Developmental Biology

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59674

Simone Bovio^1,2, Yuchen Long², Françoise Monéger²

¹SFR Biosciences, Université de Lyon, ²Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

Summary

כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.

Abstract

אנו מציגים כאן את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי לכניסה רקמות הצמח ולשחזר את תכונותיו המכאניות. באמצעות שני מיקרוסקופים שונים במצב כניסה, אנו מראים כיצד למדוד מודול אלסטי ולהשתמש בו כדי להעריך תכונות מכניות של קיר התא. בנוסף, אנו גם מסבירים כיצד להעריך לחץ טורגור. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופ הכוח האטומי הם שהוא לא פולשני, מהיר יחסית (5 ~ 20 דקות), וכי כמעט כל סוג של רקמת צמחים חיים שטוח באופן שטחי ניתן לנתח ללא צורך בטיפול. הרזולוציה יכולה להיות טובה מאוד, בהתאם לגודל הקצה ולמספר המידות לכל אזור יחידה. מגבלה אחת של שיטה זו היא שהיא מעניקה רק גישה ישירה לשכבת התא השטחית.

Introduction

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שייך מיקרוסקופ בדיקה סריקה (SPM) משפחה, שם טיפ עם רדיוס של בדרך כלל ננומטרים כמה סורקת את פני השטח של מדגם. גילוי משטח אינו מושג בשיטות אופטיות או באמצעות אלקטרון, אלא דרך כוחות האינטראקציה בין הקצה לבין משטח המדגם. לפיכך, טכניקה זו אינה מוגבלת לאפיון טופוגרפי של משטח לדוגמה (רזולוציה תלת-ממדית שיכולה לרדת לכמה ננומטר), אלא גם מאפשרת את המדידה של כל סוג של כוחות אינטרקציה כגון אלקטרוסטטית, ואן דר וואלס או כוחות מגע. יתר על כן, ניתן להשתמש בעצה כדי להחיל כוחות על פני השטח של דגימה ביולוגית ולמדוד את דפורמציה כתוצאה מכך, את מה שמכונה "כניסות", כדי לקבוע את תכונותיו המכאניות (למשל, מודולוס של יאנג, מאפיינים אלסטיים).

תכונות מכניות של קירות תא הצמח חיוניים להילקח בחשבון כאשר מנסים להבין מנגנונים בבסיס תהליכים התפתחותיים¹^,²^,³. ואכן, מאפיינים אלה נשלטים באופן הדוק במהלך הפיתוח, במיוחד מאחר שריכוך הקירות התאי נדרש כדי לאפשר לתאים לצמוח. AFM יכול לשמש כדי למדוד מאפיינים אלה וללמוד את האופן שבו הם משתנים בין איברים, רקמות או שלבים התפתחותיים.

במאמר זה, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים AFM למדוד את שני הקירות התא תכונות מכניות ולחץ טורגור. שני יישומים אלה מומחש בשני מיקרוסקופים AFM שונים ומפורטים כאן לאחר מכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מידה של מאפיינים מכניים של קיר התא

הערה: מוצג דוגמה של החלה התפתחות החלה ההתפתחות הבין-מידלית של Arabidopsis .

הכנת דגימות ביולוגיות
1. לאסוף ניצן פרח סגור בשלב 9 עד 10 (כ 0.5 מ"מ זמן) לפי קביעת שלבים שפורסמו עבור Arabidopsis⁴. תחת המשקפת, באמצעות פינצטה עדין, בזהירות לפתוח את ניצן כדי לבדוק את השלב של הפיתוח ולאסוף את השיטה הממוקמת במרכז הפרח.
2. שימו את השחלה על קלטת צדדית כפולה הממוקמת במרכז העטיפה של צלחת פטרי קטנה (קוטר של 5 ס מ).
  הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בדבק תואם ביולוגי גם לצורך השתק יעיל יותר של המדגם בעת הכניסה.
3. להוסיף במהירות מים עד המדגם מכוסה לחלוטין. זה מונע התייבשות ומפחית את הדבקה של הקצה למדגם. לחילופין, יש לטבול את המדגם במדיום הנוזלי, כגון תרבות הפיסגה האראידופזיס בינונית⁵.
כיול AFM
1. הגדר את האביב הרציף k מספיק גבוה כדי לאפשר דפורמציה של משטח המדגם עד הכניסה הרצויה, אבל לא גבוה מדי כדי למנוע אובדן רגישות.
  הערה: ככלל מחוספס של אגודל, אם מודול המדגם של יאנג מוכר, סדר הגודל של קבוע האביב יכול להיבחר כ- k≈E * δ, כאשר δ הוא הכניסה הרצויה.
2. השתמש R = 400 nm-הסתיים כדורי קצה עם 15 יקרומטר קצה-זיז מרחק.
  הערה: רדיוס התשר קשור ישירות לרזולוציה הצדדית. בדרך כלל, לכניסה על חומרים ביולוגיים, לבחור עצות מעוגלות (R גדול מ 10-20 ננומטר) או בדיקה קולאידית. בדיקה קולאידית קטנה עשויה להיות מסובכת לשימוש בשל המרחק הקטן בין קצה הקצה והזיז שיכול לגעת במשטח המדגם.
3. להפעיל את התוכנה ולמקם את הראש אופקית לפחות 2-3 h לפני הניסוי: זה יאפשר את הראש כדי thermalize להימנע המושרה לייזר תנועה יחסית מהלכים. אם המיקרוסקופ מצויד מודול cellhesion (הארכת טווח הזמינות של Z ל100 יקרומטר במקום 15 יקרומטר), החלף את הבקר שלה תחילה ולאחר מכן בחר במצב cellhesion בעת הפעלת התוכנה.
4. הר את הזיז על בלוק הזכוכית הר את הבלוק על הראש. מניחים droplet של כמה מיקרוליטרים של מים באולטרסאונד על הקצה כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר כאשר הקצה טבול לתוך המים.
5. מניחים דגימה קשה (ניקוי שקופית זכוכית או ספיר) ולהוסיף 30-50 μL של מים באולטרטהורים.
  הערה: נוהל הכיול המתואר כאן הוא כיול הקשר שנקרא לעתים. ראשית, עקומת כוח מורכב על משטח נוקשה ושטוח ואז הספקטרום תנודות של הזיז הנרגש תרמית מתועד על מנת לחשב את קבוע האביב. פרוטוקולי כיול אחרים קיימים והוא יתואר בקצרה בפסקת הדיון.
6. מניחים את הראש על הבמה (היזהרו להרים את מנועי Z גבוה מספיק). השתמש בתמונה האופטית כדי בערך למקם את הלייזר על הזיז.
  1. הזיזו את הלייזר לאורך הציר הראשי של הזיז ועקבו אחר האות בפוטודיודה.
    הערה: כאשר משמשים התלויה סטנדרטיים, סכום גדול מ 0.5 V יש לקבל.
  2. להעביר את הלייזר לכיוון השני ולמקסם את האות סכום כדי למקם את הלייזר באמצע הזיז. זה יהיה למזער את הדיבור בין הטיה לרוחב ואנכי.
7. מדידה של רגישות הטיה
  הערה: הפוטודיודה קוראת הזחה בלייזר ומספקת אות בולטים. כדי להיות מסוגל למדוד הטיה ביחידה מטרית, יש למדוד רגישות הטיה.
  1. הגדר את המכשיר במגע → כוח ספקטרוסקופיית. הגדרת setpoint יחסית ל-2 V, אורך Z עד 0.5 Μm, והרחבת מהירות ל-2 μm/s (קצב דגימה ל-10000 Hz) ובחר בלולאה מסוג Z סגור.
  2. פתח את מנהל הכיול ובחר את חלק איש הקשר של עקומת הכוח (שאמור להיות ליניארי) כדי לבצע התאמה ליניארית: ההופכי של השיפוע מעניק את רגישות הסטיה. קריאת הפוטודיודה מכוילים כעת ביחידה מטרית.
8. קביעת קבוע האביב. במנהל הכיול, בחר קבוע אביב כדי להריץ רכישת ספקטרום תרמי. כדי לממוצע את האות לזמן ארוך יותר, בחר בסימן ∞. ספקטרום הכוח של הזיז הנרגש עשוי להראות מספר פסגות; צייר בחירה סביב האחד שמוקם בתדר הנמוך ביותר כדי להתאימה.
  הערה: אם המנגינה התרמית מבוצעת בנוזל, פסגת התהודה תהיה רחבה יותר והתדר שלה הופחת לעומת הנומינלי.
כפיית הערכה של ניסוי ספקטרוסקופיית ורכישה
1. מניחים את המדגם על הבמה AFM ומניחים את הראש על המדגם.
  הערה: ודא שהראש הגיע מספיק כדי למנוע מגע קשה בין הקצה לבין משטח הדגימה.
2. . תן לזיז לעבור כמה דקות
3. במצב QI , גישה עם כוח setpoint של 50 nN.
4. הגדר אורך Z של 4 יקרומטר ואזור סריקה כדי 80 x 80 יקרומטר² עם מספר פיקסלים של 40 x 40. בחלונית ' הגדרות דימות מתקדמות ', הגדר את המצב למהירות קבועה. הגדרת מהירות הרחבה והסגת ל-200 μm/s והתעריפים לדוגמה ל-25 kHz.
5. התחל לסרוק והשתמש בסריקת כוח נמוכה מהירה זו לבדיקה אם המדגם זז. ודא שהאזור שנסרק נקי מפסולת או מתאים שעברו הקצאה ומאתר אזור מעניין ככל האפשר כדי לבצע את המידות.
  הערה: כדי להעריך את ההטיה לדוגמה האמיתית, יש להגדיר את השורה לפני כיבוי או לקבוע. זווית הטיה מוגזמת בין ציר הכניסות לבין המשטח תהיה השפעה על מודול⁵של יאנג הנמדד.
6. לאחר אזור של עניין כבר ממוקם, בחר אזור של 40 x 40 כדי 60 x 60 יקרומטר² סביבו ולהגדיל את מספר הפיקסל כדי להגיע 2 פיקסלים/יקרומטר. הגדל את setpoint כדי 500 nm כדי לקבל הכניסה 100-200 nm. התאם ערך זה, במקרה הצורך, בתחילת הניסוי. הפחת את אורך Z ל-2 μm. הקטנת הרחבה והסגת מהירות ל-100 μm/s והגדילו את קצב המדגם ל 50 kHz.
7. התחל לסרוק ולשמור את הפלט (המורכב בדרך כלל על-ידי תמונה וקובץ נתונים).
8. בסוף יום המדידה, להסיר את מחזיק התשר ולשטוף אותו בעדינות עם מים באולטרטהור ו 70% אטוח.
9. . יבש והוצא את הזיז לקבלת ניסויים נוספים עם אותו הטיפ, לשקול לנקות אותו עם פרוטוקול ניקוי רטוב, אם אפשרי, טיפול פלזמה O₂ מעקב. אל תתנו מים להתייבש על הזיז ו/או מחזיק התשר כדי למנוע התגבשות מלח.
ניתוח נתונים (עבור גירסת תוכנה לעיבוד נתונים של 6. x)
1. פתח את תוכנת עיבוד נתונים וטען את קובץ הנתונים.
2. לחץ על השתמש במפה זו עבור לחצן עיבוד אצווה כדי להשתמש באותם פרמטרים ניתוח על כל עקומות של המפה.
3. בטעינה של תהליך מוגדר מראש, בחר התאמה להרץ.
4. השתמש בכרטיסיה הראשונה כדי לאמת או לשנות את פרמטרי הכיול.
5. בכרטיסיה השניה, הסר היסט (או היסט בתוספת הטיה) מקו הבסיס כדי להגדיר את הערך הממוצע שלה כ-0.
6. בכרטיסיה השלישית, העריכו את מיקום נקודת המגע (POC) בהתחשב בכך כנקודה הראשונה החוצה את הכוח 0 כאשר יורדים מערך ה-setpoint לאורך עקומת ההרחבה.
7. מיקום הקצה האנכי של הכרטיסיה מחשב תנועת עצה על-ידי הפחתת הסטיה של הזיז מגובה נמדד. בשלב זה, השתמש בגובה לא מוחלקים (נתונים גולמיים) עבור ההתאמה הבאה, על-ידי בדיקת תיבת הסימון המתאימה.
8. בכרטיסיה התאמה לאלסטיות , בחר את מודל ההתאמה המתאים. אם הדבקה לא מוגדרת או חלשה מוצגת בעת הסגת עקומות (המתאימות לפחות מ-10% מכוח ה-setpoint או לכוח הממוצע המירבי בעומק הכניסות שנבחר), יש להגדיר את סוג הדגם כ-הרץ/סנון ולהרחיב את העקומה. במקרה של הדבקה חזקה יותר, DMT מודל, אשר מייצג את המודל Derjaguin-מולר-Toporov, צריך להיות מועדף ומתאים צריך להתבצע על החזר עקומות (עיין במדריך לפרטים על מודלים ליצירת קשר זמין ו הקשורים).
  1. הגדר פרמטרים גיאומטריים של עצה בהתבסס על צורת עצה נומינלית. כאן, עצה צורה היא הספרה והטיפ רדיוס הוא 400 ננומטר.
  2. הגדר את יחס הפואסון ל-0.5 מכיוון שהוא מקובל עבור חומר ביולוגי (המתאים לחומר לא מתאים).
9. יתאים להזחה מסוימת. כברירת מחדל, ההתאמה מבוצעת על פני העקומה כולה. אם יש לבצע את ההתאמה עד לכניסה מסוימת, בדוק תחילה את תיבת הסימון הסטת עיקול ; פעולה זו תגרום לשינוי מקור העקומה בהתבסס על ערכי בסיס חדשים שנקבעו וPOC.
  1. הוסף שגרת אלסטיות שניה על-ידי לחיצה על הסמל בחלון הראשי.
  2. הגדר שוב את כל הפרמטרים המתאימים וציין ב- X דקות את הכניסה הרצויה. הוסף שלבים רבים ככל הנדרש (2 עד 3 שלבים צריכים להספיק) כדי למקד את קביעת המיקום POC ולאחר מכן את עומק הכניסות המחושב. התהליך ניתן לשמירה בשלב זה.
10. לחץ על לשמור ולהחיל על כל כדי לחזר את השלבים הקודמים על כל עקומות של המפה.
11. . שמור את התוצאות תמונה וקבצי. tsv יקבלו.

2. מידה של לחץ טורגור

הערה: מוצג כאן דוגמה של מריאת התפרחת הבין-אוריזלאני של Arabidopsis.

הכנת דגימה ביולוגית
1. לאסוף את מריטותזיס תפרחת האיחוד (IM) מטופלים עם המיקרו-כדורית התרופה oryzalin מצמח מתורבת גדל על בינוני המכיל את כלי העזר הקוטבי מעכבי התחבורה 1-N-נפתלי לפתלמי (NPA) בעקבות שיטה שפורסמה . שישה מטרים
2. דגימת IM הרכבה לאחר אחת משתי האפשרויות
  1. לניטור לטווח ארוך: יש לטעון את המדגם בצלחת פטרי המכילה את מדיום תרבות הפיסגה של arabidopsis (ACM)⁷^,⁸ ו-0.1% שימור הצמח בתערובת (PPM), כדי למנוע זיהום. השהה את קצה הודעות הim מעל פני השטח של ACM ותמוך בבסיס IM עם טיפה של 2% הצמח.
  2. למדידה עם שינויי פתרון מהירים: טעינת המדגם בצלוחית פטרי האוחזת בחתיכה קטנה של דבק מסטיק, ובמהירות חותם את הפער בין המסטיק לבין הבסיס לדוגמה עם דבק תואם ביו. המתן להדבקה לחזק (פחות מ -2 דקות) ולאחר מכן הפחת את המדגם ב-ACM נוזלי המכיל 0.1% PPM.
    הערה: ודא שמשטח הדגימה אינו מצופה בצמח או דבק בעת תיקון הבסיס לדוגמה. מדידת AFM של לחץ טורגור דורש את המדגם להיות רכוב באופן סביר, ואת שיטות ההרכבה הקודמת לספק יציבות סבירה. בהתאם לדוגמה, ניתן להשתמש בשיטות הרכבה אחרות, כגון קלטת דו-צדדית, פולי ליזין וכדומה.
כיול AFM
1. הפעל את תוכנת הרכישה של AFM ובחר במצב המדידה של Peakforce QNM (משרעת גדולה) .
2. בצע כיול בעקבות אותו עיקרון שמתואר בשלבים 2.1 עד 2.6.
3. בחלון הפרמטרים של הבדיקה, הגדר את גודל הסריקה כ-0. בחלון השיפוע , הגדר את גודל השיפוע בין 200 ננומטר לבין 500 Nm, מפתן טריגונומטריה בין 2 v ל-5 ומספר דוגמאות ל2048 ומעלה.
4. יישר את קצה הזיז עם דגימת הכיול ולחץ על הלחצן ' גישה'.
5. בעת יצירת קשר, עבור אל חלון השיפוע ולחץ על השיפוע הרציף של הלחצן. על המשטר הליניארי של העקומה, קבע את השיפוע על-ידי לחיצה על לחצן עדכן רגישות . חזור על המדידה של רגישות הטיה מספר פעמים ועדכן ידנית את הכיול באמצעות ממוצע המדידה על -ידי פתיחת גלאי הטאבים מכיול התפריט.
6. משכי את ראש ה-AFM ומסירים את דגימת הכיול.
  הערה: הוא הציע לבטל לחלוטין את הראש AFM על ידי בחירת הכרטיסיה שלב ← לאתחל כדי למנוע מגע קשה בשוגג על שינוי לדוגמה.
כפיית הערכה של ניסוי ספקטרוסקופיית ורכישה
1. אם המדגם אינו שקוע עדיין, יש להטביע אותו עם ACM נוזלי המכיל PPM.
2. בתוכנת הרכישה, ציין את פרמטרי המדידה באופן הבא:
  1. בחלון הפרמטר Check , קבע קבוע האביב לקבוע האביב מיוצר של הזיז או לקבוע האביב הנחוש כמו בשלב 2.8. בדוגמה זו, היא מוגדרת ב 42 N/m.
  2. הגדר את רדיוס קצה ל400 ננומטר בדוגמה זו.
  3. הגדר לדוגמה את יחס הפואסון ל-0.5, שכן המים תורמים בעיקר ללחץ הטורגור.
  4. הגדר דוגמה/קו ל-128 כדי להבטיח רכישה מהירה.
  5. הגדר את קצב הסריקה ל-0.2 Hz.
  6. הגדר גודל סריקה ל-1 μm.
    הערה: הגדרת קצב סריקה וגודל סריקה קטנים עשויים למנוע נזק לדוגמה של AFM המופעל באמצעות סריקה. מומלץ לצמצם שני פרמטרים אלה על כל שינוי לדוגמה.
  7. בחלון השיפוע, קבע את גודל השיפוע ל-5 μm.
    הערה: עדיף להגדיר גודל השיפוע גדול יותר מאשר עומק כניסה עבור רכישה בסיסית טובה יותר.
  8. הגדר סף טריגונומטריה למקסימום.
  9. הגדר את מספר הדגימות ל-4608.
  10. באופן אופציונלי, במיקרוסקופ ← כרטיסיית פרמטרים להתקשרות , הפחת את הפרמטרים הבאים כדי למנוע נזק חזק למדגם. הגדר שיא כוח הפעל Setpoint כדי 0.3 v (ברירת המחדל 0.5 v). הגדר הפעל int. להרוויח כדי 0.5 (ברירת המחדל 0.75). הגדרת spm לעסוק בצעד 4 יקרומטר (ברירת מחדל 15 יקרומטר).
3. הציבו ויישרו את המדגם מתחת לראש AFM, והתקרבו עד שהזיז מתחת לפני המים, אך לא במגע עם משטח המדגם.
  הערה: תוך כדי התקרבות, נשוף קלות על פני השטח של ACM נוזלי עד שנוצר גשר נוזלי בין הזיז לבין המשטח הנוזלי. זה בדרך כלל מונע מגע קשה.
4. בזהירות, גישה ידנית לכיוון המדגם. כאשר החללית הוא קרוב יחסית למשטח דגימה, לחץ על הגישה.
5. בעת יצירת קשר, הגדל בהדרגה את גודל הסריקה ו/או הסריקה rate עד לאיזון רצוי מבלי לפגוע במדגם ו/או בזיז.
  הערה: גודל הסריקה מוגבל על-ידי עקמומיות המשטח והחספוס של המדגם. במקרה של oryzalin מטופלים IM, 50 x 50 יקרומטר² אזור הסריקה ניתן להשיג עם קצב הסריקה של 0.3 Hz.
6. במהלך הסריקה, קבע אם אזור המדידה רצוי. מקם מיקום במידת הצורך. כאשר מרוצה, לחץ על נקודת לחצן ולירות כדי ליזום את הצבע ולירות חלון.
7. לפני הקלטת הסריקה, בחר ערוץ תמונה מתאים שעשוי להקל על זיהוי ברור של מתארי תאים. לעתים קרובות, שגיאת כוח שיא, DMT מודולוס, LogDMT מודולוס או הפיזור מתאים. ציין שם קובץ וספריית שמירה. לאחר מכן לחץ על השיפוע בסריקה הבאה כדי ליזום הקלטה.
  הערה: שורה של נקודה ושלושה מספרים יתווספו באופן אוטומטי לאחר שם הקובץ המיועד (כמו. 000). מספר זה מגדיל באופן אוטומטי ב-1 על כל החזרות של סריקה שנשמרה.
8. כאשר הסריקה תושלם, ממשק התוכנה תנותב מחדש באופן אוטומטי אל חלון השיפוע. לחצו על התמונה הסרוקה כדי לציין את המיקומים לכניסה.
  הערה: לפני הקלטת כניסות, עדיף לבחור מספר ציוני דרך כדי לבצע כניסות בדיקה על ידי לחיצה על השיפוע בלבד, במקרה שינוי פרמטרים נדרש (עבור גודל הרמפה, מיקום piezo, וכו '). עומק הכניסה צריך להיות גדול יותר מעובי דופן התא (נקבע באופן אידיאלי בנפרד על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ).
9. בחר לפחות שלושה אתרי כניסה לכל תא בסמוך למרכז הרישוריאלי, וחזור על כניסה שלוש פעמים באתר. זה יכול להניב לפחות תשעה כוחות כוח לכל תא לניתוח נוסף. כאשר הוא מרוצה ממיקום הכניסה לאתר, לחץ על כבש ולכוד. עקומות כניסות הכוח נשמרות באופן אוטומטי בספריה המיועדת.
10. כאשר הרמפות מושלמות, מקמו מחדש למיקום אחר למדידת מידות, או משכי את הסריקה ראש ושינוי דגימה.
11. כשתסיים, נקה את הזיז כמו בשלבים 1.3.8 ו-1.3.9.
ניתוח מידע
1. בתוכנת הניתוח, פתח את הקובץ *. mca. פעולה זו מציגה את המיקום של כל עקומת כוח בתמונה הסרוקה. במקרה הצורך, בחרו מראש את עקומות הכוח לצורך ניתוח.
2. פתח עקומת כוח אחת כדי להיות מנותח, בדרך כלל בתבנית של x0000y. 00z, כאשר x הוא שם הקובץ שצוין בספריה save בזמן ש-y ו-z הם מספרים רשומים אוטומטית המציין רצף כניסות ומספר סריקה.
3. לחץ על לחצן תיקון בסיסי וגרור את שורות המקף הכחול בעקומת הכוח עד להרחבת ההפעלה הבסיסית של המקור והרחב את הפסקת הבסיס של המקור הם ב-0% ו-80%, בהתאמה. לחץ על ביצוע.
  הערה: לחלופין, ניתן להרחיב את האפשרות ' עצירת בסיס מקור ' בערכים שונים, כל עוד היא עדיין בתוך התוכנית הבסיסית ולא מעבר לנקודת המגע.
4. לחץ על הלחצן מסנן בקרון ולחץ על ביצוע כדי להחליק את עקומת הכוח.
5. לחץ על לחצן ההזחה.
  1. בחלון הקלט , הגדר את העקומה הפעילה להרחבה.
  2. הגדר את שיטת ההתאמה כדי להתאים את המודל וכלול את כוח הדבקה ככן.
  3. הגדר את גבול התאמת הכוח המירבי ל-99% ולגבול התאמה של כוח מזערי ל-75%.
  4. הגדר מודל התאמה נוקשות (ליניארי).
    הערה: הכיוונון הזה יהיה לחשב את הנוקשות לכאורה לניכוי לחץ טורגור. בדוגמה זו, גבולות ההתאמה משקפים התאמה קשיות של סביב 1.5 יקרומטר כניסות עומק.
6. כוח עקומות ניתן לנתח באצווה. לחץ על לחצן ' העבר היסטוריה ', ציין את ספריית הדוחות והוסף את כל עקומות הכוח האחרות הדורשות טיפול זהה. כאשר הוא מרוצה, לחץ על הפעל. כברירת מחדל, ההתאמה תאוחסן כקובץ *. txt.
7. כאשר k הוא אצווה מצויד, לחץ על היסטוריה → 5 כניסות כדי לחזור לחלון הכניסה.
  1. שינוי גבול ' התאם כוח מירבי ' ל-10% ו- Min Force התאם גבול ל-0%.
  2. הגדר מודל התאמה להרפה ( כדורי ).
    הערה: זה יהיה לחשב את קיר התא מודול הצעיר של הילד לניכוי לחץ טורגור. בדוגמה זו, הגבולות המתאימים משקפים התאמה הרציבית (באמצעות בדיקה כדורית) של סביב 0.4 יקרומטר כניסות עומק.
8. חזור על שלב 2.4.6 עבור התאמה לאצווה E.
9. פתח את הקובץ *. 00z (z הוא מספר הסריקה הרשום באופן אוטומטי) כדי להציג את ערוצי הסריקה השונים. בחלון ערוץ גובה , לחץ על לחצן מקטע. זה יאפשר את המדידה של עקמומיות פני השטח של המדגם הנדרש עבור הפחתה בלחץ טורגור.
  1. ציירו קו לאורך הציר הארוך של תא אחד, הזיזו את גבולות קו המקף לקצות התאים והקליטו את ערך ה- r₁של הרדיוס . חזור על הפעולה עבור הציר הקצר כדי לאחזר את הרדיוס r₂. חישוב פני השטח של תא ממוצע עקמומיות κ_M ו-גאוס עקמומיות κ_G באמצעות שתי מדידה רדיוס פנייה של כדלקמן:
    ו
10. להסיק לחצים לחץ P באמצעות מודל דק מעטפת שפורסם⁹ כדלקמן:
  
  עם
  
  כאשר t הוא עובי קיר התא נקבע על ידי למשל אלקטרון מיקרוסקופ.
  הערה: הפחתה של לחץ טורגור הוא תהליך הולם, שבו האיטראציות נדרשים. ארבע איטראציות הם בדרך כלל מסוגלים לשכפל מוצר יציב, עם זאת איטראציות יותר ניתן לעשות (למשל 100 פעמים).
11. חישוב ממוצע E, k ו- P לכל תא. כמו כן, לרשום את ההבדלים תאיים (למשל, סטיית תקן) עבור תיעוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1A ואיור 1a מציגים מסך צילום הממחיש את תוצאת השלבים ה1.3.4 ל1.3.6 של הפרוטוקול, המשמש לאיתור אזור מעניין היכן לרכוש את מפת ה-QI. ראוי לציין שאזור העניין נבחר כדי לא להיות על משטח מוטה (כלומר שטוח ככל האפשר). למעשה, כפי שהבחינו על ידי Routier ואח '⁵, אם ציר הכניסות אינו ניצב על פני השטח, מודול הצעירים נמדד להמעיט. אפקט זה גלוי בפינה הימנית העליונה של לוחות C או D של איור 1, כאשר חלק מהגבול של התאים נראה רך יותר משאר התא. הפריטים המושרה על ידי אפקט זה יהיה הרבה יותר חזק במקרה של meristems, שם זווית הטיה המקומי יכול בקלות להתגבר על 40 ° מעל 50 x 50 יקרומטר² לסרוק אזורים. במעבדה שלנו, אנחנו כרגע מפתחים אלגוריתם, בהתבסס על הגישה שתוארה Routier ואח '⁵, כדי לתקן את הפריטים האלה (נייר בהכנה). איור 1C ואיור 1c הצג את מפות המודולטיות של יאנג שהתקבלו לאחר הניתוח המפורט בפיסקה הרביעית של הפרוטוקול. בפרט, פאנל C מייצג את המודוללי של צעירים שהתקבלו לנתח את הכניסה כולה, עד הגדרת המשתמש המוגדר כוח setpoint, בעוד פאנל D מראה את התוצאה של ניתוח של 100 ננומטר הראשון של הכניסה (כמתואר בשלב 1.4.9). כאן, 2 מפות נראה דומה מאוד, כי במהלך הגדרת הניסוי, הגדר נבחרה על מנת לקבל כניסות ממוצעות סביב 100 ננומטר. הווריאציה של הכניסות שנותחו עלולה לגרום לעיתים להדגיש טוב יותר את הטרוגנויות לדוגמה, שיכולות להועיל לזיהוי המיקום או למתן מידע על אופן ההתנהגות של מבניםפנימיים (למשל, קוסטה ואח ').

עקומת הכוח באיור 2 מראה שני אפקטים שכדאי להזכיר. קודם כל, זה יכול להיות שם לב כי אם הגישה החלק של עקומת הכוח למעשה מסתיים בכוח setpoint של 500 nN, התנועה קצה כלפי מטה ממשיך ללכת, כלומר את הכוח האחרון שהוחל על ידי הקצה גבוה מהצפוי (כאן 1,000 nN). זאת בשל העובדה כי לולאת המשוב ניטור הסטה הזיז אינו פועל במצב מיידי, כך זמן התגובה הסופי שלה מציג השהיה בין זיהוי סף הסטה ועצירת התנועה piezo. יתר על כן, במיוחד כאשר השימוש CellHesion אשר מזיז את מחזיק המדגם, האינרציה של חלקים נעים נכנס לשחק, מה שהופך את הזמן הזה השהיה יותר. בעיה זו יכולה להיות מוגבלת באמצעות piezo הראש, במקרה כזה המשתמש חייב להיות זהיר באמת במקרה של מדידות על דגימות מחוספס או מוטה מאוד, או על ידי הפחתת מהירות השיפוע, אשר בכל מקרה מגביל את הרזולוציה ו/או מספר הדגימות שנסרקו ( יתרה מזאת על מפות איטיות מדי, מדגם הגידול יכול להפוך לבעיה. באופן כללי, אם עקומות הכוח מספיקות מספיק אחד מהשני (בהתאם לדגם הכניסה של הבחירה, ניתן לחשב את הרדיוס של האזור המוסט בהתאם לעומק הכניסה ולהשתמש בו כמרחק הפרדה מינימלי), המידות שבוצעו באופן שונה המיקומים לאורך המדגם לא צריך להיות מתואם, אם הניתוח מבוצע על עקומת הגישה, התגברות על הסף כוח לא צריך להיות בעיה. בכל מקרה, אם המדגם הוא עדין או אם הסריקות חוזרות נעשים על אותו אזור, המדען אולי רוצה לנסות למזער את זה לירות מוגזם. למרבה הצער, אין כלל אצבע כדי לקבוע את כמות מוגזם זה, שכן הוא תלוי piezo בשימוש, על מהירויות השיפוע, אבל גם על תכונות החומר: את החומר, את מהיר יותר את הווריאציה של אות הטיה בזמן ו , בהינתן זמן תגובה סופי משוב, גבוה יותר את העומס.

הדבר השני שיש לשים לב הוא מנופף על עקומת לסגת מודגש על ידי האליפסה. נפנוף כזה יכול להיות אינדיקטור לדוגמה הנעה/רטט תחת פעולת העצה. במקרה זה, המשתמש יכול לנסות לשנות את האזור הסרוק (לפעמים חלק אחר של המיקרוסקופ אבל העצה יכולה לגעת במדגם, או המדגם יכול להיות מספיק טוב לתמיכה שלה) או המדגם אם כמה מהם הוכנו על אותה תמיכה. אם התכונה תמיד נמצאת שם, עדיף לשנות את שיטת הקיבוע, במקרה זה מעבר מקיבעון הקלטת הדו לדבק תואם ביולוגי.

איור 3 מתאר את הקביעה של פרמטרים מרכזיים לניכוי לחץ טורגור. כל פרמטר, למעט קיר תא עובי¹¹ אשר נקבע בנפרד על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים להיות ~ 740 ננומטר, ניתן לאחזר מ-afm סריקות וכניסות. בעקבות תהליך המדידה בשלב 2.4.10, הלחץ טורגור הוא הסיק להיות 1.50 MPa עבור עקומת כוח זה. איגוד כל שמונה עשר עקומות כוח בתא זה מניב ערכים ממוצעים של E = 6.77 ± 1.02 MPa, k = 14.18 ± 2.45 N/m ו- P = 1.45 ± 0.29 MPa (ממוצע ± סטיית התקן).

איור 1 : מפות טופוגרפיית (גובה נמדד) הנרכשים בדרך כלל במהלך ניסוי. (א) מוקלט ברזולוציה נמוכה ראשונה/מיפוי כוח נמוך כדי למצוא אזור מתאים לסריקה. (ב) ברזולוציה גבוהה יותר/מפת כוח גבוהה יותר מתקבל לחישוב המודולולוס של יאנג (על האזור המסומן על ידי הריבוע המנוקד השחור). (ג) מודולוס מפות של יאנג מחושב מ-B, כפי שמפורט בשלב 1.4. כאן, המפה של מודולוס הצעיר הושג לנתח את כל הכניסות על כל עקומת כוח. (ד) המפה של צעירים מודולוס השיגה ניתוח רק את 100 ננומטר הראשון של כניסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 : דוגמה של עקומת כוח. , בכחול הגישה. באדום קטע הסגת הדרך כוח מקסימום (ממוקם על עקומת החזרה) שונה מתוך הכוח setpoint בשל זמן התגובה הסופי לולאה משוב ובגלל האינרציה. מנופפים עקומת לסגת יכול להיות נציג של מחסור בקיבעון לדוגמה לתמיכה שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 : מדידות Afm לניכוי לחץ טורגור. (א) dmt מפת מודולוס מראה מתאר התא ברור כדי לפקח על המיקום של אתרים כניסות עמוקות ליד מרכז ברישאני. אתרי כניסה מסומנים באמצעות צלבים. (ב) כוח עקום של כניסה עמוקה בתנוחת הצלב האדום ב- A. תא התא מודול הצעיר של הקיר (ירוק) ולדוגמה נוקשות לכאורה k (אדום) מצוידים משטרים שונים של העקומה כמפורט בשלב 2.4. ר ² מציין מקדם של קביעת התאים. (ג) מיפוי גובה כאשר נקבע ידנית צירים ארוכים וקצרים של a, מתואר על ידי קווים לבנים, של אותו תא שנותח בחלוניות a ו-B (ד) גובה פרופיל של הצירים ארוך וקצר של התא בלוח C (כחול, ציר ארוך אדום, ציר קצר) ו-fitte d רדיוi של עקמומיות (r₁ ו- r₂). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הופעתה של צורות בצמחים נקבעת בעיקר על ידי הקצב המתואם וכיוון הצמיחה בזמן ובמרחב. תאי הצמחים מארוזים בקיר תא קשיח העשוי ממטריצה פוליסכדידיום, אשר מדביק אותם יחד. כתוצאה מכך, הרחבת התא נשלטת על ידי שיווי משקל בין לחץ טורגור מושך את קיר התא, ואת הנוקשות של קיר התא התנגדות ללחץ זה. כדי להבין את המנגנון הבסיסי הפיתוח, חשוב להיות מסוגל למדוד את שני הקירות התא תכונות מכניות, כמו גם לחץ טורגור ברקמות שונות או תאים של איבר נתון. כפי שמתואר במאמר זה, AFM הוא שיטת הבחירה בהקשר זה.

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. הראשון הוא הכנת רקמות אשר צריך להיות מהיר מספיק כדי למנוע התייבשות. זה יכול להיות קריטי במיוחד אם אנחנו רוצים למדוד לחץ טורגור. חשוב מאוד הוא גם קיבעון נכון של המדגם המצע שלה: מדגם לא יציב יכול להוביל אפקטים ברורים מאוד כמו תנועה מאקרוסקופי שניתן לזהות בקלות optically או עיוות חזק של עקומות כוח. בכל אופן, רטט לדוגמה או כיפוף יכול להיות עדין לזהות, החדרת פריטים לתוך התוצאות. לבסוף, צעד קריטי נוסף נוגע לבחירת פרמטרי ההזחה. זוהי הדטרמיננטה עבור איכות התוצאות.

בעת מדידת מאפיינים מכניים על אזורים גדולים (מעל 40-50 יקרומטר לסרוק גדלים), הבדלים בגובה יכול להיות גבוה, מה שהופך את זה קשה כדי לעקוב כראוי את פני השטח ומימוש עקומות כוח מבלי להגיע למגבלות של טווח ה-Z piezo. על מנת להתגבר על בעיה זו, נעשה שימוש במודול CellHesion. מודול זה מוסיף מדגם z piezo נוסף, הממוקם לשלב המדגם, בעל טווח 100 יקרומטר, אשר מאפשר רכישה של אזורים גדולים מבלי להגיע למגבלות מסוכן Z piezo.

המגבלה הראשונה של השיטה היא שאנחנו יכולים רק למדוד שכבות של תאים שטחיים. עם זאת, מחברים לאחרונה השתמשו afm על סעיפים רקמה¹²^,¹³^,¹⁴. למרות שיש לעשות זאת על חומר קבוע, הוא יכול לתת גישה לתכונות מכניות של שכבות התא עמוק. לחילופין, כניסות עמוקות בוצעו גם כדי להסיק תכונות מכניות של רקמות פנימיות על דגימות חיים, אם כי עם הקרבה גדולה יותר על פתרון מרחבי¹⁵. מגבלה שנייה יכולה להיות מקושרת לגיאומטריה לדוגמה, כמשטח עם מדרון תלול יכול להיות בעייתי כיוון שהקצה אינו ניצב בפני המדגם. עלינו להגביל את טווח הזוויות שבתוכו מאמינים ואנו מפתחים כעת אלגוריתם כדי לתקן את הפריטים הפוטנציאליים המקושרים לתופעה זו. כמו כן, כמה רקמות מכוסים trichomes אשר יכול לחסום את המידות. לבסוף, הכניסה מודד תכונות מכניות בכיוון הניצב לגבי משטח התא ואנחנו יכולים לתהות אם זה יכול להיות קשור בקלות הרחבה הקיר התא הקשורים קיבולת הצמיחה. מספר מחקרים מראים שזה המקרה¹⁵^,¹⁶.

שווה לעשות כאן התבוננות כללית יותר על המדידה/יישום של כוחות על ידי AFM. כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, כדי להיות מסוגל להפוך displacements לייזר על הפוטודיודה לכוחות, יש לבצע כיול. בכיול זה פרמטר אחד, רגישות הסטה, מאפשר להמיר displacements לייזר להטיה בפועל של הזיז (נמדד בדרך כלל nm), ולכן גורם זה מכייל את מתח הפלט פוטודיודה (לאורך הצירים האנכיים) כדי לdisplacements ב nm. הגורם השני הוא קבוע האביב K, נמדד ב-N/m, אשר ממיר הדדות מזיז אנכי ביחידות כוח (בדרך כלל nN), מאז מנוף התלויה גמיש להתנהג כמו מעיינות. גם אם ההליך נראה פשוט, כיול חזק ומשתנה של K עבור מדידות מדידת כוח של afm כוחות הוא עדיין בעיה, בגלל מקורות שגיאה שונים שיכולים להשפיע על השלבים השונים של ההליך. לדוגמה, המדידה של רגישות הסטה ממימוש עקומת כוח על משטח נוקשה, יכולה להוביל לערכים שגויים אם הקצה מחליק על פני השטח, או אם המשטח אינו נקי באופן מושלם או גם אם טעינת משטח מובילה לדחייה אלקטרוסטטית. בכל המקרים הקודמים, חלק איש הקשר של עקומת הכוח יהיה מעוות (מוטה יותר או מעוקל במקום ליניארי).

הליך איש הקשר המתואר בסעיף הפרוטוקול הוא רק אחד ממספר פרוצדורות קיימות של כיול. קיימות לפחות 2 שיטות נוספות שניתן להשתמש בהן בצורה קלה וזולה יחסית: שיטת Sader (הנקראת גם ללא קשר כאשר מיושמת בתוכנות AFM מסוימות) או בשיטת ההפניה. שיטת sader¹⁷ פותחה במקור על ידי ג ' ון sader עבור V בצורת מנופים ולאחר מכן עבור אלה מלבני¹⁸ אינו זקוק לרכישת כוח עיקול על מצע נוקשה. במקום זאת, המשתמש צריך לציין (מתוך הטמפרטורה כמו בשיטת איש הקשר), את האורך והרוחב של הזיז ואת צפיפות וצמיגות של הנוזל שבו הזיז הוא (בדרך כלל אוויר, מים או נוזלים כמו מים). לאחר מכן מתקבל ספקטרום תרמי ורגישות הסטה וקבוע האביב נמדדים. שיטה זו היא יתרון בעת שימוש בטיפים חדים מאוד או פונקציונלי שעלולים להיפגע באמצעות עקומת כוח על מצע נוקשה.

שתי השיטות הקודמות מתייחסות לרכישת ספקטרום התנודה של הזיז התרמי. כאשר מנופים נוקשים משמשים בטמפרטורת החדר, משרעת תנודות מתכוון יכול להיות נמוך יותר 0.1 ננומטר, מה שהופך את פסגת התהודה קטן יותר וקשה יותר לזהות. בכל מקרה, לפחות בשני המכשירים המשמשים בנייר זה, ניתן לזהות את פסגת התהודה באוויר ובמים ומותאמת למדידת קבוע האביב (בהתחשב בכך שכאשר המדידה נעשית בנוזל, תדירות התהודה משתנה למטה ערכים ומרחיב הפסגה).

שיטה שלישית אינה משתמשת במנגינה תרמית, אלא במקום שלוחה התייחסות או מבנה אלסטי הפניה, עם קבוע קפיץ ידוע (בדרך כלל עם חוסר ודאות סביב או מתחת 5%), על מנת לקבוע את הזיז K. במקרה זה עקומת כוח הראשון צריך להיות נרכש על מצע נוקשה כדי למדוד את הרגישות הסטה (אשר מגיע שוב יחד עם כל החפצים האפשריים המשפיעים על צורת עיקול). לאחר מכן המצע נוקשה מוחלף על ידי זיז ההפניה (בדרך כלל שלוחה קטנה יותר עם קבוע קפיץ מכויל) ועוד (או מספר אחרים) עקומת כוח מבוצעת, הקלטה שוב את הערך של רגישות הסטה. לאחר מכן, קבוע הקפיץ של הזיז מחושב כ:
Equation 5

כאשר K_ref הוא קבוע האביב של ההפניה זיז, s_ref רגישות הסטה נמדד על זה, L הוא האורך שלו _נוקשה הוא רגישות הסטה נמדד על נוקשות מצע. ΔL הוא היסט בין הקצה לבין הסוף של זיז ההפניה תלוי ביישור שנעשה על ידי המשתמש ולבסוף α היא זווית ההטיה של הזיז, שצוין על ידי יצרן afm. ניתן להשתמש באותה שיטה על מבנים גמישים שתוכננו במיוחד עבור כיול זיז או כניסה. היתרון של מבנים אלה (כי הם בדרך כלל מעגלי) הוא K במרכז שלהם הוא קבוע ולא תלוי בפרמטר גיאומטרי כלשהו או על מיקום מדויק של קצה afm עליהם, כך הסרת l ו Δl מהנוסחה הקודמת.

המשתמש AFM צריך לזכור כי כל שיטות כיול אלה מושפעים מקורות שגיאה שונים (החלטה רגישות הסטה בראשון ושלישי, השימוש במנגינה תרמית במקרה של התלויה הנוקשות הראשון והשני גיאומטרי הפרמטרים והיישור עבור השלישי, כמו גם דיוק כיול של K_ref בנושא ההפניה למקרה משמש) ושיטות הקשר עלולות להזיק לקצה (במיוחד השלישי, כאשר הכיול כופה את השימוש בשני דגימות שונות). הדבר מרמז על כך שקבוע האביב יהיה תמיד קבוע עד לדיוק מסוים וכך יהיה הכוחות הנמדדים/שהוחלו (ראה סיקורה¹⁹ לסקירה מקיפה של שיטות כיול שונות והדיוק שלהם. משמעות הדבר היא כי לחצים מודוללי וטורגור של צעירים יושפעו גם על ידי כיול זיז. בכל מקרה, עוד מקורות שגיאה חשובים יותר מעורבים בעת חישוב כמויות אלה (כמו שימוש במודלים פשוטים לקביעת המודולטיות של יאנג) כך שתמיד יהיה אתגר להשיג ערכים מוחלטים מתוך סוגים אלה של מדידות. מה שחשוב הוא להשיג ערכים שהם מסדר הגודל הנכון ומתאימים זה לזה, כלומר, אם הניסוי חוזר על עצמו על-ידי אותו משתמש במדגם זהה, הערכים צריכים להיות תואמים. כדי להשיגה, יש לבצע את הכיול בזהירות, ומקורות שגיאה חייבים להיות ממוזערים (לדוגמה, להגביל ככל הנראה רעש אקוסטי/תנודות). אסטרטגיה אפשרית אחת ממוקדת להגדיל את קוהרנטיות של כיול חוזרות הוצע לאחרונה בעיתון על ידי Schillers et al.²⁰, שם הודות שיתוף פעולה של 11 מעבדות אירופאיות, פרוטוקול (נקרא הצמד) כדי לפצות על שגיאות ב קביעת רגישות הסטה פותחה. במאמר זה המחברים משתמשים בידיות מכוילים ישירות עבור המידות שלהם, בכל מקרה אותו פרוטוקול ניתן להחיל על מנופים לא מכויל, פשוט מכייל אותם בפעם הראשונה עם שיטת הבחירה ולאחר מכן בהתחשב באביב הראשון קבוע כערך ההפניה ("מכויל").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנחנו רוצים להודות לצוות הפלטים על התמיכה הטכנית שלהם, כמו גם ארצקי בודאוד וחברי צוות הביוסיק במעבדת RDP לדיונים מועילים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).

Developmental Biology

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.