ikisine de göre daha hızlı değildir. Ayrıca, yöntemin nakavt yapmak için uygun olduğunu, ancak belirli nükleotitleri değil, Ayrıca, sadece çift iplikli molalar ve tek iplikçikli olmayan molalar değerlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Bu proje Shandong Eyaleti Birinci Sınıf Otlak Bilim Disiplin Programı (Çin), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31301936, tarafından finanse edilmiştir 31572383), Kamu Yararına Tarımsal Bilimsel Araştırma Özel Fonu (201403071), Ulusal risk değerlendirme ana projesi süt ürünleri kalitesi ve güvenliği (GJFP201800804) ve Qingdao Halk Geçim Bilimi ve Teknolojisi Projeleri (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
