Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver en strømlinet metode til effektiv generering af plasmider, der udtrykker både CRISPR-enzymet og tilhørende enkelt guide RNA (sgRNAs). Co-transfektion af pattedyrceller med denne sgRNA/ CRISPR vektor og en dobbelt luciferase reporter vektor, der undersøger dobbelt-streng pause reparation giver mulighed for evaluering af knockout effektivitet.
Abstract
Selvom det er meget effektivt, kræver en ændring af et genomisk sted ved CRISPR-enzymet, at der på forhånd er skabt et sgRNA, der er unikt for målstederne. Dette arbejde beskriver de vigtigste trin, der fører til konstruktion af effektive sgRNA-vektorer ved hjælp af en strategi, der gør det muligt for en effektiv detektion af de positive kolonier ved PCR forud for DNA sekventering. Da effektiv genomredigering ved hjælp af CRISPR-systemet kræver et yderst effektivt sgRNA, er det nødvendigt med et forvalg af kandidatsgRNA-mål for at spare tid og kræfter. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-strand pause reparation via enkelt streng glødning. Her bruger vi dette reportersystem til at opfange det foretrukne xCas9/sgRNA-mål fra kandidatsgRNA-vektorer til specifik genredigering. Den protokol, der er skitseret, vil give en foretrukken sgRNA/CRISPR enzymvektor om 10 dage (begyndende med passende designede oligonukleotider).
Introduction
CRISPR sgRNA'erne omfatter en 20-nukleotidsekvens (protospaceren), som supplerer den genomiske målsekvens1,2. Selv om crispr/cas-systemet er meget effektivt, kræver det, at der oprettes en vektor, der bæreret effektivt sgRNA, der er unikt for målsted(-2). Dette papir beskriver de vigtigste trin i generationen af denne sgRNA vektor.
For vellykket genomredigering ved hjælp af CRISPR/Cas-systemet er brugen af højeffektive sgRNA'er en afgørendeforudsætning 3,4,5. Da konstruerede nukleaser, der anvendes i genomredigering, manifesterer forskellige effektivitetsgevinster ved forskellige målrettede loci1, er det nødvendigt med en forhåndsudvælgelse af kandidatsgRNA-mål for at spare tid ogindsats 6,7,8,9. En dobbelt luciferase reporter system er blevet udviklet til at evaluere knockout effektivitet ved at undersøge dobbelt-streng pause reparation via enkelt streng glødning3,10. Her bruger vi dette reportersystem til at vælge et foretrukket CRISPR sgRNA-mål fra forskellige kandidatsgRNA-vektorer designet til specifik genredigering. Protokollen, der er anført her, er blevet implementeret i vores gruppe og samarbejdende laboratorier i de sidste par år for at generere og evaluere CRISPR sgRNAs.
Følgende protokol opsummerer, hvordan man designer egnet sgRNA via netværkssoftware. Når de egnede sgRNAs er valgt, beskriver vi de forskellige trin for at opnå de nødvendige oligonukleotider samt tilgangen til indsættelse af de parrede oligonukleotider i pX330-xCas9-ekspressionsvektoren. Vi præsenterer også en metode til at samle sgRNA-udtryk og dobbelt luciferase reporter vektorer baseret på ligation af disse sekvenser i en præedigested udtryk vektor (trin 2-10, Figur 1A). Endelig beskriver vi, hvordan man analyserer DNA-skæreeffektiviteten for hver af sgRNAs (trin 11-12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA oligonucleotid design
- Design sgRNAs ved hjælp af online værktøjer såsom Cas-Designer online værktøj (http://www.rgenome.net/cas-designer/). PAM-sekvensen er vigtig baseret på, at Cas9 anvendes. For xCas9 er de relevante PAM-sekvenser NG, og det tidligere henviste Cas-Designer onlineværktøj kan generere xCas9 relevante sgRNAs.
- Brug sgRNA-designværktøjer, der omfatter algoritmer til on- og off-target forudsigelse (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. En score på 0,2 eller større foretrækkes.
- Vælg op til 3 mål for genredigering for en optimal screening (f.eks. blev T1, T2 og T3 designet til får DKK2 exon 1 genmålretning [tabel 1]).
2. Oligonukleotid ændring
- Hvis du vil ændre sgRNA oligonucleotid, skal du slette det 3'-NG protospacer tilstødende motiv (PAM), mens protospacersekvensen (f.eks. startsekvens for T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Tilsæt pentanucleotide CACCG til 5'-enden af oligo.
BEMÆRK: Ved ligation til pX330-xCas9 skelettet, vil denne sekvens indeholde 3'-end af U6 promotor motiverende sgRNA transskription. Arrayet "CACC" garanterer, at oligo matcher med udhæng af BbsI-fordøjet pX330-xCas9 plasmid. Basen "G" er en forudsætning for RNA Polymerase III initiativtagere og garanterer en effektiv opstart af sgRNA transskription (f.eks vedlægge 5'-CACCG array til protospacer af T1, opnå T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). Spaltningseffektiviteten på 21 nt gRNA er væsentligt forskellig fra 20 nt gRNA1,12,13,14. Det anbefales generelt at bruge 20 nt med 5'-G ved at generere en kortere protospacer, hvis dette ikke er muligt, kan der anvendes 21 nt med ekstra 5'-G. - Opret et omvendt supplement (rc) af protospacersekvensen.
BEMÆRK: F.eks. er rc af T1 protospacer GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Tilføj AAAC til 5'-end af rc protospacer sekvens. Tilføj en ekstra C til 3'-end af rc protospacer.
BEMÆRK: "AAAC"-sekvensen sikrer, at oligonukleotid er egnet til kloning i den BbsI-fordøjede pX330-xCas9 plasmid. Den yderligere "C" på 3'-end er afgørende for udglødning med initiering "G" for sgRNA transskription beskrevet ovenfor (f.eks AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] er den endelige oligonucleotid sekvens for T1 rc protospacer). - Bestil oligonukleotides.
3. Oligonukleotid glødning
- Fortyndet lyophiliserede oligonukleotider til en endelig koncentration på 10 μM i dobbelt destilleret vand (ddH2O).
- Bland fremad- og bakoligonukleotider i et pcrrør med tynd væg, der danner et 1:1-forhold (f.eks. 20 μL hver) uden at tilsætte ekstra buffer.
- Blandingen inkuberes ved 95 °C i 5 min. og derefter ned til 72 °C i 10 min. Følg med en afkølingsperiode ved stuetemperatur (RT), der består i blot at fjerne prøven fra PCR-maskinen og placere den på RT.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at fosforlate oligonukleotidblandingerne for at lette ligationen.
4. sgRNA/CRISPR vektor fordøjelse
- Fordøje 1 μg af den valgte pX330-xCas9 vektor med BbsI (10 enheder af enzym pr 1 μg plasmid) i 2 timer ved 37 °C (Figur 2). Udfyld fordøjelsen af pX330-xCas9 sgRNA-ekspressionsvektoren i et samlet volumen på 50 μL, indeholdende 5 μL 10x fordøjelsesbuffer og destilleret vand for at opnå det endelige volumen.
- Rengør den fordøjede vektor ved ekstraktion fra en 2% agarosegel under 10 V/cm og rengør derefter ved hjælp af en silicasøjle ved hjælp af et kommercielt gelekstraktionssæt.
5. Ligation af de udglødede sgRNA oligonukleotider til ekspressionsvektoren
- De udglødede sgRNA-oligonukleotider (5 μL af blandingen fra trin 4) blandes med den BbsI-fordøjede pX330-xCas9-vektor (renset, 100 ng).
- Der tilsættes 1 μL ligase og 1 μL 10x ligasebuffer.
- Tilsæt destilleret vand med passende volumen, op til 10 μL.
- Inkuber natten over ved 4 °C.
6. Kompetent celletransformation
- E. coli DH5α-kompetente celler ud af lageret ved -80 °C og tø den op på is.
- Der tilsættes 5 μL af ligationsblandingen til 50 μL kompetent E. coli DH5α, og blandingen opbevares på is i 30 minutter.
- Blandingen stød ved 42 °C ved 90 s.
- Hvil det på is i 2 min.
- Genvind kulturen på en roterende shaker i 500 μL LB-medier i 1 time ved 37 °C.
- Plade 200 μL af kulturen på en ampicillin modstand LB agarose plade og inkubere det natten over ved 37 °C.
7. Identifikation af de korrekte rekombinant plasmider ved PCR
- Vælg 5 til 10 bakteriekolonier fra LB-pladen, og brug hver af dem til at vaccinere et 1,5 ml rør, der indeholder 1 ml LB-medier med 60 mg/ml ampicillin.
- Inkuber rørene på en roterende shaker i 2-3 timer.
- Påvisning af korrekte rekombinant plasmider udføres ved hjælp af specifikke primerpar til sgRNA oligonukleotider [f.eks. fremadprimer til T1 sgRNA-eksktorkonstruktion (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, omvendt primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, der producerer en 287 bp amplicon (Figur 3)].
- Klargør PCR-blandingen (tabel 2).
- Brug følgende PCR-cykelforhold: 95 °C i 5 minutter til fordenaturering; 30 cyklusser på 95 °C for 30 s til denaturering, 60 °C for 30 s til udglødning og 72 °C i 30 s til forlængelse. Når de 30 cyklusser er afsluttet, udføres et sidste forlængelsestrin ved opvarmning i 5 min ved 72 °C.
- Kør PCR-produktet på en 2% agarosegel under 10 V/cm. Et bånd i den rigtige størrelse [f.eks. 287 bp] betragtes som positivt.
8. Valider sekvensen af sgRNA-udtrykket plasmid
- Kontroller sekvensen af PCR-positive kolonier ved Sanger sekventering15 ved hjælp af den omvendte primer BbsI-R (se trin 7.3). Denne primer gløder på stedet nedstrøms for sgRNA oligo indsætte. PX330-xCas9-T1 udtrykker sgRNA sekvens, der indeholder protospacer TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG og xCas9 blev bygget.
- Brug den forreste primer T1-F til at sekvensere de positive kolonier. Den forreste kunne man ikke give fuldstændig sekvens oplysninger om webstedet omkring indsættelsesstedet for sgRNA oligo, fordi 30-50 bp fragment efter sekventering primer ikke kunne være præcis læses op.
9. Opførelse af dobbelt luciferase reporter vektor
- Syntetisere 300-500 bp DNA fragmenter, der indeholder sgRNA mål og subclone det i en dobbelt luciferase reporter vektor gennem dobbelt fordøjelse [f.eks subclone 440 bp får DKK2 exon1 fragment i pSSA-Dual plasmid16,17 ved hjælp af dobbelt fordøjelse med AscI og SalI, der resulterer pSSA-Dual-DKK2).
- Syntetisere 300-500 bp DNA fragmenter, der indeholder sgRNA mål. Bemærk, at sekvenserne af DNA-fragmenterne skal være dele af de genomiske sekvenser, som kan fås fra NCBI's websted (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eller relaterede referencer.
- Vælg en egnet dobbelt luciferase reporter vektor såsom pSSA-Dual16,17 (eller to vektorer udtrykke firefly luciferase og renilla luciferase henholdsvis) og derefter fordøje denne vektor og DNA fragmenter angivet ovenfor med to endonucleaser såsom AscI og SalI.
- Endelig ligate disse to fragmenter med T4 DNA Ligase, hvilket resulterer i pSSA-Dual-Target. Nærmere oplysninger om dobbeltfordring og ligation vises i henholdsvis tabel 3 og tabel 4. Det er værd at nævne, at reporter vektor bør forstærkes i stabile bakterier stammer (såsom Top10), som anbefales at blive dyrket med lavere rotationshastighed (typisk ikke mere end 200 rpm), med henblik på at undgå DNA rekombination.
10. Celle transinfektion
- Ekstrakt endoksin-fri plasmider for vektorer anført ovenfor. Vurder plasmids renhed og koncentration ved hjælp af egnede instrumenter. En endelig koncentration på ikke mindre end 500 ng/μL og et renhedsforhold på 1,7-1,9 ved absorbans 260/280 nm (A260/A280) anbefales til disse plasmider.
- Co-transfect en passende cellelinje som PIEC18 med plasmiderne i lige stor andel (f.eks. pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmid for hver duplikering ved brug af 24 brøndplade). Brug en tom vektor som f.eks.
- En dag før transfektion, pladeceller i en 24-brønd kultur plade på en tæthed på 2 x 105 celler / godt. Celler vil være klar til transfektion, når de opnår et sammenløb på 60-80%.
- Før transfektionstidspunktet fjernes supernatanten så meget som muligt, og der tilsættes forsigtigt 0,5 ml frisk medie for hver brønd.
- Fortyndes transinfektion reagens i DMEM medier ved forholdet 1:25 og bland godt.
- Der forbered masterblandingen af DNA ved at fortynde 0,5 μg DNA i 25 μL DMEM-medier, og der tilsættes derefter 1 μL P3000 reagens.
- Der tilsættes fortyndet DNA til hvert rør af fortyndet transinfektions reagens (1:1-forhold).
- Inkuber i 10-15 min ved stuetemperatur.
- Tilsæt 50 μL DNA-lipidkompleks til celler.
- Inkuber celler i 24 timer ved 37 °C. Derefter analysere transfekterede celler som i trin 11.
11. Dobbelt-luciferase detektion
- Der klargøres en tilstrækkelig mængde af 1x passiv lysisbuffer (PLB) ved at tilsætte 1 volumen på 5x PLB til 4 volumener destilleret vand og blandes godt.
- Passiv lysis af celler dyrket i 24-brønd kultur plader.
- Fjern vækstmediet fra de dyrkede celler, og påfør forsigtigt en tilstrækkelig mængde fosfatbufferet saltvand (PBS) til at vaske overfladen af kulturbeholderen. Hvirvler fartøjet kort for at fjerne fritliggende celler og restvækstmedium. Fjern skylleopløsningen fuldstændigt, før PLB reagens anvendes.
- Der dispenseres 100 μL 1x PLB ind i hver kulturbly for helt at dække cellemonslægget. Lad kulturpladerne stå i 20 min.
- Lysatet overføres til et rør eller hætteglas med behov for yderligere håndtering eller opbevaring.
- Forbered luciferase assay reagens (LAR) ved at opslænkning af den medfølgende frysetørrede luciferase assay substrat i 10 ml af den medfølgende luciferase assay buffer.
- Der skal klargøres et tilstrækkeligt volumen til at udføre det ønskede antal dobbelt luciferase-reporter-analyser (100 μL reagens pr. analyse). Der tilsættes 1 volumen på 50x stopunderlag til 50 volumener stopbuffer i et glas eller silikoneret polypropylenrør.
- Dual-luciferase reporter (DLR) analyse
- Program luminometre for at give en 2-sekunders forlæst forsinkelse, efterfulgt af en 10-sekunders måleperiode.
- Prædispensere 100 μL luciferase assay reagens i et passende antal lysometerrør for at fuldføre det ønskede antal DLR-analyser.
- Overfør forsigtigt op til 20 μL cellelysat i det luminometerrør, der indeholder LAR. blandes ved pipettering 2 eller 3 gange. Sæt røret i luminometeret og initier aflæsningen.
- Tag prøverøret ud af luminometeret, tilsæt 100 μL stopreagese og vortex kortvarigt for at blande. Udskift prøven i luminometeret, og initier aflæsningen.
- Optag renilla luciferase aktivitet normaliseret til firefly luciferase aktivitet, nemlig den gensidige af forholdet vises på skærmen.
- Kassér reaktionsrøret, og fortsæt til næste analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder, der er skitseret i denne protokol er til opførelse af sgRNA og xCas9 udtryksvektorer og derefter til optimering screening af sgRNA oligos med relativt højere gen målretning effektivitet. Her viser vi et repræsentativt eksempel på 3 sgRNA-mål til får 2. kr. SgRNA og xCas9 udtrykke vektorer kan bygges ved at predigesting vektoren rygrad (Figur 2) efterfulgt af ligating det i en række korte dobbelt-streng DNA fragmenter gennem glødende oligo par. De positive kolonier kan detekteres gennem specifikke primer par guidet PCR (Figur 3). Et dna-fragment på 440 bp fra får DKK2 exon 1 blev subcloneret til pSSA-Dual plasmid15 ved hjælp af dobbeltfordrætning med AscI og SalI, hvilket resulterede i pSSA-Dual-DKK2. Genmålretningskapaciteten pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 og pX330-xCas9-T3 blev simutanusly opdaget (Figur 5), og derefter blev den sidste sgRNA-vektor identificeret som den relativt bedre, som vi samler op til fåregenredigeringsforskning ved næste trin.
Denne detektionsmetode kombinerer en enkelt ssa-mekanisme (strandglødning)(figur 1B og figur 4) med et luciferase-rapportgen for at overvåge DNA-skæreeffektiviteten. Som illustreret i figur 4er SSA en proces, der indledes, når der foretages en dobbelt strengpause mellem to gentagne sekvenser, der er orienteret i samme retning. Der skabes enkelte strandområder ved siden af de pauser, der strækker sig til de gentagne sekvenser, så de komplementære tråde kan gløde til hinanden. Denne udglødning mellemliggende kan behandles ved at fordøje væk enkelt strandede haler og udfylde hullerne. Dual-Luciferase Reporter-genet omfatter hovedsageligt luciferase-generne fra ildfluen Photinus pyralis og fra Renilla reniformis (også kendt som havpansy). Aktiviteterne i firefly og renilla luciferaser måles sekventielt fra en enkelt prøve. Når det anerkendelsesområde, der har terminerings codon, ikke skæres i midten, blokeres genet i SSA-systemet og kan ikke oversættes til et funktionelt protein. Når behandlingen finder sted, vil SSA-systemet automatisk fusionere den homologe sekvens, og overlappende sekvenser bliver en enkelt sekvens, genet bliver rekombination repareret og kan derefter aflæses under hele produktionen af et funktionelt protein.
Figur 1: Skematisk repræsentation af de forskellige trin i kloningsprocessen.
a) Skematisk af sgRNA vektor konstruktion, tilpasset fra protokollerne af Feng Zhang Lab.(B)Skematisk af dobbelt luciferase reporter vektor bygning (vælg vektor pSSA-DKK2 som eksempel), DNA fragmenter Rluc-, Rluc-2 og Rluc-3 repræsenterer tre dele af fuld længde kodning sekvens af Renilla luciferase. MCS repræsenterer "multiple kloning site". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fordigesting af vektorens rygrad pX330-xCas9 med BbsI.
1: DNA Markør, 2: pX330-xCas9 plasmid, 3: pX330-xCas9 plasmid fordøjet med BbsI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Specifikke primerpar guidet PCR til DKK2-T1 sgRNA vektordetektion.
Vognbane 1-7 angiver PCR-bånd til 7 forskellige bakteriekolonier separat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Skemaer for enkeltglødning af streng (SSA). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dobbelt luciferase-analyse med reportervektor pSSA-DKK2 i cellelinje PIEC.
Ranilla luciferase luciferase-aktiviteterne er væsentligt induceret (P<0,01, Student's t test) i PIEC ved overudseende pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 eller pX330-xCas9-T3 med folden ændring af 3,15, 5,84 eller 13,10, hhv. Fejllinjerne angiver standardafvigelser (SD)(n=3) for hver gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Genomiske DNA-mål (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TCCTGCTCCTACTGGCCGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGTCCTCTGGGCGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGGGGC | ||||
Tabel 1: sgRNA mål og oligos designet til genredigering af får DKK2.
| PCR-komponent | 25 μL reaktion |
| 10 μM Forward Primer (f.eks. | 1 μL |
| 10 μM Omvendt Primer BbsI-R | 1 μL |
| 10x PCR-buffer | 2,5 μL |
| 2,5 mM dNTPs | 1 μL |
| bakterievæske | 1 μL |
| DNA Taq Polymerase | 2,5 enheder |
| Nuclease-frit vand | Op til 25 μL |
Tabel 2: PCR-blanding til påvisning af positive bakteriekolonier.
| Reagens | Volumen |
| pSSA-Dual vektor (syntetiseret DNA-fragment eller PCR-produkt) | 1-2 μg |
| CutSmart Buffer | 5 μL |
| Asci | 1 μL |
| SalI-HF | 1 μL |
| Destilleret vand | op til 50 μL |
| Samlet volumen | 50 μL |
Tabel 3: Dobbelt fordøjelse af pSSA-Dual vektor og syntetiseret DNA-fragment (eller PCR-produkt).
| Reagens | Volumen |
| pSSA-Dobbelt vektor(predigested) | 0,5 μg |
| DNA-fragmenter, der indeholder sgRNA-målene (predigested) | 0,2 μg |
| T4 DNA Ligase Buffer (10x) | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| Destilleret vand | op til 10 μL |
| Samlet volumen | 10 μL |
Tabel 4: En ligationsreaktion af DNA-fragmenter, der indeholder sgRNA-målene, i en præedigested pSSA-Dual vektor.
| Trin 1: fremstilling af reagenser | |
| Reagens til transfektion | 2 μL |
Tabel 5: Nærmere oplysninger om celletransfektion i en 24 brøndplade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sgRNA vektor kloning procedurer, vi har beskrevet her letter effektiv produktion af sgRNAs, med de fleste af de omkostninger, der stammer fra oligonucleotid bestilling og vektor sekventering. Mens den skitserede metode er designet til at give brugerne mulighed for at generere sgRNA'er til brug med CRISPR/Cas9, kan protokollen nemt tilpasses til brug med Cas9 orthologues eller andre RNA-styrede endonucleaser såsom Cpf1, der indfører mindre ændringer af vektorens rygrad og oligonukleotid overhængende sekvenser.
Den protokol, der er skitseret ovenfor, vil give et foretrukket sgRNA-mål på 10 dage, når du starter med passende designede oligonukleotider. Dette omfatter sgRNA-designet (1 time, trin 1 - 2), fortynding, aliquot og udglødning af oligonukleotider (30 min, trin 3), fordøjelse og rensning af sgRNA-ekspressionsvektoren (3 h, trin 4), kloning af sgRNA oligonukleotiderne i en predigested tom vektor (natten over, trin 5 - 6), PCR-detektion af kolonierne (4-5 h, trin 7) og validering af sekvensen af sgRNA-udtrykket plamids (24 h, trin 7) og validering af sekvensen af sgRNA-udtrykket plamids (24 h , trin 8). I mellemtiden, konstruktion og sekvens validering af dobbelt luciferase reporter vektor tager 5 - 7 d (trin 9). Forberedelsen af cellelinjen, plasmid transfektion og dobbelt luciferase detektion tage omkring 48 h (trin 10 - 11). Fejlprocenten for generering af hver plasmid er næsten 0.
Det mest kritiske trin i protokollen er den restriktive enzymfordøjelse af sgRNA-vektor af enzymer som BbsI. Hvis fordøjelsen ikke er tilstrækkelig, så den positive sats af bakteri kolonier kan være meget lav. Mens PCR-baserede detektion tilgang kunne følsomt overvåge fordøjelsen effektivitet og den positive sats. De forreste primere, der tidligere blev brugt som fremadgående oligos af det indsatte sgRNA-fragment, sikrede en yderst effektiv skelnen mellem rigtige indsættelser og tomme vektorer. En af fordelene ved denne strategi er netop en effektiv påvisning af de positive kolonier ved PCR før DNA-sekvensering. Som nævnt ovenfor er sekvensverifikation stadig relativt dyrere i forhold til PCR, især når der forekommer ufuldstændig fordøjelse af BbsI. Med hensyn til ressourcebesparelse parrede vi forward oligos for sgRNA fragmentglødning (såsom T1-F, T2-F eller T3-F) med den sekventerende primer BbsI-R til PCR-forstærkning. Mere end 500 sgRNA vektorer er blevet bygget med succes i laboratoriet gennem denne strategi for koloni identifikation.
En anden fordel ved protokollen er den effektive forvalg af kandidat sgRNA mål ved hjælp af dobbelt luciferase reporter system. Kæmpe varians af skæreeffektivitet faktisk findes på forskellige sgRNA mål4. At identificere en meget effektiv sgRNA mål ved T7E1 analyse eller Surveyor nuklease assay1 i en vanskelig at transfect cellelinje er tid og arbejdskraft forbrugende. Desuden, for PCR forstærkning i T7E1 assay eller Surveyor nuklease assay, er det undertiden vanskeligt specifikt at forstærke målsekvensen i genomET DNA på grund af manglen på egnede primer par1. I modsætning hertil er den dobbelte luciferase reporter assay uafhængig af genom forstærkning procedurer. Tidligere har vi brugt denne metode til at få meget aktive sgRNAs16,19.
På trods af de klare fordele ved den metode, der er beskrevet i dette arbejde, er der også nogle begrænsninger, der skal påpeges. Selv om det sikrer en høj succesrate, den luciferase-baserede metode til sgRNA udvælgelse foreslået kunne være dyrere end andre tilgange (landmåler / høj opløsning smelte analyse, osv.) på grund af behovet for at syntetisere målsekvensen. Desuden er denne fremgangsmåde ikke hurtigere end nogen af disse alternative metoder på grund af behovet for at klone reporter plasmid, hvis en let at transfect celle linje vil blive gennemført for gen målretning. Det er også nødvendigt at præcisere, at metoden er egnet til at foretage knockouts, men ikke at redigere specifikke nukleotider. Derudover kan kun dobbeltstrengede brud og ikke enkeltstrengede pauser evalueres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong Province (Kina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Den Særlige Fond for Agrovidenskabelig Forskning i offentlighedens interesse (201403071), National risikovurdering stort specialprojekt for kvalitet og sikkerhed i forbindelse med mejeriprodukter (GJFP201800804) og projekter baseret på Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
