Summary
Здесь мы представляем атомную силовую микроскопию (AFM), функционируют как нано- и микро-индентационный инструмент на клетках и тканях. Прибор позволяет одновременно приобрести 3D-топографию образца и его механические свойства, включая модуль клеточной стенки Янга, а также тургорное давление.
Abstract
Мы представляем здесь использование атомной микроскопии силы для интовенции ткани растений и восстановить его механические свойства. Используя два различных микроскопа в режиме отступа, мы показываем, как измерить упругий модуль и использовать его для оценки механических свойств клеточной стенки. Кроме того, мы также объясняем, как оценить давление тургора. Основные преимущества атомной микроскопии силы в том, что она является неинвазивной, относительно быстрой (5–20 минут) и что практически любой тип живой ткани растений, который поверхностно плоский, может быть проанализирован без необходимости лечения. Разрешение может быть очень хорошим, в зависимости от размера наконечника и от количества измерений на единицу площади. Одним из ограничений этого метода является то, что он дает только прямой доступ к поверхностным слоям клеток.
Introduction
Атомная микроскопия силы (AFM) принадлежит к семейстств микроскопии зонда (SPM), где наконечник с радиусом обычно немного nanometers сканирует поверхность образца. Обнаружение поверхности достигается не оптическими или электронными методами, а силами взаимодействия между кончиком и поверхностью образца. Таким образом, этот метод не ограничивается топографической характеристикой поверхности образца (3D-разрешение, которое может сойти на несколько нанометров), но также позволяет измерять любые типы взаимодействуютных сил, таких как электростатические, ван дер Ваалс или контактные силы. Кроме того, наконечник может быть использован для применения сил на поверхности биологического образца и измерения результирующей деформации, так называемой "отступной", для определения его механических свойств (например, модуля Янга, вискоэлясические свойства).
Механические свойства стенок растительных клеток необходимы для учета при попытке понять механизмы, лежащие в основе процессов развития1,2,3. Действительно, эти свойства жестко контролируются во время развития, в частности, так как размягчение клеточной стенки требуется, чтобы позволить клеткам расти. AFM может быть использован для измерения этих свойств и изучения того, как они меняются между органами, тканями или стадиями развития.
В этой статье мы описываем, как мы используем AFM для измерения как механических свойств стенки клеток, так и давления тургора. Эти два приложения демонстрируются на двух различных микроскопах AFM и подробно описаны здесь после.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.Измерение механических свойств стены клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен пример развивающегося гиноэкиума арабидопсиса.
- Подготовка биологических образцов
- Соберите закрытый цветочный бутон на стадии от 9 до 10 (около 0,5 мм в длину) в соответствии с опубликованными этапами определения для Arabidopsis4. Под бинокль, используя тонкие пинцеты, тщательно откройте бутон, чтобы проверить стадию развития и собрать gynoecium, расположенный в центре цветка.
- Положите gynoecium на двойную боковую ленту, расположенную в центре крышки небольшой чашки Петри (диаметр 5 см).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы биосовместимый клей может также использоваться для более эффективной иммобилизации образца по отступу. - Быстро добавляйте воду до тех пор, пока образец не будет полностью покрыт. Это позволяет избежать обезвоживания и уменьшает прилипание наконечника к образцу. Кроме того, погрузить образец в жидкой среде, таких как Arabidopsis вершины культуры среды5.
- Калибровка AFM
- Установите кантилевер пружины постоянной k достаточно высоко, чтобы деформация поверхности образца до желаемого отступа, но не слишком высока, чтобы избежать потери чувствительности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как грубое эмпирическое правило, если модуля Молодого образца известна, то порядок величины весенней константы может быть выбран в качестве kqE , где q является желаемым отступом. - Используйте R 400 нм сферической кончик с 15 мкм кончик-кантилевер расстояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус наконечника напрямую связан с боковой разрешением. Как правило, для отступов на биологические материалы, выбрать округлые советы (R больше, чем 10-20 нм) или коллоидных зондов. Малые коллоидные зонды могут быть сложно использовать из-за небольшого расстояния между кончиком и кантилевер, который может коснуться поверхности образца. - Включите программное обеспечение и поместите голову горизонтально не менее 2-3 ч перед экспериментом: это позволит головке тепловой и избежать термически индуцированных кантилевер-лазерных относительных движений. Если микроскоп оснащен модулем CellHesion (расширение имеющегося диапазона пьезо до 100 мкм вместо 15 мкм), сначала включите контроллер, а затем выберите режим CellHesion при запуске программного обеспечения.
- Установите кантилевер на стеклянный блок и смонтируйте блок на голове. Поместите капельку нескольких микролитров ультрачистой воды на кончике, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, когда кончик окунается в воду.
- Поместите твердый образец (очищенный стеклянный слайд или сапфир) и добавьте 30-50 л ультрачистой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь процедура калибровки – это иногда называемая контактная калибровка. Во-первых, кривая силы производится на жесткой и плоской поверхности, а затем регистрируется спектр колебаний термически возбужденного кантилевера для расчета весенней константы. Существуют и другие протоколы калибровки, которые будут кратко описаны в обсуждаемом пункте. - Поместите голову на сцену (будьте осторожны, чтобы поднять двигатели достаточно высоко). Используйте оптическое изображение, чтобы примерно поместить лазер на кантилевер.
- Переместите лазер вдоль основной оси кантилевера, отслеживая сигнал суммы на фотодиоде.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стандартных кантилеверов должна быть получена сумма, превышающее 0,5 В. - Переместите лазер в другом направлении и максимизируйте сигнал суммы, чтобы расположить лазер в середине кантилевера. Это позволит свести к минимуму перекрестный разговор между боковой и вертикальной отклонения.
- Переместите лазер вдоль основной оси кантилевера, отслеживая сигнал суммы на фотодиоде.
- Измерение чувствительности отклонения
ПРИМЕЧАНИЕ: Фотодиод считывает лазерное смещение и обеспечивает сигнал в вольтах. Для того, чтобы быть в состоянии измерить отклонение в метрической единице, чувствительность отклонения должна быть измерена.- Установите прибор в контактную спектроскопию силы. Установите относительную точку установки до 2 V, длина до 0,5 мкм, и расширьте скорость до 2 мкм/с (коэффициентвыборки до 10000 Гц) и выберите замкнутый цикл.
- Откройте диспетчер калибровки и выберите контактную часть кривой силы (которая должна быть линейной), чтобы сделать линейную форму: обратная сторона наклона дает чувствительность отклонения. Фотодиодное чтение теперь откалибровано в метрической единице.
-
Определение весенней постоянной. В менеджере калибровкивыберите Констант Spring для запуска приобретения теплового спектра. Чтобы усреднеть сигнал в течение более длительного времени, выберите символ . Спектр мощности термически возбужденного кантилевера может показать несколько пиков; нарисовать выбор вокруг одного размещены на самой низкой частоте, чтобы соответствовать ему.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если тепловая мелодия выполняется в жидкости, то пик резонанса будет шире, а его частота снижена по сравнению с номинальной.
- Установите кантилевер пружины постоянной k достаточно высоко, чтобы деформация поверхности образца до желаемого отступа, но не слишком высока, чтобы избежать потери чувствительности.
- Установка и приобретение эксперимента силовой спектроскопии
- Поместите образец на этапе AFM и поместите голову над образцом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова была убрана достаточно, чтобы избежать жесткого контакта между кончиком и поверхностью образца. - Пусть кантилевер термически в течение нескольких минут.
- В режиме «Я» подход с силой Setpoint 50 nN.
- Установите длину 4 мкм и область сканирования до 80 х 80 мкм2 с числом пикселей 40 х 40. В панели настройки расширенных изображений установите режим на постоянную скорость. Установите скорость расширения и убраны до 200 мкм/с, а пробные ставки до 25 кГц.
- Начните сканирование и используйте это быстрое сканирование с низкой силой для проверки хода образца. Убедитесь, что отсканированная область свободна от мусора или отклоняемых ячеек, и найдите интересуемый регион как можно более плоский для выполнения измерений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы оценить реальный наклон образца, выравнивание линии должно быть установлено на OFF или к постоянному. Чрезмерный угол наклона между оси отступа и поверхностью будет иметьвлияние на измеренный модуля 5. - После того, как область интереса была расположена, выберите область 40 х 40 до 60 х 60 мкм2 вокруг него и увеличить число пикселей, чтобы достичь 2 пикселей / мкм. Увеличьте точку установки до 500 нм, чтобы получить 100-200 нм отступов. При необходимости отрегулируйте это значение в начале эксперимента. Уменьшите длину до 2 мкм. Уменьшите и увеличьте скорость до 100 мкм/с и увеличьте скорость выборки до 50 кГц.
- Начните сканирование и сохраните выход (обычно составленный файлом Изображения и файлом данных).
- В конце дня измерения, удалить наконечник держателя и промыть его осторожно с ультрачистой водой и 70% EtOH.
- Высушите и удалите кантилевер. Для дальнейших экспериментов с тем же наконечником, рассмотреть очистку его с мокрым очистки протокола и, если возможно, последующей плазмы O2 лечения. Не дайте воде высохнуть на кантилевере и/или наконечнике, чтобы избежать кристаллизации соли.
- Поместите образец на этапе AFM и поместите голову над образцом.
- Анализ данных (для версии программного обеспечения обработки данных 6.x)
- Открытое программное обеспечение обработки данных и загрузите файл данных.
- Нажмите на Используйте эту карту для кнопки обработки пакетов, чтобы использовать одни и те же параметры анализа на всех кривых карты.
- В заранее определенном процессе нагрузкивыберите подходят Hertz.
- Используйте первую вкладку для проверки или изменения параметров калибровки.
- Во второй вкладке удалите смещение (или смещение плюс наклон) из базовой линии, чтобы установить его среднее значение до 0.
- В третьей вкладке оцените положение точки контакта (POC), рассматривая ее как первую точку, пересекающую силу 0 при сходе с значения установленной точки по кривой расширения.
- Вкладка Вертикальная позиция наконечника вычисляет движение наконечника путем вычитания отклонения кантилевера от измеренной высоты. На этом этапе используйте Негладную высоту (сырые данные) для следующей подгонки, проверяя соответствующий флажок.
- В вкладке Elasticity подходят, выберите соответствующую модель подходят. Если на кривых втягивания (соответствующем менее чем 10% от силы набора или максимальной средней силе в выбранной глубине отступа нет или слабой адгностии) не отображается или слабая сцепления, то следует установить тип модели на Герц/Снеддон и протянуть кривую. В случае более сильной адгезии, модель DMT, которая выступает за модель Derjaguin-Muller-Toporov, должна быть предпочтительной и подходит для выполнения на кривых втягивания (обратитесь к руководству для получения подробной информации о доступных контактных моделях и связанных с ними формулах).
- Установите геометрические параметры наконечника на основе номинальной формы кончика. Здесь, Совет форма сферы и Совет Радиус составляет 400 нм.
- Установите коэффициент Пуассона до 0,5, как это обычно делается для биологического материала (соответствующего несжимаемым материалам).
-
Подходит до конкретных отступов. По умолчанию пригонка выполняется по всей кривой. Если подгонка должна быть выполнена до определенного отступа, сначала проверьте флажок Shift Curve; это изменит происхождение кривой на основе новых определенных базовых значений и значений POC.
- Добавьте вторую процедуру соответствия упругости, нажав на значок на главном окне.
- Установите еще раз все параметры подгонки и укажите в X мин желаемый отступ. Добавьте столько шагов по мере необходимости (2-3 шага должно быть достаточно) для уточнения определения позиции POC, а затем и расчетной глубины отступа. Процесс может быть сохранен в этой точке.
- Нажмите на Keep и применить ко всем, чтобы итерировать предыдущие шаги на всех кривых карты.
- Сохранить результаты. Изображение и файлы .tsv будут получены.
2. Мера тургорского давления
ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен пример оризалинского соцветия меристем арабидопсиса.
- Подготовка биологического образца
- Соберите Arabidopsis соцветия меристем (IM) лечение с микротубулом деполимеризации препарата оризалин из завода in vitro, выращенного на среде, содержащей полярный ингибитор транспорта auxin 1-N-Naththylphthalamic кислоты (NPA) после опубликованного метода 6.
- Монтаж образца im после одного из двух вариантов
- Для долгосрочного мониторинга: смонтировать образец в чашке Петри, содержащейарабидопсис апект культуры среды (ACM) 7,8 и 0,1% смеси сохранения растений (PPM), для предотвращения загрязнения. Приостановить наконечник чата над поверхностью ACM и поддерживать базу чата с падением 2% агарозы.
- Для измерения с быстрым решением изменения: смонтировать образец в Петри-блюдо проведения небольшой кусок клей мастики, и быстро запечатать разрыв между мастикой и образца базы с био-совместимым клеем. Подождите, пока клей затвердеет (менее 2 мин), затем погрузите образец в жидкий ACM, содержащий 0,1% PPM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что поверхность образца не покрыта агарозой или клеем при фиксации базы образца. Измерение aFM тургорского давления требует стабильного монтажа образца, а предыдущие методы монтажа обеспечивают приемлемую стабильность. В зависимости от образца могут использоваться другие методы монтажа, такие как двусторонняя лента, полилизин и т.д.
- Калибровка AFM
- Включите программное обеспечение для приобретения AFM и выберите режим измерения PeakForce (большая амплитуда).
- Выполните калибровку по тому же принципу, описанному в шагах 2.1 к 2.6.
- В окне параметров проверки установите размер сканирования до 0. В окне Ramp установите размер Ramp между 200 нм и 500 нм, порог Trig между 2 V и 5 V и количество образцов до 2048 или выше.
- Выровняйте кончик кантилевера с образцом калибровки и нажмите Подход.
- При контакте, перейдите к окну Ramp и нажмите кнопку Непрерывный пандус. На линейном режиме кривой определите наклон, нажав на кнопку Чувствительность обновления. Повторите измерение чувствительности отклонения несколько раз и вручную обновите калибровку со средним измерением, открыв детектор вкладки из меню Калибрация.
- Удалите головку AFM и удалите образец калибровки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается полностью отозвать голову AFM, выбрав вкладку Этап инициализации для предотвращения случайного жесткого контакта при изменении образца.
- Установка и приобретение эксперимента силовой спектроскопии
- Если образец еще не погружен, погрузите его с жидким ACM, содержащим PPM.
- В программном обеспечении для приобретения укажите параметры измерения следующим образом:
- В окне параметра Check установите константу Spring к кантилеверской пружинной константе или определенной константе пружины, как в шаге 2.8. В этом примере он установлен на уровне 42 Н/м.
- В этом примере установите радиус наклона до 400 нм.
- Установите соотношение образца Пуассона к 0,5, так как вода вносит в основном тургор давление.
- Установите sample/Line до 128 для обеспечения быстрого приобретения.
- Установите скорость сканирования до 0,2 Гц.
- Установите размер сканирования до 1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка скорости сканирования и размер сканирования небольшой может эффективно предотвратить AFM сканирования сконсированных повреждения образца. Рекомендуется уменьшить эти два параметра при любом изменении образца. - В окне Ramp установите размер Ramp до 5 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше установить размер рампы больше, чем предполагалось глубину отступа для лучшего базового приобретения. - Установите порог Trig до максимума.
- Установить количество образцов до 4608.
- Дополнительно, во вкладке Microscope и Engagement, уменьшите следующие параметры, чтобы предотвратить сильное повреждение образцов, вызванных контактом. Установите пиковую точку force Engage до 0.3 V (по умолчанию 0.5 V). Установить Engage int. увеличение до 0,5 (по умолчанию 0,75). Установите SPM включить шаг до 4 мкм (по умолчанию 15 мкм).
- Поместите и выровняйте образец под головкой AFM, и подход до тех пор, пока кантилевер не будет погружен, но не соприкасается с поверхностью образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: При приближении, слегка удар по поверхности жидкости ACM до жидкого моста образуется между кантилевером и жидкой поверхности. Это обычно предотвращает жесткий контакт. - С осторожностью, вручную подходить к образцу. Когда зонд находится относительно близко к поверхности образца, нажмите Подход.
- При контакте постепенно увеличивайте размер сканирования и/или скорость сканирования до желаемого баланса, не повреждая образец и/или кантилевер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер сканирования ограничен кривизной поверхности и шероховатостью образца. В случае обицалин-обработанный IM, 50 x 50 мкм2 область сканирования может быть достигнута с скоростью сканирования 0,3 Гц. - При сканировании определите, является ли область измерения желаемой. При необходимости переместите. Когда удовлетворены, нажмите кнопку точка и стрелять, чтобы инициировать точку и стрелять окно.
- Перед записью сканирования выберите соответствующий канал изображения, который может облегчить четкое определение контуров клеток. Часто подходит пиковая силовая ошибка, DMT Modulus, LogDMT Modulus или Dissipation. Укажите сохранение каталога и имени файла. Затем нажмите Ramp на следующем сканировании, чтобы начать запись.
ПРИМЕЧАНИЕ: Строка точки и три числа будут автоматически добавлены после вашего назначенного имени файла (например.000). Это число автоматически увеличивается на 1 при каждом сохраненном повторении сканирования. - По завершении сканирования интерфейс программного обеспечения будет автоматически перенаправлен на окно Ramp. Нажмите на отсканированное изображение, чтобы указать позиции на отступ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед записью отступов, лучше выбрать несколько ориентиров для выполнения тестовых отступов, нажав толькоRamp, в случае, если параметр чередования не требуется (для размера Ramp, положение Piezoи т.д.). Глубина отступа должна быть больше толщины клеточной стенки (в идеале определяется отдельно электронной микроскопией передачи). - Выберите по крайней мере три места отступов на ячейку вблизи барицентра и повторите отступы три раза на сайте. Это даст по крайней мере девять кривых силы на ячейку для дальнейшего анализа. При удовлетворенности отступами место размещения, нажмите Ramp и захвата. Кривые отваги силы автоматически сохраняются в назначенном каталоге.
- Когда пандусы будут завершены, переместите в другое положение для измерения плитки, или убирайте сканировать голову и изменять образец.
- После завершения, очистить кантилевер, как в шагах 1.3.8 и 1.3.9.
- Анализ данных
- В программном обеспечении для анализа откройте файл q.mca. Это показывает положение каждой кривой силы на отсканированном изображении. При желании предварительно выберите кривые силы для анализа.
- Откройте одну кривую силы для анализа, как правило, в формате x0000y.00z, где x является указанным именем файла в каталоге сохранения, в то время как y и z автоматически регистрируются числа, обозначающие последовательность отступов и номер сканирования.
- Нажмите кнопку коррекции базовой линии и перетащите синие линии тире на кривой силы до тех пор, пока Extend Source Baseline Start и Extend Source Baseline Stop не будут на уровне 0% и 80% соответственно. Нажмите Выполнить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, extend Source Baseline Stop может быть установлен на разных значениях, если он все еще находится в пределах базовой линии, а не за пределами точки контакта. - Нажмите кнопку Boxcar фильтр и нажмите Выполнить, чтобы сгладить кривую силы.
- Нажмите кнопку Indentation.
- В окне ввода установите активную кривую для расширения.
- Установите метод Fit для линейной модели и включите силы адгезии, чтобы Да.
- Установите Max Force Fit Boundary до 99% и Min Force Fit Boundary до 75%.
- Установите fit Model to Stiffness (линейный).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка будет вычислять очевидной жесткости k для тургора вычета давления. В этом примере границы подгонки отражают припадок жесткости около 1,5 мкм глубины отступов.
- Кривые силы могут быть проанализированы в пакете. Нажмите кнопку Run History, укажите каталог отчетов и добавьте все другие кривые силы, которые требуют такого же обращения. Когда удовлетворены, нажмите Run. По умолчанию пригонка будет храниться в виде файла q.txt.
- Когда пакет k установлен, нажмите История 5 отступов, чтобы вернуться в окно отступа.
- Измените максимальную границу fit Force до 10% и Min Force Fit Boundary до 0%.
- Установите Fit Model для Hertzian (Сферический).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит вычислить модуля клеточной стенки Янга E для вычета давления тургора. В этом примере границы подгонки отражают герцианский подходят (с помощью сферического зонда) глубины около 0,4 мкм отступа.
- Повторите шаг 2.4.6 для партии, пригодной для E.
- Откройте файл q.00z (z является автоматически зарегистрированным номером сканирования) для отображения различных каналов сканирования. В окне канала Высота щелкните кнопку раздела. Это позволит измерять кривизну поверхности образца, которая необходима для вычета давления тургора.
- Нарисуйте линию по длинной оси одной ячейки, переместите границы линии тире к краям ячейки и запишите значение Радиуса r1. Повторите это для короткой оси, чтобы получить радиус r2. Рассчитайте поверхность ячейки, среднее кривизну М и гауссианской кривизны G с помощью измерения двух радиусов следующим образом:
И
- Нарисуйте линию по длинной оси одной ячейки, переместите границы линии тире к краям ячейки и запишите значение Радиуса r1. Повторите это для короткой оси, чтобы получить радиус r2. Рассчитайте поверхность ячейки, среднее кривизну М и гауссианской кривизны G с помощью измерения двух радиусов следующим образом:
- Вывод тургор давления P с помощью тонкой оболочки модели опубликовано9 следующим образом:
С
где толщина клеточной стенки определяется, например, электронной микроскопией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вычет тургорского давления является подходящим процессом, где требуются итерации. Четыре итерации, как правило, способны воспроизвести стабильный продукт, однако можно сделать больше итераций (например, 100 раз). - Рассчитайте среднее e, k и P на ячейку. Также зарегистрируйте внутриклеточную изменчивость (например, стандартное отклонение) для документации.
И
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1A и рисунке 1B показан скриншот, иллюстрирующие результат шагов от 1.3.4 до 1.3.6 протокола, используемого для определения региона, интересующего, где можно приобрести карту QI. Следует отметить, что интересующий регион был выбран для того, чтобы не быть на наклонной поверхности (т.е. как можно более плоской). На самом деле, как заметил Routier et al.5, если ось отступа не перпендикулярно поверхности, измеренный модуля Янга можно недооценивать. Этот эффект виден в правом верхнем углу C или D панелей нарисунке 1, где часть границы клеток выглядит мягче, чем остальная часть ячейки. Артефакты, индуцированные этим эффектом, будут гораздо сильнее в случае меристемов, где локальный угол наклона может легко преодолеть 40 х 50 мкм2 области сканирования. В нашей лаборатории, мы в настоящее время разрабатываем алгоритм, основанный на подходе, описанном Routier и др.5, чтобы исправить эти артефакты (бумага в подготовке). На рисунке 1С и рисунке 1D показаны карты модуля Янга, полученные после анализа, подробно описанного в четвертом абзаце протокола. В частности, панель C представляет модули Янг, полученные анализа всего отступа, вплоть до пользовательской определенной точки силы, в то время как панель D показывает результат анализа первых 100 нм отступов (как описано в шаге 1.4.9). Здесь 2 карты выглядят очень похожими, потому что во время установки эксперимента, точка набора была выбрана для того, чтобы получить средние отступы около 100 нм. Вариации проанализированных отступов иногда могут привести к лучшему выделению неоднородности выборки, что может быть полезно для определения местоположения или для предоставления информации о поведении внутренних структур (например, Costa et al.10)
Кривая силы на рисунке 2 показывает два эффекта, которые стоит упомянуть. Прежде всего, можно заметить, что если приблизительная часть кривой силы на самом деле заканчивается на установленной силе 500 nN, то движение нисходящего наконечника продолжает идти, то есть окончательная сила, применяемая наконечником, выше, чем ожидалось (здесь 1000 nN). Это связано с тем, что цикл обратной связи мониторинга отклонения кантилевера не действует мгновенно, так что его конечное время реакции вводит запаздывание между отклонением обнаружения порога и пьезо движения остановки. Кроме того, особенно при использовании CellHesion, которая перемещает образец держателя, инерция движущихся частей вступает в игру, что делает этот временной лаг больше. Эта проблема может быть ограничена с помощью головы пьезо, и в этом случае пользователь должен быть очень осторожным в случае измерений на очень грубых или наклонных образцов, или за счет снижения скорости рампы, которая в любом случае ограничивает разрешение и / или количество сканированных образцов ( кроме того, для слишком медленных карт, рост выборки может стать проблемой). Как правило, если кривые силы находятся достаточно далеко друг от друга (на основе модели отступов выбора, радиус отступной области может быть рассчитан с учетом глубины отступа и используется в качестве минимального расстояния разделения), измерения выполняются в различных позиции в выборке не должны быть коррелированы, и если анализ выполняется на кривой подхода, преодоление порога силы не должно быть проблемой. Во всяком случае, если образец деликатный или если повторные сканирование делается на той же области, ученый может захотеть, чтобы попытаться свести к минимуму это превышение. К сожалению, нет эмпирических правил, чтобы определить количество этого превышения, так как это зависит от пьезо используется, на рампе скорости, но и от материальных свойств: жестче материала, тем быстрее изменение отклонения сигнала во времени и , учитывая конечное время отклика обратной связи, тем выше превышение.
Вторая вещь, чтобы заметить, это размахивая на втягивание кривой выделены эллипса. Такая размахивая может быть индикатором движения/вибрации образца под действием наконечника. В этом случае пользователь может попытаться изменить отсканированную область (иногда другая часть микроскопа, но наконечник может коснуться образца, или образец может быть недостаточно хорошо закреплен на его поддержке) или образец, если некоторые из них были подготовлены на той же поддержке. Если функция всегда есть, то лучше изменить метод фиксации, в этом случае переход от двусторонней фиксации ленты к биосовместимым клеям.
На рисунке 3 показано определение ключевых параметров для вычета тургорского давления. Каждый параметр, за исключением толщины клеточной стенки11, которая была отдельно определена электронной микроскопией, которая составляет 740 нм, может быть извлечен из aFM-сканов и отступов. После процесса установки в шаге 2.4.10, давление тургора выведено как 1.50 MPa для этой кривой усилия. Объединение всех восемнадцати кривых сил в этой ячейке дает средние значения E 6,77 и 1,02 МПа, k 14.18 и 2.45 N/m и P 1.45 и 0.29 MPa (среднее - стандартное отклонение).
Рисунок 1 : Топография карты (Высота измеряется), как правило, приобретенные в ходе эксперимента. (A) Первая карта низкого разрешения/низкой силы записывается, чтобы найти подходящую область для сканирования. (B) Для расчета модуля Янга (на площади, выделенной черным пунктирным квадратом), приобретается карта с меньшим высоким разрешением/более высокой силой). (C) Карты модуля Янграссчитывает рассчитывается из B карты, как подробно в шаге 1.4. Здесь была получена карта модуля Янга, анализирующая весь отступ на каждой кривой силы. (D) Модуля карты Янг получил анализа только первые 100 нм отступов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Пример кривой силы. В синем подходе, красным цветом сегмент аттрактор. Максимальный объем (расположенный на кривой втягивания) отличается от точки набора силы из-за конечного времени реакции обратной связи и из-за инерции. Размахивание кривой втягивания может быть репрезентативным для дефицита в фиксации образца к его поддержке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Измерения AFM для вычета давления тургора. (A) DMT modulus карта показывает четкий контур ячейки, чтобы контролировать позиционирование участков глубокого отступа вблизи барицентра ячейки. Места идентификации отмечены крестами. (B) Кривая силы глубоких отступов на позиции красного креста в A. Модуля E (зеленый) клеточной стенки Янга (зеленый) и образец очевидной жесткости k (красный) устанавливаются в различных режимах кривой, как подробно описано в шаге 2.4. R 2 обозначает коэффициент определения припадков. (C) Высота карты с вручную определяется длинные и короткие оси, изображенные белыми линиями, той же ячейки проанализированы в панелях A и B. (D) Высота профиля длинных и коротких осей ячейки в панели C (синий, длинная ось красный, короткая ось) и fitte d радиусы кривизны (r1 и r2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Появление форм в растениях в основном определяется скоординированной скоростью и направлением роста во времени и пространстве. Растительные клетки заключены в жесткую клеточную стенку из полисахаридной матрицы, которая склеивает их вместе. В результате, расширение клетки контролируется равновесием между тургордавлением, тянующим на клеточной стенке, и жесткостью клеточной стенки, сопротивляющейся этому давлению. Для того, чтобы понять механизмы, лежащие в основе развития, важно, чтобы иметь возможность измерить как клеточные стены механических свойств, а также тургор давление в различных тканях или клетках данного органа. Как показано в настоящем документе, AFM является методом выбора в этом контексте.
В протоколе есть несколько важных шагов. Первый из них является подготовка тканей, которые должны быть достаточно быстрыми, чтобы избежать обезвоживания. Это может иметь решающее значение, в частности, если мы хотим измерить давление тургора. Очень важна также правильная фиксация образца на его субстрат: нестабильный образец может привести к очень очевидным эффектам, таким как макроскопическое движение, которое может быть легко обнаружено оптически, или сильной деформации кривых силы. Во всяком случае, вибрации образца или изгиб может быть тонким, чтобы обнаружить, вводя артефакты в результаты. Наконец, еще один важный шаг касается выбора параметров отступа. Это определяющее качество результатов.
При измерении механических свойств на больших участках (более 40-50 мкм размеров сканирования), разница в высоте может быть высокой, что затрудняет правильное отслеживание поверхности и реализации кривых силы, не достигнув пределов диапазона пьезо. Для преодоления этой проблемы был использован модуль CellHesion. Этот модуль добавляет дополнительный пьезо, расположенный в стадии образца, имея диапазон 100 мкм, что позволяет на большие площади приобретения, не приближаясь опасно й piezo пределы.
Первое ограничение метода заключается в том, что мы можем измерить только поверхностные слои клеток. Однако, в последнее время авторы использовали AFM на участкахткани 12,13,14. Хотя это должно быть сделано на фиксированном материале, он может дать доступ к механическим свойствам глубоких слоев клеток. Кроме того, были также выполнены более глубокие отступы, чтобы сделать вывод о механических свойствах внутренних тканей на живых образцах, хотя и с большими жертвами на пространственное разрешение15. Второе ограничение может быть связано с геометрией образца, так как поверхность с крутым склоном может быть проблематичной, так как наконечник не более перпендикулярно образцу. Нам необходимо ограничить диапазон углов, в пределах которых меры являются надежными, и в настоящее время мы разрабатываем алгоритм для коррекции потенциальных артефактов, связанных с этим явлением. Кроме того, некоторые ткани покрыты трихом, которые могут блокировать измерения. Наконец, отступ измеряет механические свойства в перпендикулярном направлении относительно поверхности клетки, и мы можем задаться вопросом, если это может быть легко связано с расширительностью клеточной стенки, связанной с потенциалом роста. Несколько исследований показывают, что это так15,16.
Стоит сделать здесь более общее наблюдение об измерении/применении сил AFM. Как описано в разделе протокола, для того, чтобы иметь возможность трансформировать лазерные перемещения на фотодиоде в силы, необходимо провести калибровку. В этой калибровке один параметр, чувствительность отклонения, позволяет преобразовать лазерные смещения в фактические отклонения cantilever (как правило, измеряется в нм), так что этот фактор калибрует фотодиод выход напряжения (вдоль вертикальных осей) для смещения в Нм. Вторым фактором является весенняя константа K, измеряемая в N/m, которая преобразует вертикальные отклонения кантилевера в силовые агрегаты (обычно nN), так как гибкие кантилеверы ведут себя как пружины. Даже если процедура кажется простой, надежная и воспроизводимая калибровка K для измерений спектроскопии силы AFM все еще проблема, из-за различных источников ошибки, которые могут повлиять на различные этапы процедуры. Например, измерение чувствительности отклонения, реализующее кривую силы на жесткой поверхности, может привести к неправильным значениям, если кончик скользит по поверхности, или если поверхность не полностью очищена или также, если поверхностный заряд вызывает электростатическое отталкивание. Во всех предыдущих случаях контактная часть кривой силы будет деформирована (дальнейшая наклонная или изогнутая вместо линейной).
Процедура контакта, описанная в разделе протокола, является лишь одной из нескольких существующих процедур калибровки. Есть по крайней мере еще 2 метода, которые могут быть использованы в относительно простой и недорогой способ: метод Sader (также называемый бесконтактный при реализации в некоторых AFM программного обеспечения) или метод ссылки кантилевер. Метод Sader17 был первоначально разработан Джоном Садером для V-образных кантилеверов, а затем для прямоугольных18 и не нуждается в приобретении кривой силы на жестком субстрате. Вместо этого пользователю необходимо указать (из температуры, как в контактном методе), длину и ширину кантилевера и плотность и вязкость жидкости, где находится кантилевер (как правило, воздух, вода или водоподобные жидкости). Затем приобретается тепловой спектр и измеряется чувствительность к отклонению и константа пружины. Этот метод является выгодным при использовании очень резкие или функционализованные советы, которые могут быть повреждены делать силу кривой на жестком субстрате.
Оба предыдущих метода связаны с приобретением спектра колебаний термически возбужденного кантилевера. Когда жесткие кантилеверы используются при комнатной температуре, средняя амплитуда колебаний может быть ниже 0,1 нм, что делает резонансный пик меньше и труднее обнаружить. Во всяком случае, по крайней мере для обоих инструментов, используемых в этой работе, резонансный пик на самом деле может быть обнаружен в воздухе и в воде и установлены для измерения весенний константы (учитывая, что, когда измерение делается в жидкости, частота резонанса сдвиги в сторону более низкой значения и пик расширяется).
Третий метод не использует тепловую мелодию, но вместо этого ссылка кантилевер или ссылка упругой структуры, с известной константой пружины (как правило, с неопределенностью вокруг или ниже 5%), для того, чтобы определить cantilever K. В этом случае первая кривая силы должна быть приобретена на жестком субстрате для измерения чувствительности отклонения (который приходит снова вместе со всеми возможными артефактами, влияющими на форму кривой). Затем жесткий субстрат заменяется эталонным кантилевером (как правило, без наконечником кантилевера с откалиброваванной пружинной константой) и выполняется другая (или несколько других) кривая силы, снова зафиксировав значение чувствительности отклонения. Затем кантилеверпругая константа рассчитывается как:
где Kref является весенняя константа эталонного кантилевера, Sref чувствительность отклонения измеряется на нем, L является его длина и Sжесткой является чувствительность отклонения измеряется на жесткой Субстрат. Зл является смещение между кончиком и в конце ссылки кантилевер и зависит от выравнивания, сделанные пользователем и, наконец, является угол наклона кантилевера, указанный производителем AFM. Тот же метод может быть использован на эластичных конструкциях, специально предназначенных для калибровки кантилевера или инди-центра. Преимущество этих структур (которые, как правило, круговые) является то, что K в их центре является постоянным и не зависит от какого-либо геометрического параметра или от точного позиционирования наконечника AFM на них, так что удаление L и LL по сравнению с предыдущей формулой.
Пользователь AFM должен иметь в виду, что все эти методы калибровки подвержены различным источникам ошибок (определение чувствительности отклонения в первом и третьем, использование тепловой мелодии в случае жестких кантилеверов для первого и второго и геометрического параметры и выравнивание для третьего, а также точность калибровки Kref в случае эталонного кантилевера используется) и что контактные методы потенциально вредны для кончика (особенно третий, где калибровка налагает использование двух различные образцы). Это означает, что весенняя константа всегда будет определяться до определенной точности, и так будут измеренные/прикладные силы (см. Sikora19 для всестороннего обзора различных методов калибровки и их точности. Это означает, что модули янга и тургор давления также будут затронуты кантилевер калибровки. Во всяком случае, другие, даже более важные источники ошибки участвуют при расчете этих количествах (например, использование упрощенных моделей для определения модуля Янг), так что это всегда будет проблемой для получения абсолютных значений из этих видов измерений. Важно получить значения, которые имеют правильный порядок величины и которые согласованы друг с другом, а это означает, что если эксперимент повторяется тем же пользователем на той же выборке, значения должны быть совместимы. Для того, чтобы получить его, калибровка должна быть сделана тщательно, и источники ошибок должны быть сведены к минимуму (например, ограничение столько, сколько, возможно, акустический шум / вибрации). Одна из возможных стратегий, направленных на повышение согласованности повторных калибровок, была недавно предложена в документе Schillers et al.20, где благодаря сотрудничеству 11 европейских лабораторий, протокол (называемый SNAP) для компенсации ошибок в была разработана чувствительность к отклонению. В этой работе авторы используют непосредственно откалиброванные кантилеверы для своих измерений, в любом случае тот же протокол может быть применен к некалиброванных кантилеверам, просто откалибровав их в первый раз методом выбора, а затем рассматривая первую весну постоянное значение эталона ("откалибровано").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить команду PLATIM за техническую поддержку, а также Арески Будауда и членов команды по биофизике в лаборатории RDP за полезные обсуждения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y.
- Cosgrove, D. J.
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
