Summary
RNAポリメラーゼとの転写因子(TF)の相互作用は、通常、プルダウンアッセイを用いて研究される。我々は、クラミジアRNAポリメラーゼとのGrgAの相互作用を特徴付けるためにバイオレイヤー干渉計(BLI)技術を適用する。プルダウンアッセイと比較して、BLIはリアルタイムの関連付けと解離を検出し、より高い感度を提供し、高い定量性を提供します。
Abstract
転写因子(TF)は、RNAポリメラーゼ、別のTF、および/またはテンプレートDNAと相互作用することによって遺伝子発現を調節するタンパク質です。GrgAは、クラミジアの義務的な細胞内細菌病原体に特異的に見出される新規転写活性化剤である。アフィニティビーズを用いたタンパク質プルダウンアッセイは、GrgAが2つのσ因子、すなわちσ66およびσ28に結合することを明らかにした。BLI を使用して、相互作用を確認し、さらに特徴付けしました。BLIはプルダウンに対していくつかの利点を示す:1)結合パートナー間のリアルタイムの関連付けと解離を明らかにし、2)定量的運動パラメータを生成し、3)プルダウンアッセイが検出に失敗するバインディングを検出することができる。これらの特性により、クラミジアにおける遺伝子発現調節におけるGrgAの生理的役割と、可能な詳細な相互作用機構を推測することが可能になりました。この比較的手頃な価格の技術は、転写やその他の生物学的プロセスの研究に非常に役立つことを想定しています。
Introduction
DNAをテンプレートとして用いてRNA分子を産生する転写は、遺伝子発現の第一歩です。細菌RNA合成は、標的プロモーター1、2へのRNAポリメラーゼ(RNAP)ホロエンザイムの結合に続いて開始する。RNAPホロエンザイム(RNAPholo)は、多単位触媒コア(RNAPcore)とσ因子で構成され、プロモーター配列の認識に必要です。転写活性化剤およびリプレッサは、総称してTFと呼び、RNAPcore、σ因子、および/またはDNAの結合成分を介して遺伝子発現を調節する。生物に応じて、そのゲノムのかなりの部分は、生理学的ニーズおよび環境手がかり3に応じて転写を調節するTFに専念してもよい。
クラミジアは、ヒトおよび動物の様々な疾患を担う義務的な細胞内細菌である4,5,6,7,8.例えば、クラミジア・トラコマティスは間違いなく世界中のヒトで性感染症の病原体の第1位であり、一部の未発達国における失明の主な原因である4、5。クラミジアは、素体(EB)とリチキュレート体(RB)9と呼ぶ2つの交互の細胞形態によって特徴付けられたユニークな発達サイクルを有する。一方、EBは細胞外環境で生存できるが、増殖はできない。EBはエンドサイトローシスを介して宿主細胞に入り、接種後数時間以内に宿主細胞質の真空中でより大きなRBに分化する。もはや感染性ではなく、RBはバイナリ核分裂を通じて増殖する。20時間頃、それらは30〜70時間の周りに宿主細胞を出るEBに戻って分化し始める。
クラミジア発達サイクルの進行は転写によって調節される。約1,000個のクラミジア遺伝子の超大部分が、RBが活発に複製している中間サイクル中に発現されるのに対し、宿主細胞へのEBの侵入直後に転写される遺伝子はごく少数のみであり、DB を RB に、および別の小さな遺伝子セットが書き起こされたり、BS10,11への分化を可能にするためにますます転写されたりする。
クラミジアゲノムは、σ66、σ28、σ 54の3つのσ因子をコードします。σ66は、大腸菌および他の細菌のハウスキーピングσ70に相当するが、初期および中期の遺伝子およびいくつかの後期遺伝子のプロモーターを認識する責任があるのに対し、σ28およびσ54は必要とされる。特定の後期遺伝子の転写。いくつかの遺伝子は、σ66依存性プロモーターとσ28依存性プロモーター12の両方を運ぶことが知られている。
複雑な発達サイクルにもかかわらず、クラミディア13では少数のTFしか見つかっていない。GrgA(C.トラコマティス血清DおよびCTL0766における架空タンパク質CT504として以前に注記されていたC.トラコマティスL2)は、最初にσ66-依存性遺伝子14の活性化剤として認識されたクラミジア特異的TFである。アフィニティプルダウンアッセイは、GrgAがσ66とDNAの両方を結合することによって転写を活性化することを実証しました。興味深いことに、GrgAもσ28と共沈殿し、σ28依存性プロモーターからの転写をインビトロ15で活性化していることが後に判明した。GrgAがσ66とσ28に類似しているか異なる親和性を有するかを調べるために、BLIを使用することにしました。BLIアッセイは、GrgAがσ28よりも30倍高い親和性でσ66と相互作用することを示しており、GrgAがσ66-従属転写およびσ28依存転写において差動の役割を果たす可能性があることを示唆している。15.
BLIは、バイオセンサの先端にある固定化タンパク質の層から反射する白色光の干渉パターンを検出し、内部基準層16の干渉パターンと比較する。これらの2つの干渉パターンの分析を通じて、BLIはバイオセンサの先端に結合したタンパク質の量に関する貴重でリアルタイムの情報を提供することができます。バイオセンサの先端に固定化されたタンパク質はリガンドと呼ばれ、一般に、関連する粒子(NTAまたはビオチンタグなど)に対する親和性を有する一般的な抗体またはエピトープタグ(例えば、ポリヒスタグまたはビオチンタグ)の助けを借りて固定化される。バイオセンサの先端にストレプトアビジン)。バイオセンサの先端にあるリガンドとの二次タンパク質の結合は、バイオセンサの不透明度の変化を引き起こし、したがって干渉パターンの変化をもたらす。異なる濃度のアナリテを繰り返すと、BLIは、定性的なだけでなく、リガンドとアナリテ16との親和性に関する定量的情報も提供できる。
私たちの知るなかでは、転写15でタンパク質とタンパク質の相互作用を特徴付けるためにBLIを採用した最初の人でした。本書では、σ28-バインディングに必要であることが以前に示されていたGrgAフラグメントが実際に結合を仲介することを示す。この原稿は、BLIアッセイのステップ、およびBLIグラフの生成と結合動態のパラメータに焦点を当てています。リガンドおよび解剤の製造(および精製)の方法については、ここでは説明しません。
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Protocol
1. タンパク質の調製
- BLIバッファーの1,000体(25mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1mM EDTA、10mM MgCl)に対してBLIアッセイに使用する各タンパク質(ヒスタグ付きリガンドとアナリテの両方を含む)を透析する透析バッグ(適切なカットオフサイズ)を使用します。、0.1 mM DTT、pH 8.0、4 °C に 4 °C) に 4 時間の事前に冷却します。
注:BLIアッセイでは、バイオセンサ上の結合部位を飽和させる濃度でリガンドが存在し、リガンドと反応する検体のモル濃度が知られているように高度に精製される必要があります。His-およびStrepタグ付きタンパク質の発現および精製のための方法論については、ここでは取り上げられていないが、以前の出版物14,15で見つけることができます。このシステムは、リガンドを高度に精製された形でする必要はありませんが、アッセイ中のバッファ変化によって生じる白色光干渉パターンのシフトを最小限に抑えるために、未精製リガンドをBLIバッファーに透析することが不可欠です。 - 新鮮なBLIバッファに切り替え、さらに4時間透析を続けます。
2. バイオセンサーの水分補給とアッセイのセットアップ
- アッセイ開始の約10分前に、BLIバッファーのピペット200μLをPCRチューブに入れた。
- 手袋をした手でバイオセンサの広い部分を保持することにより、元の包装からNi-NTAバイオセンサを取り外します。
- バイオセンサーをPCRチューブの上に置き、バイオセンサのガラス先端だけがBLIバッファに沈み込みます。
- 完全な水分補給を確保するために、バイオセンサーの先端を少なくとも10分間水没させ続けます。
- 上記の手順では、Ni-NTA バイオセンサーのガラス先端が BLI バッファー以外に触れていないことを確認します。
注: このプロトコルは、His タグ付きリガンドと組み合わせて Ni-NTA バイオセンサーを使用します。必要に応じて、SA-ストレプトアビジンバイオセンサは、代わりにビオチン化リガンドと組み合わせて使用することができます: (i) リガンドと検体の両方がHisタグを運ぶか、(ii)どちらも持っていません。
- 上記の手順では、Ni-NTA バイオセンサーのガラス先端が BLI バッファー以外に触れていないことを確認します。
- BLItz マシンの電源を入れます。
- マシンの背面にある USB データ出力ポートを介してコンピュータに接続されていることを確認します。
- コンピュータで、関連するソフトウェア(BLItz Proなど)を開き、画面の左側にある高度な動態をクリックします。
- ソフトウェアで、それぞれの見出しの下に、実験に関するすべての適切な情報(実験名、説明、サンプルID、タンパク質濃度を含む)を入力します。
- バイオセンサータイプをクリックし、ドロップダウンメニューからNi-NTAを選択します。
- [設定の実行] 見出しで、シェーカーが[有効にする] に設定されていることを確認します。
- [ステップタイプリスト]見出しの下に、初期ベースライン、読み込み、ベースライン、関連付け、および解離の 5 つの項目が一覧表示されていることを確認します。
注: 各ステップの期間は、必要に応じてデフォルトから変更できます。最適な結果を出すには、初期ベースラインとベースラインに最低 30 s を使用します。アソシエーションと解離のための120s。ローディングステップの持続時間(120~240s)は、リガンドのリガンドの濃度と、ニNTAバイオセンサへのリガンド上のHis-epitopeタグの親和性に依存します。
- PCRチューブから水和されたNi-NTAバイオセンサーを取り外し、バイオセンサーの広い部分をマウント上にスライドさせて、機械のバイオセンサーマウントに貼り付けます。
注:実験中にバイオセンサーを乾かさないようにしてください。 - 0.5 mLの黒いマイクロ遠心管を機械の管ホルダーに入れ、BLIバッファーのピペット400μLをその中に入れます。
- チューブホルダーがマシン上の黒い矢印の前に配置されていることを確認します。
- バイオセンサ先端がマイクロ遠心管内のバッファーに沈むような機械のカバーを閉じます。
- ソフトウェアの[次へ]をクリックして、初期ベースラインの記録を開始します。
3. バイオセンサーへのリガンドのロード
- 初期ベースラインステップの記録が完了したら、マシンのカバーを開きます。
- スライダを右に動かして、ドロップホルダー(チューブホルダーの代わりに)が黒い矢印の前に配置するようにします。
- 透析したヒスタグ付きリガンド(ステップ1.1から)のピペット4 μLをドロップホルダーに取り付け、機械のカバーを閉じます。
注:使用するリガンドの最適濃度は、タンパク質ごとに異なる場合があります。1.0~2.0mg/mLの濃度は、通常、バイオセンサの先端でNTAを240sで飽和するのに十分です。 - ソフトウェアで、[次へ]をクリックして読み込みを開始します。
4. 追加のリガンドを洗い流す
- ローディングステップの記録が完了したら、マシンのカバーを開きます。
- スライダを左に動かして、チューブホルダーが再び黒い矢印の前に配置されます。
- 機械のふたを閉じ、バイオセンサーの先端が管の管のBLIバッファーに沈んでいることを確認する。
- ソフトウェアでもう一度[次へ]をクリックして、ベースラインの記録を開始します。
5. リガンドに対する解数の関連
- ベースラインステップの記録が完了したら、マシンのカバーを開きます。
- ドロップホルダーを取り外し、タンパク質をピペッティングし、二重脱イオン水(ddH2 O)で合計5回洗い流して洗浄します。
- ティッシュワイプを使用して、洗濯後にドロップホルダーの表面をきれいにします。
- ドロップホルダーをマシンに交換し直してください。
- ドロップホルダーが再び黒い矢印の前に配置するように、マシンのスライダを右に動かします。
- 透析されたアナライト(ステップ1.1から)のピペット4 μLをドロップホルダーに取り付け、機械のカバーを閉じます。
- ソフトウェアで、[次へ]をクリックして関連付けを開始します。
6. リガンドからの解離
- アソシエーションステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開きます。
- マシンのスライダを右に動かして、チューブホルダーが再び黒い矢印の前に配置されます。
- ソフトウェアで、[次へ]をクリックして解離を開始します。
- 解離ステップの記録が終わったら、マシンのカバーを開きます。
- ドロップホルダーとチューブホルダーを取り外します。
- ddH2Oで両方を完全に洗い流し、タンパク質を洗い流します。
- バイオセンサーを取り外し、安全に廃棄します。
7. 異なる濃度での相互作用の繰り返し
- 異なる解物濃度を用いて同じリガンド・アナライト対に対してステップ2-7を繰り返す。
注: 最適な結果を得る前に、複数の実行でアナリテの濃度を調整する必要がある場合があります。私たちの経験では、75 nMから始まる1:5:10のアナリテ濃度の比率は、通常十分です。
8. ソフトウェアを使用したデータの分析
- すべての実行が完了したら、[ファイル] をクリックしてソフトウェアにデータを保存し、画面の左側にある[実験を保存]をクリックします。
- [データの実行] 見出しで、[ステップ補正と継手](1:1)を選択し、[分析]をクリックして運動データを生成します。
- 量的データをワークシートに抽出してグラフを生成するには、[CSVにエクスポート]をクリックし、記録されたデータを .csv ファイルとして保存します。スプレッドシート ソフトウェアを使用して .csv ファイルを開きます。
- [関連付け]と[解離]運動性を最も効果的に表示するには、[ベースライン]ステップの前にあるすべてのプロット ポイントを削除し、後続のすべてのプロット ポイントを最終的な基準値から正規化します。
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Representative Results
BLIアッセイを通じて、Σ28へのGrgAの結合は、GrgA15の28アミノ酸中域(残基138-165)に依存することを以前に確立した。したがって、N末端の全長GrgA(NH-GrgA)と比較して、この領域を欠くGrgA欠失構造体(NH-GrgAΔ138-165)は、関連率が低下し、解離率が増加し、全体の300万倍の損失を生じました。アフィニティ (表1)ここでは、この中間領域がGrgAタンパク質の残りの部分がない場合にσ28を直接結合することを実証する。これらの実験では、N末端HISタグ(NH-GrgA138-165)でタグ付けされた中間領域をリガンドとして使用し、最初にNi-NTAバイオセンサの先端に固定化した(図1A)。バイオセンサから非連結NH-GrgA138-165を洗浄した後、σ28の添加後に検体σ28とのリアルタイム関連を記録した。最後に、洗浄後にリアルタイム解離を記録した。リガンド結合の前に30sを開始し、洗浄開始後2分後に終了する3つの異なる解物濃度を有する実験の記録を図1Aに示す。リガンドと分析の相互作用をより良く視覚化するために、リガンドを添加する前にデータを削除し、ベースラインを 0 にリセットして図 1Bを導き出します。
NH-GrgA138-165フラグメントとσ28との相互作用のための運動パラメータの値を表1に示す。NH-GrgA X σ28相互作用と比較して、NH-GrgA138-165 X σ28相互作用は、k aの統計的に有意な60%減少の傾向を示し、k dの非常に統計的に有意な64%の増加を示した。K Dの 3.5 倍の非常に統計的に有意な増加.これらの変化は、NH-GrgAと比較して、NH-GrgA138-165はσ28をよりゆっくりと結合し、σ28から解離し、σ28との全体的な親和性が低下していることを示している。したがって、GrgAにおける残渣138-165はσ28に結合するが、全長GrgAと比較して親和性が低下する。
図1:GrgAの28アミノ酸中域は、インビトロでσ28に結合する。
(A) 4段階で記録された光干渉パターンのリアルタイム変化:(i)NH-GrgA138-165(リガンド)をNi-NTAバイオセンサに結合する、(ii)洗浄、(iii)固定化に異なる濃度でNS-σ28(アナリテ)の結合NH-GrgA-138-165(リガンド)、および(iv)その後の洗浄。(B) (A) から最初の2段階の値の除去後のリガンド・アナライト関連および解離の強化された可視化とベースラインのリセット。パネルBはDesaiらから変更され、2018年15月15日.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| リガンド | N | ka | kd | KD | 参照 | |||||||||||
| 1/ミリ秒 | %コントロール | 1/s | %コントロール | M | %コントロール | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1.5 ± 1.7) x 104 | 100人 | (2.8 ± 0.8) x 10-3 | 100人 | (2.2 ± 0.3) x 10-7 | 100人 | デサイら, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ138-165 | 2 | (5.6 ± 0.1) x 103 | 37歳 | (4.1 ± 0.3) x 102 | 1.5×107 | (6.9 ± 4.5) x 10-2 | 3.1×108 | デサイら, 2018 | ||||||||
| p=0.125 | p<0.002 | p<0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6.0 ± 1.0) x 103 | 40歳 | (4.6 ± 0.4) x 10-3 | 164の | (7.7 ± 0.3) x 10-7 | 350名 | この研究 | ||||||||
| p=0.074 | p=0.006 | p<0.001 | ||||||||||||||
表1:アミノ酸残渣138-165のみを含むGrgAの変異体は、全長GrgAと比較して親和性が低いにもかかわらずσ28に結合する。
BLIアッセイは、Hisタグ付きフルレングスGrgAまたは欠失変異体をリガンドとして使用し、硝子タグ付きσ28を検体として精製したNi-NTAバイオセンサで行った。記録のグラフを図 1に示します。運動パラメータの値(平均±標準偏差)は、関連するソフトウェア17で生成された。ka(アソシエーションレート定数)は、AおよびB.k dの1モル溶液中に1秒当たり形成される複合体の数(解離速度定数)として定義され、1秒あたりに減衰する複合体の数として定義される。KD(解離平衡定数)は、リガンド結合部位の50%が解剖者によって占有される濃度として定義され、kdをkaで割った。n、実験繰り返しの数。p値は、2尾の学生のtテストを使用して計算されました。NH-GrgAおよびNH-GrgAΔ138-165の運動パラメータは、Desai et al., 201815.
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Discussion
タンパク質とタンパク質の相互作用は、転写および他の生物学的プロセスの調節にとって重要である。彼らは最も一般的にプルダウンアッセイを通じて研究されています。プルダウンアッセイは比較的簡単に実行できますが、定量的に低く、弱いが生物学的に有意義な相互作用を検出できない場合があります。対照的に、リガンドとアナリテの間のリアルタイムの関連付けと解離を検出することにより、BLIは、全体的な親和性と同様に、関連および解離率定数を提供します。
プルダウンアッセイと比較して、BLIアッセイは、より高い感度を提供します。例えば、GrgA-σ28相互作用はBLIによる分析物の低いnM濃度で検出されるが、プルダウンアッセイ(未発表データ)では検出されない。プルダウンとは異なり、BLIは検出抗体に依存しないため、感度に大きな影響を与える可能性があります。
さらに重要なのは、BLI解析はタンパク質間の相互作用に関する機械的な洞察を提供できるのに対し、プルダウンアッセイはできないということです。これは、異なるGrgAコンストラクトとのσ28の相互作用によって例示される。NH-GrgAと比較して、NH-GrgAΔ138-165およびNH-GrgA138-165は結合σ28のkでわずか60%の損失を被る。これらの知見は、N末端64残基を欠いているGrgAがσ28との親和性が低下していることを示す我々の以前のBLIデータと一致しており、GrgAのN末端配列がσ28結合に寄与することを示唆している。NH-GrgAΔ138-165およびNH-GrgA138-165は結合σ28で同様のk値を有するが、前者は後者よりも91,000倍高いk dを有する。これらの結果は、138-165の結合がGrgAの構造変化を引き起こし、複合体を大幅に安定化することを示している。
BLIよりも長い歴史を持つ表面プラズモン共鳴(SPR)は、リアルタイムタンパク質タンパク質相互作用18,19を定量化することもできる。BLIの感度はSPR20よりも低いと考えられているが、前者は現在、費用対効果において後者を上回っている。たとえば、SPR バイオセンサのコストは、BLI バイオセンサーのコストよりもはるかに高くなります。
SPRの基礎となる原理の性質上、タンパク質を取り巻く媒体の微小流体の影響を強く受けます。したがって、いくつかのSPR機器を含む実験は、最適なバッファ条件21、22、23、24を確保するために、研究者側にかなりの知覚を必要とします。一方、現在のBLI計測器は、非常に限られた温度制御範囲25を備えており、特定の相互作用に対して熱力学的パラメータ(エンタルピーやギブスフリーエネルギーなど)を決定するために不適合です。
グリセロールは、一般的に使用されるクライオプロテクタートは、その広範な化学的互換性にもかかわらず、BLIと互換性がありません。したがって、透析によってリガンドおよび麻酔によるグリセロールおよび解体を除去することが重要である。得られたグリセロールフリータンパク質は4°Cで保存する必要があり、不安定性の増加および不正確な運動パラメータにつながる可能性があります。特に、異なる時間に一貫性のない運動パラメータが得られる場合は、透析後すぐにBLIアッセイを行うすることをお勧めします。BLIアッセイが完了する正確な時間枠はタンパク質によって異なり、その濃度の影響を受けます。
SPRと同様に、BLIは、低分子スクリーニング26に使用されている。新しいBLI計測器はスクリーニングのための高いスループットオプションを提供することを考慮すると、BLIはタンパク質とタンパク質の相互作用を促進または妨害する小分子の同定と特徴付けに非常に有用になることを想定しています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(助成金#AI122034とAI140167)とニュージャージー州保健財団(助成金#PC 20-18)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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