Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59674
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

Summary

هنا، نقدم مجهرية القوة الذرية (AFM)، تعمل كأداة المسافات البادئة نانو والدقيقة على الخلايا والأنسجة. تسمح الأداة بالحصول في وقت واحد على طوبوغرافيا سطح 3D للعينة وخصائصها الميكانيكية، بما في ذلك معامل جدار الخلية يونغ، فضلا عن ضغط التورغور.

Abstract

نقدم هنا استخدام مجهرية القوة الذرية لأنسجة النبات المسافة البادئة واستعادة خصائصه الميكانيكية. باستخدام اثنين من المجاهر المختلفة في وضع المسافة البادئة، ونحن نعرض كيفية قياس معامل مرنة واستخدامها لتقييم خصائص جدار الخلية الميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا شرح كيفية تقييم ضغط التورغور. المزايا الرئيسية للميكروسكوب القوة الذرية هي أنه غير الغازية، سريع نسبيا (5 ~ 20 دقيقة)، وأنه يمكن تحليل أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية الحية التي هي مسطحة سطحيا دون الحاجة إلى العلاج. القرار يمكن أن تكون جيدة جدا، اعتمادا على حجم طرف وعلى عدد القياسات لكل منطقة وحدة. أحد قيود هذا الأسلوب هو أنه يعطي فقط الوصول المباشر إلى طبقة الخلية السطحية.

Introduction

ينتمي الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) إلى عائلة الفحص المجهري للمسبار المسحي (SPM)، حيث يقوم طرف بنصف قطر يبلغ عادة بضعة نانومترات بمسح سطح العينة. لا يتم الكشف عن سطح عن طريق الأساليب البصرية أو المستندة إلى الإلكترون، ولكن عن طريق قوى التفاعل بين الطرف وسطح العينة. وبالتالي، فإن هذه التقنية لا تقتصر على التوصيف الطبوغرافي لسطح العينة (دقة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تنخفض إلى بضعة نانومترات)، بل تسمح أيضا بقياس أي نوع من قوى التفاعل مثل الكهروستاتيكي، فان دير والز أو قوى الاتصال. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطرف لتطبيق القوى على سطح عينة بيولوجية وقياس التشوه الناتج، ما يسمى "المسافة البادئة"، من أجل تحديد خصائصه الميكانيكية (على سبيل المثال، معامل يونغ، خصائص لزجة).

الخصائص الميكانيكية لجدران الخلايا النباتية ضرورية يجب أخذها فيالاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة وراء العمليات التنموية 1،2،3. في الواقع، يتم التحكم في هذه الخصائص بإحكام أثناء التنمية، لا سيما منذ تليين جدار الخلية مطلوب للسماح للخلايا بالنمو. يمكن استخدام AFM لقياس هذه الخصائص ودراسة الطريقة التي تتغير بين الأعضاء والأنسجة أو مراحل النمو.

في هذه الورقة، ونحن نصف كيف نستخدم AFM لقياس كل من خصائص جدار الخلية الميكانيكية والضغط turgor. يتم عرض هذين الطلبين على اثنين من المجاهر AFM مختلفة ومفصلة هنا بعد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. قياس الخصائص الميكانيكية جدار الخلية

ملاحظة: يتم تقديم مثال على تطور gynoecium من أرابيدوبسي.

  1. إعداد العينات البيولوجية
    1. جمع برعم زهرة مغلقة في المرحلة 9 إلى 10 (حوالي 0.5 ملم طويلة) وفقا للمراحل المنشورة تحديد لArabidopsis4. تحت منظار، وذلك باستخدام ملاقط غرامة، وفتح بعناية برعم للتحقق من مرحلة التنمية وجمع gynoecium تقع في وسط زهرة.
    2. وضع gynoecium على شريط جانبي مزدوج وضعت في وسط غطاء طبق بيتري صغير (قطرها 5 سم).
      ملاحظة: وكبديل لذلك، يمكن أيضا استخدام الغراء المتوافق بيولوجيا لشل قدرأكبر من الكفاءة للعينة عند المسافة البادئة.
    3. إضافة الماء بسرعة حتى يتم تغطية العينة تماما. هذا يتجنب الجفاف ويقلل من التصاق الطرف إلى العينة. بدلا من ذلك، غمر العينة في وسط السائل، مثلأرابيدوبس قمة الثقافة المتوسطة 5.
  2. معايرة AFM
    1. تعيين الكانتيلفر الربيع ثابت ك عالية بما فيه الكفاية للسماح تشوه سطح العينة تصل إلى المسافة البادئة المطلوبة، ولكن ليس عالية جدا لتجنب فقدان الحساسية.
      ملاحظة: كقاعدة تقريبية من الإبهام، إذا كان من المعروف معامل يونغ من العينة، يمكن اختيار ترتيب حجم ثابت الربيع كما ك-E * δ، حيث δ هو المسافة البادئة المطلوبة.
    2. استخدم R = 400 نانومتر رأس كروية منتهية مع مسافة 15 ميكرومتر tip-cantilever.
      ملاحظة: يرتبط نصف قطر الطرف مباشرة بالدقة الجانبية. عموما، للمسافة البادئة على المواد البيولوجية، واختيار نصائح مدورة(R أكبر من 10-20 نانومتر) أو تحقيقات الغروية. قد تكون المسبارات الغروية الصغيرة صعبة الاستخدام بسبب المسافة الصغيرة بين نهاية الطرف والشمعدانات التي يمكن أن تلمس سطح العينة.
    3. قم بتشغيل البرنامج ووضع الرأس أفقياً على الأقل 2-3 ساعة قبل التجربة: وهذا سيسمح للرأس بالحرارة وسوف يتجنب الحركات النسبية التي يسببها الكانتيلفير بالحرارة. إذا تم تجهيز المجهر مع وحدة CellHesion (توسيع نطاق Z بيزو المتاحة إلى 100 ميكرومتر بدلا من 15 م)، التبديل على وحدة التحكم الخاصة به أولا ثم حدد وضع CellHesion عند بدء تشغيل البرنامج.
    4. جبل cantilever على كتلة زجاجية وجبل كتلة على الرأس. وضع قطرة من عدد قليل من ميكرولتر من المياه فائقة النقاء على طرف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء عندما يتم غمس غيض في الماء.
    5. ضع عينة صلبة (الشريحة الزجاجية النظيفة أو الياقوت) وإضافة 30-50 درجة مئوية من الماء النقي.
      ملاحظة: إجراء المعايرة الموضح هنا هو معايرة الاتصال التي تسمى في بعض الأحيان. أولا، يتم إجراء منحنى قوة على سطح صلب ومسطح ومن ثم يتم تسجيل الطيف التذبذب من cantilever متحمس حراريا من أجل حساب ثابت الربيع. توجد بروتوكولات معايرة أخرى وسيتم وصفها بإيجاز في فقرة المناقشة.
    6. وضع الرأس على خشبة المسرح (كن حذرا لرفع المحركات Z عالية بما فيه الكفاية). استخدام الصورة البصرية لوضع الليزر تقريبا على cantilever.
      1. نقل الليزر على طول المحور الرئيسي للcantilever رصد إشارة مجموع على الصمام الضوئي.
        ملاحظة: عند استخدام cantilevers القياسية، يجب الحصول على مبلغ أكبر من 0.5 V.
      2. نقل الليزر على طول الاتجاه الآخر وتعظيم إشارة مجموع من أجل وضع الليزر في منتصف cantilever. وهذا سوف يقلل من الحديث المتبادل بين الانحراف الجانبي والرأسي.
    7. قياس حساسية الانحراف
      ملاحظة: ويقرأ الصمام الضوئي الإزاحة بالليزر ويوفر إشارة في فولت. ولكي تكون قادرة على قياس الانحراف في الوحدة المترية، يجب قياس حساسية الانحراف.
      1. تعيين الصك في الاتصال → قوة مطياف. تعيين setpoint النسبية إلى 2 V، Z طول إلى 0.5 ميكرومتر، وتمديد السرعة إلى 2 ميكرومتر / ثانية (معدل العينة إلى 10000 هرتز) وحدد Z حلقة مغلقة.
      2. افتح مدير المعايرة وحدد جزء الاتصال من منحنى القوة (الذي يجب أن يكون خطيًا) لجعل الاحتواء الخطي: يعطي معكوس المنحدر حساسية الانحراف. يتم الآن معايرة قراءة الصمام الضوئي في وحدة مترية.
    8. تحديد ثابتالربيع. في مدير المعايرة،حدد ثابت الربيع لتشغيل اكتساب الطيف الحراري. لمتوسط الإشارة لفترة أطول، حدد الرمز . قد يظهر طيف الطاقة من cantilever متحمس حراريا عدة قمم; رسم مجموعة مختارة حول واحد وضعت في أدنى تردد لتناسب ذلك.
      ملاحظة: إذا تم تنفيذ اللحن الحراري في السائل، فإن ذروة الرنين تكون أوسع وترددها خفضت بالمقارنة مع واحد الاسمية.
  3. إعداد تجربة التحليل الطيفي للقوة واكتسابها
    1. وضع العينة على مرحلة AFM ووضع الرأس فوق العينة.
      ملاحظة: تأكد من أن الرأس قد تراجع بما فيه الكفاية لتجنب اتصال الثابت بين الطرف وسطح العينة.
    2. دع الكانتيلفير يُهمر ّ لبضع دقائق.
    3. في وضع QI، نهج مع قوة Setpoint من 50 nN.
    4. تعيين طول Z من 4 ميكرومتر ومنطقة المسح الضوئي إلى 80 × 80 ميكرومتر2 مع عدد من بكسل من 40 × 40. في لوحة إعدادات التصوير المتقدمة، قم بتعيين الوضع إلى سرعة ثابتة. قم بتعيين سرعة التمدد والتراجع إلى 200 درجة مئوية/ثانية ومعدلات العينة إلى 25 كيلوهرتز.
    5. ابدأ المسح الضوئي واستخدم هذا المسح السريع المنخفض القوة للتحقق مما إذا كانت العينة تتحرك. تحقق من أن المنطقة الممسوحة ضوئيًا خالية من الحطام أو الخلايا المنحرفة وتحديد موقع منطقة ذات أهمية ممكنة لإجراء القياسات.
      ملاحظة: من أجل تقدير الميل عينة حقيقية، يجب تعيين تسوية خط إلى إيقاف أو إلى ثابت. زاوية الميل المفرط بين محور المسافة البادئة والسطح سيكون لها تأثير على معامل الشباب قياس5.
    6. بمجرد تحديد موقع منطقة اهتمام، حدد منطقة من 40 × 40 إلى 60 × 60 ميكرومتر2 حولها وزيادة عدد بكسل لتصل إلى 2 بكسل / ميكرومتر. ضبط هذه القيمة، إذا لزم الأمر، في بداية التجربة. تقليل طول Z إلى 2 ميكرومتر.
    7. بدء المسح الضوئي وحفظ الإخراج (يتكون بشكل عام من صورة وملف بيانات).
    8. في نهاية يوم القياس، قم بإزالة حامل الطرف واشطفه بلطف بالماء النقي و70% EtOH.
    9. تجفيف وإزالة العلبة. لمزيد من التجارب مع نفس الطرف، والنظر في تنظيفه مع بروتوكول التنظيف الرطب، وإذا كان ذلك ممكنا، متابعة البلازما O2 العلاج. لا تدع الماء يجف على الكانتيلف و / أو حامل طرف لتجنب تبلور الملح.
  4. تحليل البيانات (لإصدار برنامج معالجة البيانات 6.x)
    1. افتح برنامج معالجة البيانات واحمّل ملف البيانات.
    2. انقر على استخدام هذه الخريطة لزر معالجة الدفعات من أجل استخدام نفس معلمات التحليل على جميع منحنيات الخريطة.
    3. في عملية التحميل المعرفة مسبقًا، حدد Hertz fit.
    4. استخدم علامة التبويب الأولى للتحقق من معلمات المعايرة أو تغييرها.
    5. في علامة التبويب الثانية، قم بإزالة إزاحة (أو إزاحة بالإضافة إلى إمالة) من الأساس لتعيين متوسط القيمة إلى 0.
    6. في علامة التبويب الثالثة، قم بتقدير موضع نقطة الاتصال (POC) من خلال اعتبارها النقطة الأولى التي تعبر القوة 0 عند النزول من قيمة نقطة البداية على طول منحنى التمدد.
    7. يقوم موضع الطرف العمودي بحساب حركة التعام عن طريق طرح انحراف الكانتليفيمن عن الارتفاع المقاس. في هذه الخطوة، استخدم الارتفاع غير الملساء (البيانات الخام) للاحتواء التالي، عن طريق التحقق من خانة الاختيار المقابلة.
    8. في علامة التبويب تناسب المرونة، حدد نموذج الملاءمة المناسب. إذا لم يكن التصاق أو ضعيف مرئيعلى منحنيات التراجع (المقابلة لأقل من 10% من قوة نقطة الضبط أو الحد الأقصى لمتوسط القوة في عمق المسافة البادئة المحدد)، يجب تعيين نوع الطراز إلى Hertz/Sneddon ويجب استخدام منحنى التمدد. في حالة التصاق أقوى، يجب تفضيل نموذج DMT، الذي يرمز إلى نموذج Derjaguin-Muller-Toporov، وينبغي أن يؤديها تناسب على منحنيات التراجع (راجع دليل للحصول على تفاصيل حول نماذج الاتصال المتاحة والصيغ ذات الصلة).
      1. تعيين المعلمات الهندسية تلميح على أساس شكل تلميح الاسمية. هنا، شكل تلميح هو المجال وتلميح نصف قطرها هو 400 نانومتر.
      2. تعيين نسبة بواسون إلى 0.5 كما يتم ذلك تقليديا للمواد البيولوجية (المقابلة للمواد غير قابلة للضغط).
    9. احتواء المسافة البادئة المحددة. بشكل افتراضي، يتم تنفيذ الاحتواء عبر المنحنى بأكمله. إذا كان يجب أن يتم الاحتواء حتى مسافة بادئة معينة، فتحقق أولاً من خانة الاختيار Shift Curve; سيؤدي ذلك إلى تحويل أصل المنحنى استنادًا إلى قيم خط الأساس وPOC المحددة حديثًا.
      1. إضافة روتين مرونة الثاني تناسب عن طريق النقر على أيقونة على النافذة الرئيسية.
      2. تعيين مرة أخرى كافة المعلمات تناسب وتحديد في X دقيقة المسافة البادئة المطلوبة. إضافة العديد من الخطوات اللازمة (2 إلى 3 خطوات ينبغي أن تكون كافية) من أجل صقل تحديد موقف POC وبعد ذلك عمق المسافة البادئة المحسوبة. يمكن حفظ العملية عند هذه النقطة.
    10. انقر على الاحتفاظ وتنطبق على الجميع لتكرار الخطوات السابقة على جميع منحنيات الخريطة.
    11. حفظ النتائج. سيتم الحصول على صورة وملفات .tsv.

2. قياس الضغط التورغور

ملاحظة: يتم تقديم مثال على الإزهار الذي يعالج من الأوريزالين من أرابيدوبسي.

  1. إعداد عينة بيولوجية
    1. جمع الإزهار العربي (IM) تعامل مع microtubule depolymerizing المخدرات oryzalin من النباتات في المختبر نمت على المتوسطة التي تحتوي على مثبطات نقل أوكسين القطبية 1-N-Naphthylphthalamic حمض (NPA) بعد طريقة نشرت 6.
    2. تركيب عينة IM بعد أحد الخيارين
      1. للرصد على المدى الطويل: قم بتركيب العينة في طبق بيتري يحتوي على ثقافة أرابيدوبسي قمة متوسطة (ACM)7و8 و 0.1% خليط الحفاظ على النباتات (PPM)، لمنع التلوث. تعليق طرف IM فوق سطح ACM ودعم قاعدة IM مع انخفاض من 2٪ agarose.
      2. للقياس مع التغيرات الحل السريع: جبل العينة في طبق بيتري عقد قطعة صغيرة من المصطكي لاصقة، وختم بسرعة الفجوة بين المصطكي وقاعدة العينة مع الغراء الحيوي متوافق. انتظر الغراء لتترسخ (أقل من 2 دقيقة)، ثم غمر العينة في ACM السائل الذي يحتوي على 0.1٪ PPM.
        ملاحظة: تأكد من أن سطح العينة غير مغطى بأجاروز أو الغراء عند تحديد قاعدة العينة. يتطلب قياس AFM لضغط التورغور تركيب العينة بشكل كبير، وتوفر أساليب التركيب السابقة استقرارًا مقبولًا. اعتمادا على العينة، يمكن استخدام أساليب التركيب الأخرى، مثل الشريط على الوجهين، بولي يسين، الخ.
  2. معايرة AFM
    1. قم بتشغيل برنامج اكتساب AFM واختر وضع قياس PeakForce QNM (سعة كبيرة).
    2. إجراء المعايرة باتباع نفس المبدأ الموضح في الخطوات من 2.1 إلى 2.6.
    3. في الإطار "التحقق من المعلمات"، قم بتعيين حجم المسح الضوئي إلى 0. في إطار المنحدر، تعيين حجم المنحدر بين 200 نانومتر و 500 نانومتر، عتبة Trig بين 2 V و 5 V وعدد العينات إلى 2048 أو أعلى.
    4. قم بمحاذاة طرف الكانتيلفير مع عينة المعايرة وانقر على نهج.
    5. عند الاتصال، انتقل إلى نافذة المنحدر وانقر على زر المنحدر المستمر. على النظام الخطي للمنحنى، حدد الميل بالنقر فوق الزر تحديث الحساسية. كرر قياس حساسية الانحراف عدة مرات وتحديث المعايرة يدويًا بمتوسط القياس عن طريق فتح كاشف الجدولة من معايرةالقائمة .
    6. سحب رأس AFM وإزالة عينة المعايرة.
      ملاحظة: ويقترح لسحب تماما رئيس AFM عن طريق اختيار علامة التبويب المرحلة → تهيئة لمنع الاتصال الثابت عرضي على تغيير العينة.
  3. إعداد تجربة التحليل الطيفي للقوة واكتسابها
    1. إذا لم يتم غمر العينة حتى الآن، غمرها مع ACM السائل الذي يحتوي على PPM.
    2. في برنامج الاقتناء، حدد معلمات القياس على النحو التالي:
      1. في نافذة المعلمة Check، قم بتعيين ثابت الربيع إلى ثابت الربيع المصنع في cantilever أو ثابت الربيع المحدد كما هو الحال في الخطوة 2.8. في هذا المثال، يتم تعيينه في 42 N/m.
      2. تعيين دائرة نصف قطر تلميح إلى 400 نانومتر في هذا المثال.
      3. تعيين نسبة بواسون عينة إلى 0.5، منذ الماء يساهم أساسا في ضغط التعكر.
      4. تعيين عينة / خط إلى 128 لضمان اكتساب سريع.
      5. تعيين معدل المسح الضوئي إلى 0.2 هرتز.
      6. تعيين حجم المسح الضوئي إلى 1 ميكرومتر.
        ملاحظة: قد يؤدي تعيين معدل المسح الضوئي وحجم المسح الضوئي الصغير إلى منع تلف العينة الذي يتم تشغيله بالمسح الضوئي AFM بشكل فعال. من المستحسن تقليل هذه المعلمات اثنين على أي تغيير عينة.
      7. في نافذة المنحدر، تعيين حجم المنحدر إلى 5 ميكرومتر.
        ملاحظة: فمن الأفضل وضع حجم المنحدر أكبر من عمق المسافة البادئة المقصود للحصول على خط الأساس أفضل.
      8. تعيين عتبة Trig إلى أقصى حد.
      9. تعيين عدد العينات إلى 4608.
      10. اختياريا، في المجهر → علامة التبويب معلمات المشاركة، والحد من المعلمات التالية لمنع ضرر عينة قوية الناجمة عن الاتصال. تعيين نقطة تعيين مشاركة قوة الذروة إلى 0.3 V (الافتراضي 0.5 V). تعيين كسب المشاركة int. إلى 0.5 (الافتراضي 0.75). تعيين SPM خطوة إشراك إلى 4 ميكرومتر (الافتراضي 15 ميكرومتر).
    3. وضع ومحاذاة العينة تحت رأس AFM، ونهج حتى يتم غمر cantilever ولكن ليس في اتصال مع سطح العينة.
      ملاحظة: أثناء الاقتراب، ضربة طفيفة على سطح السائل ACM حتى يتم تشكيل جسر سائل بين cantilever والسطح السائل. هذا عادة ما يمنع الاتصال الثابت.
    4. مع الرعاية، نهج يدويا نحو العينة. عندما يكون المسبار قريبًا نسبيًا من سطح العينة، انقر فوق نهج.
    5. عند الاتصال، قم بزيادة حجم المسح الضوئي و/أو معدل المسح الضوئي تدريجيًا حتى يتم تحقيق التوازن المطلوب دون الإضرار بالعينة و/أو العلبة.
      ملاحظة: يقتصر حجم المسح الضوئي من خلال انحناء السطح وخشونة العينة. في حالة IM المعالجة أوريزالين، يمكن تحقيق 50 × 50 ميكرومتر2 منطقة المسح الضوئي مع معدل المسح الضوئي من 0.3 هرتز.
    6. أثناء المسح الضوئي، حدد ما إذا كانت منطقة القياس على النحو المطلوب. نقل إذا لزم الأمر. عندما راض، انقر فوق زر نقطة واطلاق النار لبدء نقطة واطلاق النار نافذة.
    7. قبل تسجيل الفحص، اختر قناة صورة مناسبة قد تسهل التعرف الواضح على ملامح الخلية. في كثير من الأحيان، خطأ قوة الذروة، DMT معامل، LogDMT معامل أو تبديد هو مناسب. حدد حفظ الدليل واسم الملف. ثم انقر فوق منحدر على المسح الضوئي المقبل لبدء التسجيل.
      ملاحظة: سيتم إضافة سلسلة من نقطة وثلاثة أرقام تلقائياً بعد اسم الملف المعين (مثل .000). يزيد هذا الرقم تلقائيًا بمقدار 1 عند كل تكرار مسح محفوظ.
    8. عند اكتمال الفحص، سيتم إعادة توجيه واجهة البرنامج تلقائيًا إلى نافذة Ramp. انقر على الصورة الممسوحة ضوئيًا لتحديد المواضع التي يتم تحديدمسافة بادئة.
      ملاحظة: قبل تسجيل المسافات البادئة، فمن الأفضل اختيار العديد من المعالم لتنفيذ المسافات البادئة اختبار عن طريق النقر على منحدرفقط، في حالة مطلوب التناوب المعلمة (لحجم المنحدر، موقفبيزو، الخ). يجب أن يكون عمق المسافة البادئة أكبر من سمك جدار الخلية (يتم تحديده بشكل مثالي بشكل منفصل عن طريق الفحص المجهري للإلكترون).
    9. اختر ثلاثة مواقع مسافة بادئة على الأقل لكل خلية بالقرب من مركز المسافات الخارجية، وكرر المسافة البادئة ثلاث مرات لكل موقع. ومن شأن ذلك أن يسفر عن تسعة منحنيات قوة على الأقل لكل خلية لإجراء مزيد من التحليل. عندما يكون راضيا عن وضع موقع المسافة البادئة، انقر فوق منحدر والتقاط. يتم حفظ منحنيات المسافة البادئة force تلقائياً إلى الدليل المعين.
    10. عند اكتمال المنحدرات، انتقل إلى موضع مختلف لقياس التجانب، أو اسحب رأس المسح الضوئي وتغيير العينة.
    11. عند الانتهاء، تنظيف cantilever كما هو الحال في الخطوتين 1.3.8 و 1.3.9.
  4. تحليل البيانات
    1. في برنامج التحليل، افتح الملف *.mca. يوضح هذا موضع كل منحنى قوة على الصورة الممسوحة ضوئيًا. إذا رغبت في ذلك، حدد قبل منحنيات القوة للتحليل.
    2. فتح منحنى قوة واحد لتحليلها، عادة في شكل x0000y.00z، حيث x هو اسم الملف المحدد في دليل الحفظ بينما y و z يتم تسجيل أرقام تلقائياً تدل على تسلسل المسافة البادئة ورقم المسح الضوئي.
    3. انقر فوق الزر تصحيح الأساس واسحب خطوط الاندفاع الزرقاء على منحنى القوة حتى يتم توسيع بدء خط الأساس المصدر وإيقاف خط الأساس الموسع بنسبة 0% و80%، على التوالي. انقر فوق تنفيذ.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، قد يتم تعيين "إيقاف أساس المصدر الموسع" في قيم مختلفة طالما أنه لا يزال ضمن الأساس وليس خارج نقطة الاتصال.
    4. انقر فوق الزر عامل تصفية Boxcar ثم انقر فوق تنفيذ لمنحنى قوة ناعمة.
    5. انقر فوق الزر المسافة البادئة.
      1. في إطار الإدخال، قم بتعيين المنحنى النشط لتوسيع .
      2. تعيين أسلوب الملاءمة إلى نموذج خطي وتضمين قوة التصاق إلى نعم.
      3. تعيين الحد الأقصى للقوة صالح إلى 99٪ والحد الأدنى قوة صالح إلى 75٪.
      4. تعيين نموذج تناسب صلابة (خطي).
        ملاحظة: هذا الإعداد سوف يحسب صلابة واضحة ك لخصم ضغط التورغور. في هذا المثال، تعكس حدود الملاءمة صلابة تناسب حوالي 1.5 ميكرومتر عمق المسافة البادئة.
    6. يمكن تحليل منحنيات القوة دفعة واحدة. انقر فوق الزر تشغيل المحفوظات، وحدد دليل التقرير وإضافة كافة منحنيات القوة الأخرى التي تتطلب نفس المعاملة. عندما يكون راضياً، انقر فوق تشغيل. بشكل افتراضي، سيتم تخزين الاحتواء كملف *.txt.
    7. عند تركيب مجموعة k، انقر فوق المحفوظات → 5 المسافة البادئة للعودة إلى إطار المسافة البادئة.
      1. تغيير الحد الأقصى للقوة تناسب إلى 10٪ والحد الأدنى صالح القوة إلى 0٪.
      2. تعيين نموذج صالح إلى هرتزيان (كروية).
        ملاحظة: هذا سوف يحسب جدار الخلية الشباب معامل E لخصم الضغط التورغور. في هذا المثال، تعكس حدود الملاءمة تناسب هرتزيان (باستخدام مسبار كروي) من حوالي 0.4 ميكرومتر عمق المسافة البادئة.
    8. كرر الخطوة 2.4.6 للدفعة تناسب E.
    9. افتح الملف *.00z (z هو رقم الفحص المسجل تلقائيًا) لعرض قنوات المسح الضوئي المختلفة. في إطار قناة الارتفاع، انقر فوق زر المقطع. وهذا سيسمح بقياس انحناء سطح العينة المطلوب لخصم ضغط التورم.
      1. ارسم خطًا عبر المحور الطويل لخلية واحدة، وحرّك حدود خط شرطة إلى حواف الخلية، وسجل قيمة نصف القطر r1. كرر هذا للمحور القصير لاسترداد نصف قطر r2. حساب سطح الخلية يعني انحناء M وانحناء غاوسي ة G باستخدام قياس الراديواثنين على النحو التالي:
        Equation 1وEquation 2 
    10. استنتاج ضغط التورغور P باستخدام نموذج رقيقة قذيفة نشرت9 على النحو التالي:
      Equation 3 
      مع
      Equation 4
      حيث t هو سمك جدار الخلية التي يحددها على سبيل المثال المجهر الإلكتروني.
      ملاحظة: خصم ضغط التورغور هو عملية ملائمة، حيث التكرارات مطلوبة. أربعة تكرارات عموما قادرة على إعادة إنتاج منتج مستقر، ولكن يمكن القيام بالمزيد من التكرارات (على سبيل المثال 100 مرة).
    11. حساب متوسط Eو k و P لكل خلية. أيضاً، قم بتسجيل التباين داخل الخلايا (مثل الانحراف المعياري) للوثائق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1ألف والشكل 1باء لقطة شاشة توضح نتيجة الخطوات 1-3-4 إلى 1-3-6 من البروتوكول، المستخدمة لتحديد موقع منطقة ذات أهمية يمكن فيها الحصول على خريطة QI. ومن الجدير بالذكر أنه قد تم اختيار المنطقة ذات الأهمية لكي لا تكون على سطح مائل (أي مسطحة قدر الإمكان). في الواقع، كما لاحظ روتييه وآخرون5،إذا كان محور المسافة البادئة ليست عمودية على السطح، يمكن التقليل من معامل الشباب قياس. يظهر هذا التأثير في الزاوية العلوية اليمنى من لوحات C أو D من الشكل 1، حيث يبدو جزء من حدود الخلايا أكثر ليونة من بقية الخلية. والمصنوعات اليدوية الناجمة عن هذا التأثير ستكون أقوى بكثير في حالة ميريينبع، حيث زاوية الميل المحلية يمكن التغلب بسهولة 40 درجة على 50 × 50 ميكرومتر2 مناطق المسح الضوئي. في مختبرنا، ونحن نعمل حاليا على تطوير خوارزمية، استناداإلى النهج الذي وصفه Routier وآخرون 5، لتصحيح تلك القطع الأثرية (ورقة قيد الإعداد). ويبين الشكل 1 جيم والشكل 1دال خرائط معامل يونغ التي تم الحصول عليها بعد التحليل المفصل في الفقرة الرابعة من البروتوكول. على وجه الخصوص، يمثل الفريق C معامل الشباب التي تم الحصول عليها لتحليل المسافة البادئة بأكملها، حتى نقطة تحديد القوة المعرفة من قبل المستخدم، في حين يظهر الفريق D نتيجة تحليل أول 100 نانومتر من المسافة البادئة (كما هو موضح في الخطوة 1.4.9). هنا، تبدو الخرائط 2 مشابهة للغاية، لأنه خلال إعداد التجربة، تم اختيار نقطة الضبط من أجل الحصول على متوسط المسافات البادئة حول 100 نانومتر. يمكن أن يؤدي اختلاف المسافة البادئة التي تم تحليلها في بعض الأحيان إلى تسليط الضوء بشكل أفضل على تباينات العينة، التي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد الموقع أو لتوفير معلومات عن سلوك الهياكل الداخلية (على سبيل المثال، Costa et al.10)

يظهر منحنى القوة في الشكل 2 تأثيرين جديرين بالذكر. أولاوقبل كل شيء، يمكن ملاحظة أنه إذا كان جزء النهج من منحنى القوة ينتهي في الواقع في قوة نقطة البداية من 500 nN، وحركة تلميح الهبوط يطول، وهذا يعني أن القوة النهائية المطبقة من قبل طرف أعلى من المتوقع (هنا 1000 nN). ويرجع ذلك إلى حقيقة أن حلقة التغذية المرتدة رصد انحراف cantilever لا تعمل على الفور، وبالتالي فإن وقت رد الفعل المحدود يقدم فارقا بين الكشف عن عتبة الانحراف ووقف حركة بيزو. وعلاوة على ذلك، وخاصة عند استخدام CellHesion الذي يتحرك حامل العينة، والقصور الذاتي من الأجزاء المتحركة يأتي في اللعب، مما يجعل هذا الوقت تأخر أطول. يمكن أن تكون هذه المشكلة محدودة باستخدام بيزو الرأس، وفي هذه الحالة يجب على المستخدم أن يكون حذرا حقا في حالة القياسات على عينات خشنة جدا أو مائلة، أو عن طريق الحد من سرعة المنحدر، والتي تحد على أي حال من القرار و / أو عدد العينات الممسوحة ضوئيا ( وعلاوة على ذلك لخرائط بطيئة جدا، يمكن أن تصبح عينة متزايدة مشكلة). بشكل عام، إذا كانت منحنيات القوة بعيدة بما فيه الكفاية عن بعضها البعض (استنادًا إلى نموذج المسافة البادئة المفضل، يمكن حساب نصف قطر المنطقة البادئة نظراً لعمق المسافة البادئة واستخدامها كمسافة فصل دنيا)، فإن القياسات التي يتم إجراؤها في مختلف لا ينبغي أن تكون المواقف على طول العينة مترابطة، وإذا تم إجراء التحليل على منحنى النهج، يجب ألا يكون التغلب على عتبة القوة مشكلة. على أي حال، إذا كانت العينة حساسة أو إذا تم إجراء عمليات مسح متكررة في نفس المنطقة، قد يرغب العالم في محاولة لتقليل هذا التجاوز. لسوء الحظ، ليس هناك قاعدة الإبهام لتحديد كمية هذا التجاوز، لأنه يعتمد على بيزو المستخدمة، على سرعات المنحدر، ولكن أيضا على خصائص المواد: أكثر صلابة المواد، وأسرع الاختلاف من إشارة انحراف في الوقت المناسب و ، نظراً لوقت استجابة ردود الفعل محدودة، كلما كان أعلى من التجاوز.

الشيء الثاني أن نلاحظ هو التلويح على منحنى تراجع أبرزها القطع الناقص. مثل هذا التلويح يمكن أن يكون مؤشرا على عينة تتحرك / تهتز تحت عمل طرف. في هذه الحالة، يمكن للمستخدم محاولة تغيير المنطقة الممسوحة ضوئيا (في بعض الأحيان جزء آخر من المجهر ولكن تلميح يمكن أن تلمس العينة، أو يمكن أن تكون العينة ثابتة بشكل جيد بما فيه الكفاية لدعمها) أو العينة إذا تم إعداد العديد منهم على نفس الدعم. إذا كانت الميزة موجودة دائماً، فمن الأفضل تغيير طريقة التثبيت، في هذه الحالة التبديل من تثبيت الشريط على الوجهين إلى الغراء المتوافقة بيولوجياً.

ويبين الشكل 3 تحديد البارامترات الرئيسية لخصم ضغط التورغور. كل معلمة، باستثناء سمك جدار الخلية11 التي تم تحديدها بشكل منفصل عن طريق المجهر الإلكتروني لتكون ~ 740 نانومتر، يمكن استردادها من عمليات المسح AFM والمسافات البادئة. بعد عملية التركيب في الخطوة 2.4.10، يتم استنتاج ضغط التورغور أن يكون 1.50 MPa لمنحنى القوة هذا. تجميع جميع منحنيات القوة الثمانية عشر في هذه الخلية ينتج متوسط القيم E = 6.77 ± 1.02 MPa، ك = 14.18 ± 2.45 N / m و P = 1.45 ± 0.29 MPa (متوسط ± الانحراف المعياري).

Figure 1
الشكل 1 خرائط الطوبوغرافيا (قياس الارتفاع) التي يتم الحصول عليها عادة ً أثناء التجربة. (أ) يتم تسجيل أول خريطة منخفضة الدقة/منخفضة القوة للعثور على منطقة مناسبة للمسح الضوئي. (ب) يتم الحصول على خريطة أصغر عالية الدقة / أعلى قوة لحساب معامل يونغ (على المنطقة التي أبرزها مربع منقط الأسود). (C) خرائط معامل يونغ المحسوبة من خريطة B، كما هو مفصل في الخطوة 1.4. هنا، تم الحصول على خريطة معامل الشباب تحليل المسافة البادئة كاملة على كل منحنى القوة. (D) حصلت خريطة معامل يونغ تحليل فقط أول 100 نانومتر من المسافة البادئة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 مثال على منحنى القوة. باللون الأزرق النهج، باللون الأحمر الجزء تراجع. القوة القصوى (تقع على منحنى تراجع) يختلف عن نقطة محددة القوة بسبب محدودة ردود الفعل حلقة وقت رد الفعل وبسبب القصور الذاتي. التلويح في منحنى تراجع يمكن أن تكون ممثلة لنقص في تثبيت عينة لدعمها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 قياسات AFM لخصم ضغط التورغور. (A) DMT مودلووس خريطة يظهر محيط الخلية واضحة للإشراف على تحديد المواقع المسافة البادئة العميقة بالقرب من barycenter الخلية. يتم وضع علامة على مواقع المسافة البادئة بواسطة الصلبان. (ب) منحنى قوة المسافة البادئة العميقة في موقف الصليب الأحمر في A. يتم تركيب جدار الخلية الشباب معامل E (الأخضر) وعينة صلابة واضحة ك (الأحمر) في أنظمة مختلفة من منحنى كما هو مفصل في الخطوة 2.4. صاوة 2 يدل على معامل تحديد يناسب. (C) خريطة الارتفاع مع محاور طويلة وقصيرة محددة يدويا من، يصورها خطوط بيضاء، من نفس الخلية التي تم تحليلها في لوحات A و B. (D) ملف تعريف الارتفاع من المحاور الطويلة والقصيرة للخلية في لوحة C (الأزرق، محور طويل أحمر، محور قصير) وfitte د رادي من انحناء(ص1 و ص2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تحديد ظهور الأشكال في النباتات بشكل رئيسي من خلال معدل منسق واتجاه النمو خلال الزمان والمكان. يتم تغليف الخلايا النباتية في جدار خلية جامدة مصنوعة من مصفوفة polysaccharidic، الذي يلصق لهم معا. ونتيجة لذلك، يتم التحكم في توسيع الخلية من خلال التوازن بين ضغط التورغور سحب على جدار الخلية، وصلابة جدار الخلية مقاومة لهذا الضغط. من أجل فهم الآليات الكامنة وراء التنمية، من المهم أن تكون قادرة على قياس كل من الخصائص الميكانيكية جدار الخلية، فضلا عن ضغط التعكر في أنسجة أو خلايا مختلفة من جهاز معين. وكما هو مبين في هذه الورقة، فإن AFM هي الطريقة المفضلة في هذا السياق.

هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول. الأول هو إعداد الأنسجة التي ينبغي أن تكون سريعة بما فيه الكفاية لتجنب الجفاف. وهذا يمكن أن يكون حاسما على وجه الخصوص إذا كنا نريد قياس الضغط التورغور. مهم جدا هو أيضا تثبيت الصحيح للعينة إلى الركيزة لها: عينة غير مستقرة يمكن أن يؤدي إلى آثار واضحة جدا مثل حركة العيان ية التي يمكن الكشف عنها بسهولة بصريا، أو تشوه قوي من منحنيات القوة. على أي حال، يمكن أن يكون الاهتزاز عينة أو الانحناء خفية للكشف، وإدخال القطع الأثرية في النتائج. وأخيراً، تتعلق خطوة حاسمة أخرى باختيار معلمات المسافة البادئة. وهذا محدد لنوعية النتائج.

عند قياس الخصائص الميكانيكية على مساحات كبيرة (أكثر من 40-50 ميكرومتر أحجام المسح الضوئي)، يمكن أن تكون الاختلافات الارتفاع عالية، مما يجعل من الصعب تتبع سطح بشكل صحيح وتحقيق منحنيات القوة دون الوصول إلى حدود نطاق Z بيزو. للتغلب على هذه المشكلة، تم استخدام وحدة CellHesion. تضيف هذه الوحدة Z بيزو إضافية، وتقع في مرحلة العينة، وجود مجموعة 100 درجة مئوية، والذي يسمح بحيازة مناطق كبيرة دون الاقتراب بشكل خطير من حدود Z بيزو.

الحد الأول من الأسلوب هو أنه يمكننا قياس طبقات الخلايا السطحية فقط. ومع ذلك، فقد استخدم المؤلفون مؤخرا AFM على أقسام الأنسجة12،13،14. على الرغم من أن هذا يجب أن يتم على المواد الثابتة، فإنه يمكن أن تعطي الوصول إلى الخصائص الميكانيكية لطبقات الخلايا العميقة. وبدلاً من ذلك، تم أيضاً إجراء مسافات بادئة أعمق لاستنتاج الخصائص الميكانيكية للأنسجة الداخلية على عينات حية، وإن كان ذلك بتضحية أكبر على القرار المكاني15. يمكن ربط القيد الثاني بهندسة العينة، حيث يمكن أن يكون السطح ذو المنحدر الحاد إشكاليًا نظرًا لأن الطرف لا يكون أكثر عموديًا على العينة. ونحن بحاجة إلى تقييد نطاق الزوايا التي يمكن من خلالها الاعتماد على التدابير، ونحن نطور حاليا خوارزمية لتصحيح القطع الأثرية المحتملة المرتبطة بهذه الظاهرة. أيضا، يتم تغطية بعض الأنسجة مع trichomes التي يمكن أن تمنع القياسات. وأخيراً، يقيس المسافة البادئة الخصائص الميكانيكية في اتجاه عمودي فيما يتعلق بسطح الخلية ويمكننا أن نتساءل عما إذا كان هذا يمكن أن يرتبط بسهولة إلى قابلية التوسيع جدار الخلية المرتبطة بقدرة النمو. العديد من الدراسات تشير إلى أنه هو الحال15،16.

ومن الجدير القيام هنا بملاحظة أعم بشأن قياس/تطبيق القوات من جانب القوات المسلحة الأمجردة. كما هو موضح في قسم البروتوكول، من أجل أن تكون قادرة على تحويل الإزاحة الليزر على الصمام الضوئي إلى القوات، يجب إجراء معايرة. في هذه المعايرة معلمة واحدة، حساسية انحراف، يسمح لتحويل الإزاحة الليزر إلى انحراف cantilever الفعلية (تقاس عموما في نانومتر)، لذلك هذا العامل معايرة الفولتية الناتج photodiode (على طول المحاور العمودية) إلى الإزاحة في نانومتر. العامل الثاني هو ثابت الربيع K، تقاس في N / M، الذي يحول انحرافات عمودية cantilever في وحدات القوة (عموما nN)، منذ cantilevers مرنة تتصرف مثل الينابيع. وحتى إذا كان الإجراء يبدو بسيطاً، فإن المعايرة القوية والقابلة للاستنساخ لK لقياسات مطيافية قوة AFM لا تزال مشكلة، بسبب مصادر خطأ مختلفة يمكن أن تؤثر على الخطوات المختلفة للإجراء. على سبيل المثال، قياس حساسية الانحراف تحقيق منحنى قوة على سطح صلب، يمكن أن يؤدي إلى قيم غير صحيحة إذا كان طرف زلات على السطح، أو إذا لم يتم تنظيف السطح تماما أو أيضا إذا كان شحنة السطح الحث على النفور الكهروستاتيكي. في جميع الحالات السابقة، سيتم تشويه جزء الاتصال من منحنى القوة (مزيد من الميل أو المنحني بدلاً من الخطي).

إجراء الاتصال الموضح في قسم البروتوكول واحد فقط من عدة إجراءات معايرة موجودة. هناك على الأقل 2 طرق أخرى التي يمكن استخدامها بطريقة سهلة نسبيا وغير مكلفة: طريقة سادر (وتسمى أيضا عدم الاتصال عند تنفيذها في بعض البرامج AFM) أو طريقة cantilever المرجع. وقد وضعت في الأصل طريقة سادر17 من قبل جون سادر لcantilevers على شكل V ومن ثم لتلك مستطيلة18 ولا تحتاج إلى الحصول على منحنى قوة على الركيزة قاسية. بدلا من ذلك، يحتاج المستخدم لتحديد (من درجة الحرارة كما هو الحال في طريقة الاتصال)، وطول وعرض cantilever وكثافة ولزوجة السائل حيث كانتيلفيل (عموما الهواء والماء أو السوائل مثل الماء). ثم يتم الحصول على الطيف الحراري ويتم قياس كل من حساسية الانحراف وثابت الربيع. هذه الطريقة مفيدة عند استخدام نصائح حادة جدا أو وظيفية التي قد تكون معطوبة القيام منحنى قوة على الركيزة قاسية.

كلا الأسلوبين السابقين تتعلق بالحصول على طيف التذبذب من cantilever متحمس حراريا. عندما يتم استخدام cantilevers قاسية في درجة حرارة الغرفة، يمكن أن يكون متوسط السعة التذبذب أقل من 0.1 نانومتر، مما يجعل ذروة الرنين أصغر وأكثر صعوبة للكشف. على أي حال، على الأقل لكلا الصكوك المستخدمة في هذه الورقة، يمكن الكشف عن ذروة الرنين في الهواء والماء وتجهيزها لقياس ثابت الربيع (بالنظر إلى أنه عندما يتم القياس في السائل، وتردد الرنين يتحول نحو أقل القيم والذروة تتسع).

طريقة ثالثة لا تستخدم لحن حراري، ولكن بدلا من ذلك كانتيلفير مرجع أو هيكل مرن مرجع، مع ثابت الربيع المعروفة (عموما مع عدم اليقين حول أو أقل من 5٪)، من أجل تحديد Kcantilever . في هذه الحالة يجب الحصول على منحنى القوة الأولى على الركيزة قاسية من أجل قياس حساسية الانحراف (الذي يأتي مرة أخرى جنبا إلى جنب مع جميع القطع الأثرية الممكنة التي تؤثر على شكل منحنى). بعد ذلك استبدلت الركيزة قاسية بالمرجع [كنتليفر] (عموما [تيب-لسّ] [كنتليفر] مع يعاير نابض ثابتة) وآخر (أو قليل من أخرى) قوة يتمّ منحنى, يسجّل ثانية القيمة من الإنحراف حساسية. ثم يتم حساب ثابت الربيع cantilever على النحو التالي:
Equation 5

حيث Kالمرجع هو ثابت الربيع من cantilever المرجع المرجعي، Sالمرجع حساسية انحراف تقاس على ذلك، L هو طوله وS قاسية هو حساسية انحراف تقاس على قاسية الركيزه. ΔL هو الإزاحة بين الطرف ونهاية cantilever المرجع ويعتمد على المحاذاة التي قام بها المستخدم وأخيرا α هو زاوية الميل من cantilever، المحددة من قبل الشركة المصنعة AFM. ويمكن استخدام نفس الطريقة على هياكل مرنة مصممة خصيصا لمعايرة cantilever أو indenter. ميزة تلك الهياكل (التي هي عموما دائرية) هو أن K في مركزها ثابت ولا يعتمد على أي معلمة هندسية أو على تحديد المواقع الدقيقة من طرف AFM عليها، وذلك إزالة L و ΔL من الصيغة السابقة.

يجب على مستخدم AFM أن يضع في اعتباره أن جميع طرق المعايرة هذه تتأثر بمصادر خطأ مختلفة (تحديد حساسية الانحراف في الأول والثالث، واستخدام اللحن الحراري في حالة العلب الشديدة للأولى والثانية والهندسية المعلمات والمحاذاة للثالث وكذلك دقة المعايرة من K المرجع في حالة استخدام cantilever المرجع) وأن أساليب الاتصال يحتمل أن تكون ضارة للتلميح (وخاصة الثالثة، حيث تفرض المعايرة استخدام اثنين عينات مختلفة). وهذا يعني أن ثابت الربيع سوف يتم تحديده دائماً حتى دقة معينة، وهكذا ستكون القوى المقاسة/التطبيقية (انظر Sikora19 للاطلاع على مراجعة شاملة لأساليب المعايرة المختلفة ودقتها. وهذا يعني أن ضغوط معامل وتورغور يونغ سوف تتأثر أيضا بمعايرة الكانتيلفيل. على أي حال، هناك مصادر خطأ أخرى أكثر أهمية تشارك عند حساب تلك الكميات (مثل استخدام نماذج مبسطة لتحديد معامل يونغ) لذلك سيكون دائما تحديا للحصول على القيم المطلقة من هذه الأنواع من القياسات. ما هو مهم هو الحصول على القيم التي هي من الترتيب الصحيح من الحجم ومتماسكة مع بعضها البعض، وهذا يعني أنه إذا تم تكرار التجربة من قبل نفس المستخدم على نفس العينة، يجب أن تكون القيم متوافقة. من أجل الحصول عليه، يجب أن تتم المعايرة بعناية، ويجب تقليل مصادر الخطأ (على سبيل المثال الحد بقدر ما ربما الضوضاء الصوتية / الاهتزازات). وقد اقترحت مؤخرا استراتيجية ممكنة تركز على زيادة اتساق المعايرة المتكررة في ورقة من قبل شيلرز وآخرون20، حيث بفضل التعاون من 11 مختبرات أوروبية ، بروتوكول (يسمى SNAP) للتعويض عن الأخطاء في وقد تم تطوير تحديد حساسية الانحراف. في هذه الورقة يستخدم المؤلفون الكانتيليرس المعايرة مباشرة لقياساتهم، على أي حال يمكن تطبيق نفس البروتوكول على cantilevers غير معايرة، ببساطة معايرة لهم في المرة الأولى مع طريقة الاختيار ومن ثم النظر في الربيع الأول ثابت كمرجع ("معايرة") قيمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونود أن نشكر فريق بلاتيم على دعمه التقني، وكذلك أريزكي بودووأعضاء فريق الفيزياء الحيوية في مختبر RDP لإجراء مناقشات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) Sigma-Aldrich/Merck 132-66-1 add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar Sigma-Aldrich/Merck 9002-18-0 add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose Merck Millipore 9012-36-6 used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium Duchefa Biochimie DU0742.0025 For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich/Merck 13477-34-4 add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM Duchefa Biochimie M0221.0025 Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP) Sigma-Aldrich/Merck 1214-39-7 used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin Sigma-Aldrich/Merck 19044-88-3 for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM) Plant Cell Technology used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide Duchefa Biochimie 1310-58-3 used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose Duchefa Biochimie 57-50-1 used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM Bruker The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion JPK (Bruker) The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix UHU D1620
Reference elasitic structure NanoIdea 2Z00026
Reprorubber-Thin Pour Flexbar 16135 biocompatible glue.
Spherical AFM tips Nanoandmore SD-SPHERE-NCH-S-10 Tips used for measuring mechanical properties.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
  2. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
  3. Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
  4. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  5. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
  6. Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
  7. Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
  8. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
  9. Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
  10. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
  11. Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
  12. Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
  13. Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
  14. Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
  15. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
  16. Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
  17. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
  18. Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
  19. Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
  20. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).

Tags

علم الأحياء التنموية، العدد 149، الخصائص الميكانيكية، الفحص المجهري للقوة الذرية، ضغط التورغور، جدران الخلايا النباتية، المسافة البادئة، معامل يونغ
استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, S., Long, Y., Monéger,… More

Bovio, S., Long, Y., Monéger, F. Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues. J. Vis. Exp. (149), e59674, doi:10.3791/59674 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter