Summary
Qui, presentiamo la microscopia a forza atomica (AFM), operata come strumento di nano- e micro-rientranza su cellule e tessuti. Lo strumento consente l'acquisizione simultanea della topografia della superficie 3D del campione e delle sue proprietà meccaniche, tra cui il modulo della parete cellulare Young e la pressione del turgor.
Abstract
Qui presentiamo l'uso della microscopia a forza atomica per far rientrare i tessuti delle piante e recuperare le sue proprietà meccaniche. Utilizzando due diversi microscopi in modalità di rientro, mostriamo come misurare un modulo elastico e usarlo per valutare le proprietà meccaniche della parete cellulare. Inoltre, spieghiamo anche come valutare la pressione del turgor. I principali vantaggi della microscopia a forza atomica sono che è non invasiva, relativamente rapida (5-20 min), e che praticamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale vivente superficialmente piatto può essere analizzato senza la necessità di trattamento. La risoluzione può essere molto buona, a seconda della dimensione della punta e del numero di misure per unità di area. Una limitazione di questo metodo è che dà solo accesso diretto allo strato di cellule superficiali.
Introduction
La microscopia a forza atomica (AFM) appartiene alla famiglia di microscopia a sonda a scansione (SPM), dove una punta con un raggio di solito di pochi nanometri scansiona la superficie di un campione. Il rilevamento di una superficie non si ottiene tramite metodi ottici o basati su elettroni, ma tramite le forze di interazione tra la punta e la superficie del campione. Pertanto, questa tecnica non si limita alla caratterizzazione topografica di una superficie campione (risoluzione 3D che può scendere a pochi nanometri), ma consente anche la misurazione di qualsiasi tipo di forza di interazione come l'elettrostatica, van der Waals o forze di contatto. Inoltre, la punta può essere utilizzata per applicare le forze sulla superficie di un campione biologico e misurare la deformazione risultante, la cosiddetta "indentazione", al fine di determinarne le proprietà meccaniche (ad esempio, il modulo di Young, le proprietà viscoelastice).
Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari delle piante sono essenziali per essere prese in considerazione quando si cerca di comprendere i meccanismi alla base dei processi di sviluppo1,2,3. Infatti, queste proprietà sono strettamente controllate durante lo sviluppo, in particolare poiché l'ammorbidimento della parete cellulare è necessario per consentire alle cellule di crescere. AFM può essere utilizzato per misurare queste proprietà e studiare il modo in cui cambiano tra organi, tessuti o stadi di sviluppo.
In questo articolo, descriviamo come usiamo AFM per misurare sia le proprietà meccaniche della parete cellulare che la pressione del turgor. Queste due applicazioni sono dimostrate su due diversi microscopi AFM e sono descritte qui dopo.
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Protocol
1.Misura delle proprietà meccaniche delle pareti cellulari
NOT: Viene presentato un esempio del gynoecium in via di sviluppo dell'Arabidopsis.
- Preparazione dei campioni biologici
- Raccogliere un bocciolo di fiore chiuso allo stage 9 a 10 (circa 0,5 mm di lunghezza) in base alle fasi pubblicate determinazione per Arabidopsis4. Sotto un binocolo, utilizzando belle pinzette, aprire con attenzione il germoglio per controllare la fase di sviluppo e raccogliere il gynoecium situato al centro del fiore.
- Mettere il gynoecium su nastro doppio lato posto al centro del coperchio di una piccola parabola Petri (diametro di 5 cm).
NOT: In alternativa, la colla biocompatibile può essere utilizzata anche per un'immobilizzazione più efficiente del campione al momento dell'indentazione. - Aggiungere rapidamente acqua fino a coprire completamente il campione. In questo modo si evita la disidratazione e si riduce l'adesione della mancia al campione. In alternativa, immergere il campione in mezzo liquido, come arabidopsis apex coltura media5.
- calibrazione AFM
- Impostare la molla a sbalzo costante k abbastanza alto per consentire la deformazione della superficie del campione fino al rientro desiderato, ma non troppo alto per evitare la perdita di sensibilità.
NOT: Come regola approssimativa, se il modulo di Young del campione è noto, l'ordine di grandezza della costante di molla può essere scelto come k:E , dove ,dove , è il rientro desiderato. - Utilizzare una punta sferica R da 400 nm con una distanza di 15 m con punta-cantilever.
NOT: Il raggio della punta è direttamente correlato alla risoluzione laterale. Generalmente, per il rientro sui materiali biologici, scegliere punte arrotondate (R maggiore di 10-20 nm) o sonde colloidali. Piccole sonde colloidali possono essere difficili da usare a causa della piccola distanza tra l'estremità della punta e il sbalzo che può toccare la superficie del campione. - Accendere il software e posizionare la testa orizzontalmente almeno 2-3 h prima dell'esperimento: questo permetterà alla testa di termosizzare ed eviterà movimenti relativi a sbalzo-laser indotti termicamente. Se il microscopio è dotato di un modulo CellHesion (estendendo l'intervallo di piezo disponibile a 100 m invece di 15 m), accendere prima il controller e quindi selezionare la modalità CellHesion all'avvio del software.
- Montare lo sbalzo sul blocco di vetro e montare il blocco sulla testa. Mettere una goccia di alcuni microlitri di acqua ultrapura sulla punta per evitare la formazione di bolle d'aria quando la punta viene immersa in acqua.
- Mettere un campione duro (scivolo di vetro pulito o zaffiro) e aggiungere 30-50 l di acqua ultrapura.
NOT: La procedura di calibrazione qui descritta è la calibrazione a volte chiamata contatto. In primo luogo, viene fatta una curva di forza su una superficie rigida e piatta e quindi viene registrato lo spettro di oscillazione del cantilever etica termicamente eccitato per calcolare la costante a molla. Esistono altri protocolli di calibrazione che saranno descritti brevemente nel paragrafo della discussione. - Posizionare la testa sul palco (fare attenzione a sollevare i motori di z abbastanza alto). Utilizzare l'immagine ottica per posizionare approssimativamente il laser sul cantilever.
- Spostare il laser lungo l'asse principale del cantilever monitorando il segnale di somma sul fotodiode.
NOT: Quando si utilizzano sbalzi standard, si deve ottenere una somma maggiore di 0,5 V. - Spostare il laser lungo l'altra direzione e massimizzare il segnale di somma per posizionare il laser al centro dello sbalzo. Questo ridurrà al minimo il cross-talk tra deflessione laterale e verticale.
- Spostare il laser lungo l'asse principale del cantilever monitorando il segnale di somma sul fotodiode.
- Misurazione della sensibilità di deflessione
NOT: Il fotodiodo legge lo spostamento laser e fornisce un segnale in volt. Per poter misurare la deflessione nell'unità metrica, è necessario misurare la sensibilità di deflessione.- Impostare lo strumento in Contatto - Forza spettroscopia. Impostare un setpoint relativo su 2 V, la lunghezza z su 0,5 m ed estendere la velocità a 2 m/s (frequenza dicampionamento a 10000 Hz) e selezionare il loop chiuso .
- Aprire il Gestore calibrazione e selezionare la parte di contatto della curva di forza (che dovrebbe essere lineare) per fare una misura lineare: l'inverso della pendenza dà la sensibilità di deflessione. La lettura del fotodiode è ora calibrata in unità metriche.
-
Determinazione della costante a molla. In Gestore calibrazione, selezionare Costante di molla per eseguire un'acquisizione dello spettro termico. Per calcolare la media del segnale per un periodo di tempo più lungo, selezionare il simbolo . Lo spettro di potenza del sbalzo thermalenizzato può mostrare diversi picchi; disegnare una selezione intorno a quella posizionata alla frequenza più bassa per adattarla.
NOT: Se la sintonizzazione termica viene eseguita in liquido, il picco di risonanza sarà più ampio e la sua frequenza abbassata rispetto a quella nominale.
- Impostare la molla a sbalzo costante k abbastanza alto per consentire la deformazione della superficie del campione fino al rientro desiderato, ma non troppo alto per evitare la perdita di sensibilità.
- Configurazione e acquisizione dell'esperimento di spettroscopia forzata
- Posizionare il campione sullo stadio AFM e posizionare la testa sopra il campione.
NOT: Assicurarsi che la testa sia stata retratta abbastanza da evitare un contatto duro tra la punta e la superficie del campione. - Lasciare termicamente lo sbalzo per qualche minuto.
- In modalità QI, approccio con una forza Setpoint di 50 nN.
- Impostare una lunghezza di 4 m e un'area di scansione su 80 x 80 m2 con un numero di pixel di 40 x 40. Nel pannello Impostazioni avanzate di imaging, impostare la modalità su velocità costante. Impostare la velocità di estensione e retrazione a 200 m/s e le velocità di campionamento a 25 kHz.
- Avviare la scansione e utilizzare questa scansione rapida a bassa forza per verificare se il campione si sposta. Verificare che l'area scansionata sia priva di detriti o cellule deviate e individuare una regione di interesse il più piatta possibile per eseguire le misurazioni.
NOT: Per apprezzare l'inclinazione del campione reale, il livellamento della linea deve essere impostato su OFF o su Costante. Un angolo di inclinazione eccessivo tra l'asse di rientro e la superficie avrà un effetto sul modulo del giovane misurato5. - Una volta individuata un'area di interesse, selezionare un'area da 40 x 40 a 60 x 60 m2 intorno ad essa e aumentare il numero di pixel per raggiungere i 2 pixel/m. Aumentare il Setpoint a 500 nm per ottenere 100-200 nm di rientro. Regolare questo valore, se necessario, all'inizio dell'esperimento. Ridurre la lunghezza di z a 2 m. Diminuire la velocità di estensione e retrazione a 100 m/s e aumentare la velocità di campionamento a 50 kHz.
- Avviare la scansione e salvare l'output (generalmente composto da un'immagine e un file di dati).
- Alla fine della giornata di misurazione, rimuovere il supporto della punta e risciacquarlo delicatamente con acqua ultrapura e il 70% EtOH.
- Asciugare e rimuovere lo sbalzo. Per ulteriori esperimenti con lo stesso suggerimento, prendere in considerazione la pulizia con un protocollo di pulizia dell'umidità e, se possibile, un trattamento con plasma O2 di follow-up. Non lasciare asciugare l'acqua sul portasci a sbalzo e/o sul supporto della punta per evitare la cristallizzazione del sale.
- Posizionare il campione sullo stadio AFM e posizionare la testa sopra il campione.
- Analisi dei dati (per la versione del software di elaborazione dati 6.x)
- Aprire il software di elaborazione dati e caricare il file di dati.
- Fare clic sul pulsante Usa questa mappa per l'elaborazione batch per utilizzare gli stessi parametri di analisi su tutte le curve della mappa.
- In Carica processo predefinitoselezionare Adatta Hertz.
- Utilizzare la prima scheda per verificare o modificare i parametri di calibrazione.
- Nella seconda scheda, rimuovere un offset (o un offset più un'inclinazione) dalla linea di base per impostare il valore medio su 0.
- Nella terza scheda, stimare la posizione del punto di contatto (POC) considerandola come il primo punto che attraversa la forza 0 quando scende dal valore del setpoint lungo la curva di estensione.
- La posizione della punta verticale della linguetta calcola il movimento della punta sottraendo la deflessione a sbalzo dall'altezza misurata. In questa fase, utilizzare Altezza non levigata (dati grezzi) per la misura seguente, selezionando la casella di controllo corrispondente.
- Nella scheda Adattamento elasticità selezionare il modello di adattamento appropriato. Se l'adezione nessuna o debole è visibile sulle curve di ritrazione (corrispondente a meno del 10% della forza di setpoint o alla forza media massima alla profondità di rientro selezionata), il tipo di modello deve essere impostato su Hertz/Sneddon ed è necessario utilizzare la curva di estensione. In caso di maggiore adesione, il modello DMT, che sta per il modello Derjaguin-Muller-Toporov, dovrebbe essere preferito e l'adattamento deve essere eseguito sulle curve di ritrazione (fare riferimento al manuale per i dettagli sui modelli di contatto disponibili e sulle relative formule).
- Impostare i parametri geometrici della punta in base alla forma della punta nominale. Qui, Forma punta è sfera e Raggio punta è 400 nm.
- Impostare il Rapporto di Poisson su 0,5 in quanto è convenzionalmente fatto per il materiale biologico (corrispondente al materiale incomprimibile).
-
Adatta a un rientro specifico. Per default, la forma viene eseguita su tutta la curva. Se l'adattamento deve essere eseguito fino a un rientro specifico, selezionare innanzitutto la casella di controllo Curva di spostamento; questo sposterà l'origine della curva in base ai valori di base e POC appena determinati.
- Aggiungere una seconda routine di adattamento elasticità facendo clic sull'icona nella finestra principale.
- Impostare nuovamente tutti i parametri di adattamento e specificare in X min il rientro desiderato. Aggiungere tutti i passi necessari (da 2 a 3 passi dovrebbero essere sufficienti) al fine di affinare la determinazione della posizione POC e successivamente la profondità di indentazione calcolata. Il processo può essere salvato a questo punto.
- Fare clic su Mantieni e applicare a tutti per scorrere i passaggi precedenti su tutte le curve della mappa.
- Salvare i risultati. Verranno ottenuti un'immagine e un file con estensione tsv.
2. Misura della pressione di Turgor
NOT: Viene presentato un esempio di meriste dell'infiorescenza trattata con orizalina dell'Arabidopsis.
- Preparazione del campione biologico
- Raccogliere Arabidopsis inflorescenza meristem (IM) trattata con il farmaco dideptante microtubulo oryzalin da pianta in vitro coltivato su mezzo contenente l'inibitore del trasporto di auxina polare 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) secondo il metodo pubblicato 6.
- Esempio di montaggio di messaggistica istantanea seguendo una delle due opzioni
- Per il monitoraggio a lungo termine: montare il campione in una piana-piatta contenente Arabidopsis apex coltura medium (ACM)7,8 e 0.1% miscela di conservazione vegetale (PPM), per evitare contaminazioni. Sospendere la punta IM sopra la superficie ACM e sostenere la base di IM con una caduta del 2% agarose.
- Per la misurazione con rapidi cambiamenti di soluzione:montare il campione in una piastra Petri che contiene un piccolo pezzo di mastice adesivo e sigillare rapidamente lo spazio tra il mastice e la base del campione con colla biocompatibile. Attendere che la colla si solidifichi (meno di 2 min), quindi immergere il campione in ACM liquido contenente 0.1% PPM.
NOT: Assicurarsi che la superficie del campione non sia rivestita con agarose o colla quando si fissa la base del campione. La misurazione AFM della pressione del turgor richiede che il campione sia montato stabilmente e i metodi di montaggio precedenti forniscono una stabilità accettabile. A seconda del campione, potrebbero essere utilizzati altri metodi di montaggio, come nastro a doppio lato, poli-lisina, ecc.
- calibrazione AFM
- Accendere il software di acquisizione AFM e scegliere la modalità di misurazione PeakForce QNM (grande ampiezza).
- Eseguire la calibrazione seguendo lo stesso principio descritto nei passaggi da 2.1 a 2.6.
- Nella finestra Controlla parametri, impostare Dimensione scansione su 0. Nella finestra Rampa impostare Dimensioni rampa tra 200 nm e 500 nm, soglia Trigometriva compresa tra 2 V e 5 V e Numero di campioni su 2048 o superiore.
- Allineare la punta a sbalzo con il campione di calibrazione e fare clic su Avvicinato.
- Al contatto, andare alla finestra rampa e fare clic sul pulsante Rampa continua. Nello regime lineare della curva, determinare la pendenza facendo clic sul pulsante Aggiorna sensibilità. Ripetere la misurazione della sensibilità di deflessione più volte e aggiornare manualmente la calibrazione con la media di misurazione aprendo il rilevatore di tabulazione dal menu Calibrazione.
- Ritirare la testa AFM e rimuovere il campione di calibrazione.
NOT: Si consiglia di ritrarre completamente la testa AFM scegliendo la scheda Fase - Inizializza per evitare un contatto duro accidentale al momento della modifica del campione.
- Configurazione e acquisizione dell'esperimento di spettroscopia forzata
- Se il campione non è ancora sommerso, sommergerlo con ACM liquido contenente PPM.
- Nel software di acquisizione, specificare i parametri di misurazione come segue:
- Nella finestra del parametro Controllo, impostare la costante Molla sulla costante a molla prodotta del cantilever o sulla costante di molla determinata come nel passaggio 2.8. In questo esempio, è impostato su 42 N/m.
- Impostare Raggio suggerimento su 400 nm in questo esempio.
- Impostare il rapporto del campione di Poisson a 0,5, poiché l'acqua contribuisce principalmente alla pressione del turgor.
- Impostare Esempio/Linea su 128 per garantire una rapida acquisizione.
- Impostare La velocità di scansione su 0,2 Hz.
- Impostare Dimensione scansione su 1 m.
NOT: L'impostazione della velocità di scansione e delle dimensioni ridotte della scansione può impedire efficacemente i danni causati dal campione attivato dalla scansione AFM. Si consiglia di ridurre questi due parametri su qualsiasi modifica del campione. - Nella finestra Rampa, impostare Dimensione rampa su 5 m.
NOT: È meglio impostare le dimensioni della rampa più grandi della profondità di rientro prevista per una migliore acquisizione della linea di base. - Impostare Soglia trigonometria al massimo.
- Impostare Numero di campioni su 4608.
- Facoltativamente, nella scheda Microscopio - Parametri di coinvolgimento, ridurre i seguenti parametri per evitare forti danni ai campioni causati dal contatto. Impostare Picco Forza Engage Setpoint su 0.3 V (predefinito 0.5 V). Impostare Guadagno Coinvolgimento int. su 0,5 (valore predefinito 0,75). Impostare il passo di impegno SPM su 4 m (predefinito 15 m).
- Posizionare e allineare il campione sotto la testa dell'AFM e avvicinare fino a quando il cantilever non viene sommerso ma non a contatto con la superficie del campione.
NOT: Mentre ci si avvicina, soffia reattivamente sulla superficie dell'ACM liquido fino a quando non si forma un ponte liquido tra lo sbalzo e la superficie liquida. Questo di solito impedisce il contatto duro. - Con attenzione, avvicinarsi manualmente al campione. Quando la sonda è relativamente vicina alla superficie campione, fare clic su Avvicinamento.
- Al momento del contatto, aumentare gradualmente le dimensioni della scansione e/o la velocità di scansione fino a un equilibrio desiderato senza danneggiare il campione e/o il cantilever.
NOT: La dimensione della scansione è limitata dalla curvatura della superficie e dalla rugosità del campione. Nel caso di IM trattato con oryzalin, è possibile ottenere una velocità di scansione di 0,3 Hz pari a 50 x 50 m 2. - Durante la scansione, determinare se l'area di misurazione è quella desiderata. Riposizionare se necessario. Quando soddisfatto, fare clic sul pulsante Punto e sparare per avviare il punto e riprendere la finestra.
- Prima di registrare la scansione, scegliere un canale immagine appropriato che possa facilitare la chiara identificazione dei contorni delle celle. Spesso, errore di forza di picco, Modulus DMT, LogDMT Modulus o Dissipation è adatto. Specificare la directory di salvataggio e il nome del file. Quindi fare clic su Rampa alla scansione successiva per avviare la registrazione.
NOT: Una stringa di un punto e tre numeri verranno aggiunti automaticamente dopo il nome del file designato (ad esempio .000). Questo numero aumenta automaticamente di 1 a ogni ripetizione di scansione salvata. - Al termine della scansione, l'interfaccia software verrà automaticamente reindirizzata alla finestra Ramp. Fare clic sull'immagine acquisita per specificare le posizioni in cui applicare il rientro.
NOT: Prima di registrare le rientranze, è preferibile scegliere diversi punti di riferimento per eseguire i rientri di prova facendo clic su Solo rampa, nel caso in cui sia necessaria l'alternanza dei parametri (per la dimensione della rampa,la posizione di Piezo, ecc.). La profondità di rientro deve essere maggiore dello spessore della parete della cellula (idealmente determinata separatamente dalla microscopia elettronica di trasmissione). - Scegliere almeno tre siti di rientro per cella vicino al baricentro e ripetere il rientro tre volte per sito. Ciò produrrebbe almeno nove curve di forza per cella per un'ulteriore analisi. Quando si è soddisfatti del posizionamento del sito di rientro, fare clic su Rampa e acquisizione. Le curve di rientro forzato vengono salvate automaticamente nella directory designata.
- Quando le rampe sono completate, riposizionare in una posizione diversa per la misurazione della piastrella, o ritrarre la testa di scansione e cambiare il campione.
- Al termine, pulire il cantilever come nei passi 1.3.8 e 1.3.9.
- Analisi dei dati
- Nel software di analisi, aprire il file mca. Questo mostra la posizione di ogni curva di forza sull'immagine acquisita. Se lo si desidera, preselezionare le curve di forza per l'analisi.
- Aprire una curva di forza da analizzare, in genere nel formato x0000y.00z, dove x è il nome file specificato nella directory di salvataggio mentre y e z sono numeri registrati automaticamente che denotano sequenza di rientro e numero di scansione.
- Fare clic sul pulsante di correzione Linea di base e trascinare le linee tratteggiate blu sulla curva di forza fino a quando l'estensione dell'inizio della linea di base di origine e l'estendo'estendi interruzione della linea di base di origine sono rispettivamente allo 0% e all'80%. Fare clic su Esegui.
NOT: In alternativa, estendere l'opzione di base di origine può essere impostata su valori diversi, purché si trova ancora all'interno della linea di base e non oltre il punto di contatto. - Fare clic sul pulsante Filtro Boxcar e fare clic su Esegui per forzare la curva smussata.
- Fare clic sul pulsante Rientro.
- Nella finestra Input, impostare la curva attiva su Estendi.
- Impostare Il metodo di adattamento su Modello linearizzato e Includi forza di adesione su Sì.
- Impostare Limite di adattamento forza massima su 99% e Limite di adattamento forza min al 75%.
- Impostare Adatta modello su Rigidità (Lineare).
NOT: Questa configurazione calcolerà l'apparente rigidità k per la deduzione della pressione del turgor. In questo esempio, i contorni di adattamento riflettono una rigidità di circa 1,5 m di profondità di rientro.
- Le curve di forza possono essere analizzate in batch. Fare clic sul pulsante Esegui cronologia, specificare la directory del report e aggiungere tutte le altre curve di forza che richiedono lo stesso trattamento. Quando soddisfatto, fare clic su Esegui. Per impostazione predefinita, l'adattamento verrà memorizzato come file con estensione txt.
- Quando k è in batch, fare clic su Cronologia - 5 Rientro per tornare alla finestra di rientro.
- Impostare Limite di adattamento forza massima su 10% e Limite adattamento forza min su 0%.
- Impostare Adatta modello a Hertzian (sferico).
NOTA: Questo calcolerà il modulo della parete cellulare Young per la deduzione della pressione turgor. In questo esempio, i contorni di adattamento riflettono un adattamento hertziano (utilizzando una sonda sferica) di circa 0,4 m di profondità di rientro.
- Ripetere il passaggio 2.4.6 per il batch adatto a E.
- Aprire il file .00z (z è il numero di scansione registrato automaticamente) per visualizzare i diversi canali di scansione. Nella finestra del canale Altezza, fare clic sul pulsante Sezione. Ciò consentirà la misurazione della curvatura superficiale del campione necessaria per la deduzione della pressione del turgor.
- Disegnare una linea sull'asse lungo di una cella, spostare i bordi della linea tratteggiata ai bordi della cella e registrare il valore Raggio r1. Ripetere questa operazione per l'asse breve per recuperare il raggio r2. Calcolare la curvatura media della superficie della cella m e la curvatura gaussianaG utilizzando le due misure di raggi come segue:
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- Disegnare una linea sull'asse lungo di una cella, spostare i bordi della linea tratteggiata ai bordi della cella e registrare il valore Raggio r1. Ripetere questa operazione per l'asse breve per recuperare il raggio r2. Calcolare la curvatura media della superficie della cella m e la curvatura gaussianaG utilizzando le due misure di raggi come segue:
- Dedurre la pressione del toro P utilizzando il modello a guscio sottile pubblicato9 come segue:
con
dove t è lo spessore della parete cellulare determinato dalla microscopia elettronica.
NOT: La deduzione della pressione del turgor è un processo di adattamento, in cui sono necessarie iterazioni. Quattro iterazioni sono generalmente in grado di riprodurre il prodotto stabile, tuttavia è possibile eseguire più iterazioni (ad esempio 100 volte). - Calcolare la media E, k e P per cella. Inoltre, registrare la variabilità intracellulare (ad esempio, deviazione standard) per la documentazione.
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Representative Results
Figura 1A e Figura 1B mostra una schermata che illustra il risultato dei passaggi da 1.3.4 a 1.3.6 del protocollo, utilizzato per individuare un'area di interesse in cui acquisire la mappa di QI. Vale la pena ricordare che la regione di interesse è stata scelta per non essere su una superficie inclinata (cioè il più piatta possibile). In realtà, come notato da Routier et al.5, se l'asse di rientro non è perpendicolare alla superficie, il modulo del Giovane misurato può essere sottovalutato. Questo effetto è visibile nell'angolo superiore destro dei pannelli C o D della figura1, in cui parte del bordo delle celle appare più morbida rispetto al resto della cella. I manufatti indotti da questo effetto saranno molto più forti nel caso dei meristem, dove l'angolo di inclinazione locale può facilmente superare le aree di scansione di 40 x 50 m 2. Nel nostro laboratorio, stiamo attualmente sviluppando un algoritmo, basato sull'approccio descritto da Routier et al.5, per correggere quei manufatti (carta in preparazione). Figura 1C e Figura 1D Mostra le mappe modulo di Young ottenute dopo l'analisi dettagliata nel quarto paragrafo del protocollo. In particolare, il pannello C rappresenta il modulo del Giovane ottenuto analizzando l'intero rientro, fino al setpoint di forza definito dall'utente, mentre il pannello D mostra il risultato dell'analisi dei primi 100 nm di rientro (come descritto al punto 1.4.9). Qui, le 2 mappe sembrano molto simili, perché durante la configurazione dell'esperimento, il setpoint è stato scelto per ottenere rientri medi intorno a 100 nm. La variazione del rientro analizzato può talvolta portare a una migliore evidenziazione delle eterogeneità campione, che possono essere utili per identificare la posizione o per fornire informazioni sul comportamento delle strutture interne (ad esempio, Costa et al.10)
La curva di forza in Figura 2 mostra due effetti che vale la pena menzionare. Prima di tutto, si può notare che se la parte di avvicinamento della curva di forza termina effettivamente alla forza di setpoint di 500 nN, il movimento della punta verso il basso continua ad andare avanti, il che significa che la forza finale applicata dalla punta è più alta del previsto (qui 1.000 nN). Ciò è dovuto al fatto che il ciclo di feedback che monitora la deflessione a sbalzo non agisce istantaneamente, quindi il suo tempo di reazione finito introduce un ritardo tra il rilevamento della soglia di deflessione e l'arresto del movimento del piezo. Inoltre, soprattutto quando si utilizza CellHesion che muove il supporto del campione, entra in gioco l'inerzia delle parti in movimento, rendendo questo ritardo di tempo più lungo. Questo problema può essere limitato utilizzando il piezo testa, nel qual caso l'utente deve essere molto attento nel caso di misurazioni su campioni molto ruvidi o inclinati, o riducendo la velocità della rampa, che comunque limita la risoluzione e/o il numero di campioni scansionati ( inoltre per mappe troppo lente, la crescita del campione può diventare un problema). In genere, se le curve di forza sono abbastanza distanti l'una dall'altra (in base al modello di rientro di scelta, il raggio dell'area rientrata può essere calcolato in base alla profondità di rientro e utilizzato come distanza minima di separazione), le misurazioni eseguite in le posizioni lungo il campione non devono essere correlate e se l'analisi viene eseguita sulla curva di avvicinamento, superare la soglia di forza non dovrebbe essere un problema. In ogni caso, se il campione è delicato o se vengono eseguite scansioni ripetute sulla stessa area, lo scienziato potrebbe voler cercare di ridurre al minimo questo overshoot. Purtroppo, non c'è una regola empirica per determinare la quantità di questo overshoot, dal momento che dipende dal piezo utilizzato, sulle velocità della rampa, ma anche sulle proprietà del materiale: più rigido è il materiale, più veloce è la variazione del segnale di deflessione nel tempo e , dato un tempo di risposta di feedback finito, maggiore è il superamento.
La seconda cosa da notare è l'agitazione sulla curva di ritrazione evidenziata dall'ellisse. Tale agitazione può essere un indicatore di campionamento in movimento / vibrazione sotto l'azione della punta. In questo caso, l'utente può provare a cambiare l'area scansionata (a volte altre parti del microscopio, ma la punta può toccare il campione, o il campione può essere sufficientemente ben fissato al suo supporto) o il campione se molti di essi sono stati preparati sullo stesso supporto. Se la funzione è sempre presente, è meglio cambiare il metodo di fissazione, in questo caso passando dalla fissazione del nastro fronte/retro a collane biocompatibili.
La figura 3 illustra la determinazione dei parametri chiave per la deduzione della pressione del turgor. Ogni parametro, ad eccezione dello spessore della parete cellulare11, che è stato determinato separatamente dalla microscopia elettronica in modo da essere di 740 nm, può essere recuperato dalle scansioni E dalle indentazioni AFM. Dopo il processo di adattamento nella fase 2.4.10, la pressione del turboère viene dedotta a 1,50 MPa per questa curva di forza. Il raggruppamento di tutte e diciotto curve di forza in questa cella produce valori medi di E - 6,77 x 1,02 MPa, k , 14,18 , 2,45 N/m e P , 1,45 , 0,29 MPa (media - deviazione standard).
Figura 1 : mappe topografiche (Misurato altezza) in genere acquisite durante un esperimento. (A) Viene registrata una prima mappa a bassa risoluzione/bassa forza per trovare una regione adatta da scansionare. (B) Per il calcolo del modulo di Young (sull'area evidenziata dal quadrato punteggiato nero) viene acquisita una mappa di forza più piccola ad alta risoluzione/forza superiore. (C) Le mappe del modulo di Young calcolate dalla mappa B, come descritto nel passaggio 1.4. Qui, la mappa del modulo del Giovane è stata ottenuta analizzando l'intero rientro su ogni curva di forza. (D) La mappa del modulo di Young ha ottenuto analizzando solo i primi 100 nm di rientro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esempio di curva di forza. In blu l'approccio, in rosso il segmento di ritrazione. Il massimo di forza (situato sulla curva di ritrazione) è diverso dal punto di forza impostato a causa del tempo di reazione del loop di retroazione finito e dell'inerzia. L'agitazione in curva di ritrazione può essere rappresentativa di una carenza di fissazione del campione al suo supporto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : misurazioni AFM per la deduzione della pressione del turgor. (A) La mappa del modulo DMT mostra un chiaro contorno cellulare per supervisionare il posizionamento di siti di rientro profondo vicino al baricentro della cella. I siti di rientro sono contrassegnati da croci. (B) Forza curva di rientro profondo nella posizione della croce rossa in A. Il modulo della parete cellulare Young E (verde) e l'apparente rigidità del campione k (rosso) sono montati in diversi regimi della curva, come descritto al punto 2.4. R 2 denota il coefficiente di determinazione degli attacchi. (C) Mappa altezza con assi lunghi e corti determinati manualmente di a, raffigurati da linee bianche, della stessa cella analizzata nei pannelli A e B. (D) Profilo altezza degli assi lunghi e corti della cella nel Pannello C (blu, asse lungo rosso, asse corto) e l'asse di adattamento d raggi di curvatura (r1 e r2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'emergere di forme nelle piante è determinato principalmente dal tasso coordinato e dalla direzione della crescita nel tempo e nello spazio. Le cellule vegetali sono racchiuse in una parete cellulare rigida fatta di una matrice polisaccartide, che le incolla insieme. Di conseguenza, l'espansione cellulare è controllata dall'equilibrio tra la pressione del turgor che tira sulla parete cellulare e la rigidità della parete cellulare che resiste a questa pressione. Al fine di comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo, è importante essere in grado di misurare sia le proprietà meccaniche della parete cellulare che la pressione del turgor in diversi tessuti o cellule di un determinato organo. Come dimostrato in questo documento, AFM è il metodo di scelta in questo contesto.
Il protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la preparazione del tessuto che dovrebbe essere abbastanza veloce per evitare la disidratazione. Questo può essere critico in particolare se vogliamo misurare la pressione del turgor. Molto importante è anche una corretta fissazione del campione al suo substrato: un campione instabile può portare a effetti molto evidenti come un movimento macroscopico che può essere facilmente rilevato otticamente, o una forte deformazione delle curve di forza. In ogni caso, la vibrazione del campione o la flessione può essere sottile da rilevare, introducendo artefatti nei risultati. Infine, un altro passaggio critico riguarda la scelta dei parametri di rientro. Questo è determinante per la qualità dei risultati.
Quando si misurano le proprietà meccaniche su grandi aree (oltre 40-50 m di dimensioni della scansione), le differenze di altezza possono essere elevate, rendendo difficile tenere traccia correttamente della superficie e realizzando curve di forza senza raggiungere i limiti della gamma di piezo. Per risolvere questo problema, è stato utilizzato un modulo CellHesion. Questo modulo aggiunge un ulteriore piezo, situato nella fase campione, con un intervallo di 100 m, che consente l'acquisizione di grandi aree senza avvicinarsi pericolosamente ai limiti di piezo.
La prima limitazione del metodo è che possiamo misurare solo gli strati superficiali delle cellule. Tuttavia, recentemente gli autori hanno usato AFM sulle sezioni di tessuto12,13,14. Anche se questo deve essere fatto su materiale fisso, può dare accesso alle proprietà meccaniche degli strati di cellule profonde. In alternativa, sono state eseguite indentazioni più profonde anche per dedurre le proprietà meccaniche dei tessuti interni sui campioni viventi, anche se con maggiore sacrificio sulla risoluzione spaziale15. Una seconda limitazione può essere collegata alla geometria campione, in quanto una superficie con una pendenza ripida può essere problematica poiché la punta non è più perpendicolare al campione. Dobbiamo limitare la gamma di angoli entro i quali le misure sono affidabili e stiamo attualmente sviluppando un algoritmo per correggere potenziali artefatti legati a questo fenomeno. Inoltre, alcuni tessuti sono coperti con tricomi che possono bloccare le misurazioni. Infine, il rientro misura le proprietà meccaniche in una direzione perpendicolare rispetto alla superficie cellulare e possiamo chiederci se questo può essere facilmente collegato all'estendibilità della parete cellulare associata alla capacità di crescita. Diversi studi suggeriscono che è il caso15,16.
Vale la pena fare qui un'osservazione più generale circa la misurazione / applicazione delle forze da parte di AFM. Come descritto nella sezione protocollo, per poter trasformare gli spostamenti laser sul fotodiode in forze, è necessario eseguire una calibrazione. In questo parametro di calibrazione, la sensibilità di deflessione, permette di convertire gli spostamenti laser in deflessione a sbalzo effettivo (generalmente misurata in nm), quindi questo fattore calibra le tensioni di uscita dei fotodiodi (lungo gli assi verticali) Nm. Il secondo fattore è la costante a molla K, misurata in N/m, che converte le deviazioni verticali a sbalzo in unità di forza (generalmente nN), poiché i cantilever flessibili si comportano come molle. Anche se la procedura appare semplice, una calibrazione robusta e riproducibile di K per le misurazioni della spettroscopia della forza AFM è ancora un problema, a causa di diverse fonti di errore che possono influenzare le diverse fasi della procedura. Ad esempio, la misurazione della sensibilità di deflessione realizzando una curva di forza su una superficie rigida, può portare a valori errati se la punta scivola sulla superficie, o se la superficie non è perfettamente pulita o anche se la carica della superficie induce repulsione elettrostatica. In tutti i casi precedenti, la parte di contatto della curva di forza verrà deformata (ulteriormente inclinata o curvata invece che lineare).
La procedura di contatto descritta nella sezione relativa al protocollo è solo una delle diverse procedure di calibrazione esistenti. Ci sono almeno altri 2 metodi che possono essere utilizzati in modo relativamente facile ed economico: il metodo Sader (chiamato anche non contatto quando implementato in alcuni software AFM) o il metodo a sbalzo di riferimento. Il metodo Sader17 è stato originariamente sviluppato da John Sader per i cantilever a forma di V e quindi per quelli rettangolari18 e non necessita dell'acquisizione di una curva di forza su un substrato rigido. Invece, l'utente deve specificare (fuori dalla temperatura come nel metodo di contatto), la lunghezza e la larghezza del cantilever e la densità e viscosità del fluido in cui si trova lo sbalzo (generalmente aria, acqua o un fluido simile all'acqua). Quindi viene acquisito uno spettro termico e vengono misurate sia la sensibilità di deflessione che la costante di molla. Questo metodo è vantaggioso quando si utilizzano punte molto affilate o funzionalizzate che possono essere danneggiate facendo una curva di forza su un substrato rigido.
Entrambi i metodi precedenti riguardano l'acquisizione dello spettro di oscillazione di un sbalzo a sbalzo eccitato termicamente. Quando i cantilever rigidi vengono utilizzati a temperatura ambiente, l'ampiezza media dell'oscillazione può essere inferiore a 0,1 nm, rendendo il picco di risonanza più piccolo e più difficile da rilevare. In ogni caso, almeno per entrambi gli strumenti utilizzati in questa carta, il picco di risonanza può effettivamente essere rilevato nell'aria e nell'acqua e montato per misurare la costante di molla (considerando che quando la misurazione viene effettuata in liquido, la frequenza di risonanza si sposta verso valori e il picco si allarga).
Un terzo metodo non utilizza una melodia termica, ma invece un cantilever di riferimento o una struttura elastica di riferimento, con una costante di molla nota (generalmente con un'incertezza intorno o sotto il 5%), al fine di determinare il cantilever K. In questo caso è necessario acquisire una prima curva di forza su un substrato rigido per misurare la sensibilità alla deflessione (che si riconduce a tutti i possibili artefatti che influenzano la forma della curva). Quindi il substrato rigido viene sostituito dal cantilever di riferimento (generalmente un sbalzo senza punta con una costante a molla calibrata) e viene eseguita un'altra curva di forza (o pochi altri), registrando nuovamente il valore della sensibilità di deflessione. La costante a molla a sbalzo viene quindi calcolata come:
dove Kref è la costante a molla del cantilever di riferimento, Sref la sensibilità di deflessione misurata su di esso, L è la sua lunghezza e Srigida è la sensibilità di deflessione misurata sulla rigida Substrato. L è l'offset tra la punta e la fine del cantilever di riferimento e dipende dall'allineamento effettuato dall'utente e infine l'angolo di inclinazione del cantilever, specificato dal produttore AFM. Lo stesso metodo può essere utilizzato su strutture elastiche appositamente progettate per la calibrazione a sbalzo o indenter. Il vantaggio di quelle strutture (che sono generalmente circolari) è che K al loro centro è costante e non dipende da alcun parametro geometrico o dal posizionamento preciso della punta AFM su di loro, in modo da rimuovere L eL dalla formula precedente.
L'utente AFM deve tenere a mente che tutti quei metodi di calibrazione sono influenzati da diverse fonti di errore (determinazione della sensibilità di deflessione nel primo e terzo, l'uso di sintonizzazione termica in caso di sbalzi rigidi per primo e secondo e geometrico parametri e allineamento per il terzo, nonché la precisione di calibrazione di Kref nel caso di riferimento a sbalzo è utilizzato) e che i metodi di contatto sono potenzialmente dannosi per la punta (soprattutto il terzo, dove la calibrazione impone l'uso di due campioni diversi). Ciò implica che la costante primaverile sarà sempre determinata fino a una certa precisione e così saranno le forze misurate / applicate (vedi Sikora19 per una revisione completa dei diversi metodi di calibrazione e della loro precisione. Ciò significa che le pressioni dei moduli di Young e del turgor saranno influenzate anche dalla calibrazione a sbalzo. In ogni caso, altre fonti di errore ancora più importanti sono coinvolte nel calcolo di tali quantità (come l'uso di modelli semplificati per la determinazione del modulo di Young) quindi sarà sempre una sfida ottenere valori assoluti da questo tipo di misurazioni. Ciò che è importante è ottenere valori che sono del giusto ordine di grandezza e che sono coerenti tra loro, il che significa che se l'esperimento viene ripetuto dallo stesso utente sullo stesso campione, i valori devono essere compatibili. Per ottenerla, la calibrazione deve essere eseguita con attenzione e le sorgenti di errore devono essere ridotte al minimo (ad esempio limitando il più possibile rumore acustico / vibrazioni). Una possibile strategia volta ad aumentare la coerenza delle ripetute calibrazioni è stata recentemente proposta in un documento di Schillers et al.20, dove grazie alla collaborazione di 11 laboratori europei, un protocollo (chiamato SNAP) per compensare gli errori è stata sviluppata la determinazione della sensibilità di deflessione. In questo articolo gli autori utilizzano cantilever calibrati direttamente per le loro misure, comunque lo stesso protocollo può essere applicato ai cantilever non calibrati, semplicemente calibrandoli la prima volta con il metodo di scelta e poi considerando la prima molla costante come valore di riferimento ("calibrato").
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il team PLATIM per il supporto tecnico, arezki Boudaoud e i membri del team Biophysic presso il laboratorio RDP per le discussioni utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
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