Summary
As interações de fatores de transcrição (TFs) com a RNA polimerase são geralmente estudadas usando ensaios de pulldown. Nós aplicamos uma tecnologia da interferometria de Biolayer (BLI) para caracterizar a interação de GrgA com o polymerase do RNA do chlamydial. Comparado aos ensaios de pulldown, o BLI detecta associação e dissociação em tempo real, oferece maior sensibilidade e é altamente quantitativo.
Abstract
Um fator de transcrição (TF) é uma proteína que regula a expressão gênica interagindo com o RNA polimerase, outro TF, e/ou DNA do modelo. O GrgA é um ativador de transcrição inovador encontrado especificamente no patógeno bacteriano intracelular obrigatório clamídia. Os ensaios de pulldown da proteína que usam grânulos da afinidade revelaram que GrgA liga dois fatores do σ, a saber σ66 e σ28, que reconhecem jogos diferentes dos promotores para os genes cujos os produtos são exigidos diferencialmente em estágios desenvolventes. Nós usamos BLI para confirmar e caracterizar mais as interações. BLI demonstra várias vantagens sobre pulldown: 1) revela associação em tempo real e dissociação entre parceiros vinculativos, 2) gera parâmetros cinéticos quantitativos e 3) ele pode detectar ligações que os ensaios de pulldown muitas vezes não conseguem detectar. Estas características permitiram-nos deduzir os papéis fisiológicos de GrgA na regulação da expressão gênica na clamídia, e possíveis mecanismos detalhados de interação. Nós imaginamos que esta tecnologia relativamente acessível pode ser extremamente útil para estudar a transcrição e outros processos biológicos.
Introduction
A transcrição, que produz moléculas de RNA usando DNA como modelo, é o primeiro passo da expressão gênica. A síntese de RNA bacteriano começa após a ligação da holoenzima RNA polimerase (RNAP) a um promotor-alvo1,2. O holoenzyme de RNAP (RNAPholo) é compreendido de um núcleo catalítico do multi-subunit (RNAPcore) e de um fator σ, que seja exigido para reconhecer a seqüência do promotor. Ativadores de transcrição e repressores, coletivamente denominados TFs, regulam a expressão gênica através dos componentes de ligação do RNAPcore, σ fatores e/ou DNA. Dependendo do organismo, uma parcela significativa do seu genoma pode ser dedicada a TFs que regulam a transcrição em resposta às necessidades fisiológicas e sugestões ambientais3.
A clamídia é uma bactéria intracelular obrigatória responsável por uma variedade de doenças em humanos e animais4,5,6,7,8. Por exemplo, Chlamydia trachomatis é indiscutivelmente o número um patógeno sexualmente transmitido em humanos em todo o mundo, e uma das principais causas de cegueira em alguns países subdesenvolvidos4,5. A clamídia tem um ciclo de desenvolvimento único caracterizado por duas formas celulares alternadas denominadas de corpo elementar (EB) e corpo RETICULADO (RB)9. Considerando que, os EBs são capazes de sobreviver em um ambiente extracelular, eles são incapazes de proliferação. EBs entrar células hospedeiras através de endocitose e diferenciar em maior RBs em um vacuol no citoplasma hospedeiro dentro de horas após a inoculação. Não mais infeccioso, RBs proliferam através de fissão binária. Ao redor 20 h, começam diferenciar-se de volta ao EBs, que saem das pilhas do anfitrião ao redor 30-70 h.
A progressão do ciclo de desenvolvimento de clamídia é regulada pela transcrição. Visto que uma supermaioria dos quase 1.000 genes chlamydial é expressada durante o midcycle durante que RBs está replicando ativamente, somente um número pequeno de genes é transcrito imediatamente depois que a entrada de EBs nas pilhas do anfitrião para iniciar a conversão de EBs em RBs, e outro pequeno conjunto de genes são transcritos ou cada vez mais transcritos para permitir a diferenciação de RBs em EBs10,11.
O genoma da clamídia codifica três fatores σ, ou seja, σ66, σ28 e σ54. σ66, que é equivalente ao housekeeping σ70 de e . coli e outras bactérias, é responsável para reconhecer promotores de genes adiantados e meados de-ciclo assim como alguns genes atrasados, visto que σ28 e σ54 são exigidos para a transcrição de certos genes tardios. Vários genes são conhecidos por transportar um promotor σ66-dependente e um promotor σ28-dependente12.
Apesar de um ciclo de desenvolvimento complicado, apenas um pequeno número de TFs foi encontrado em Chlamydiae13. Grga (anotado previamente como uma proteína hipotética CT504 em c. trachomatis sorovar D e em CTL0766 em c. trachomatis L2) é um TF Chlamydia-específico reconhecido inicialmente como um activador de σ66-dependente genes14. Os ensaios de pulldown da afinidade demonstraram que GrgA ativa sua transcrição ligando σ66 e ADN. Curiosamente, foi mais tarde encontrado com que GrgA também coprecipitates com σ28, e ativa a transcrição de σ28promotores dependentes in vitro15. Para investigar se GrgA tem afinidades similares ou diferentes para σ66 e σ28, nós recorramos a usar o bli. Os ensaios de BLI mostraram que o GrgA interage com σ66 em uma afinidade 30-fold mais elevada do que com σ28, sugerindo que Grga possa jogar papéis diferenciais em σ66-dependente transcrição e σ28-transcrição dependente quinze anos.
A BLI detecta o padrão de interferência da luz branca que reflete a partir de uma camada de proteína imobilizada na ponta de um biosensor e a compara à de uma camada de referência interna16. Através da análise destes dois padrões de interferência, a BLI pode fornecer informações valiosas e em tempo real sobre a quantidade de proteínas ligadas à ponta do biosensor. A proteína que é imobilizada à ponta do biosensor é referida como o ligand, e é imobilizada geralmente com a ajuda de um anticorpo comum ou de um Tag do epítopo (por exemplo, um poli-his-ou a biotina-etiqueta) que tem uma afinidade para uma partícula associada (tal como NTA ou Streptavidin) na ponta do biosensor. O emperramento de uma proteína secundária, referida como o analyte, com o ligante na ponta do biosensor cria mudanças na opacidade do biosensor e conseqüentemente conduz às mudanças em testes padrões da interferência. Quando repetida em diferentes concentrações do analito, a BLI pode fornecer não apenas informações qualitativas, mas também quantitativas, sobre a afinidade entre o ligantes e o analito16.
Ao melhor de nosso conhecimento, fomos os primeiros a empregar a BLI para caracterizar as interações proteína-proteína na transcrição15. Nesta publicação, demonstramos que um fragmento Grga, que foi anteriormente mostrado para ser exigido para σ28-Binding, realmente Medeia a ligação. Este manuscrito centra-se nas etapas dos ensaios de BLI, e na geração de gráficos de BLI e em parâmetros da cinética obrigatória. Métodos para a produção (e purificação) de ligantes e analitos não são cobertos aqui.
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Protocol
1. preparação de proteínas
- Use um saco da diálise (com um tamanho apropriado do corte) para Dialize cada proteína a ser usada para ensaios de bli (que incluem o ligante his-etiquetado e o analyte) de encontro a 1.000 volumes do amortecedor de bli (25 milímetros de Tris-HCl, de 150 milímetros NaCl, de 0,1 milímetros de EDTA, de 10 milímetros MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pré-refrigerados a 4 ° c) a 4 ° c por 4 h.
Nota: os ensaios de BLI requerem que o ligante esteja presente em concentrações que saturem os sítios de ligação do biosensor e que o analito seja altamente purificado para que se conhecam as concentrações molares do analito que reagem com o ligante. Metodologias para a expressão e purificação de suas proteínas marcadas e Strep não são cobertas aqui, mas podem ser encontradas em publicações anteriores14,15. Embora este sistema não exija o ligante estar na forma altamente purified, é essencial Dialize mesmo os ligantes não purificada ao amortecedor de bli a fim minimizar deslocamentos nos testes padrões da interferência da branco-luz causados por todas as mudanças do amortecedor durante o ensaio. - Mude para o tampão BLI fresco e continue a diálise por mais 4 h.
2. hidratação do biosensor e set-up do ensaio
- Aproximadamente 10 minutos antes do início de um ensaio, pipetar 200 μL do tampão BLI num tubo de PCR.
- Retire um NI-NTA-biosensor da embalagem original segurando a porção larga do biosensor usando uma mão enluvado.
- Coloc o biosensor sobre o PCR-tubo tal que somente a ponta de vidro do biosensor é submersa no amortecedor de BLI.
- Mantenha a ponta do biossensor submersa por pelo menos 10 min para garantir a hidratação total.
- Verifique se a ponta de vidro do NI-NTA-biosensor não toca em nada além do buffer de BLI durante a etapa acima.
Nota: Este protocolo usa um NI-NTA-biosensor conjuntamente com um ligand his-etiquetado. Se necessário, um SA-streptavidin-biosensor pode ser usado conjuntamente com um ligante biotinylated preferivelmente se: (i) o ligante e o analito carreg um seu Tag ou (II) nenhuns deles faz.
- Verifique se a ponta de vidro do NI-NTA-biosensor não toca em nada além do buffer de BLI durante a etapa acima.
- Ligue a máquina BLItz.
- Certifique-se de que a máquina está conectada ao computador por meio de uma porta de saída de dados USB na parte traseira da máquina.
- No computador, abra o software associado (por exemplo, BLItz pro) e clique em cinética avançada no lado esquerdo da tela.
- No software, digite todas as informações apropriadas sobre o experimento (incluindo o nome do experimento, descrição, ID de amostra e concentração proteica) em cada título respectivo.
- Clique no tipo de biosensor e escolha NI-NTA no menu suspenso.
- o título das configurações de execução , verifique que o Shaker está ajustado para permitir.
- No título da lista de tipos de etapas , verifique se há 5 itens listados: linha de base inicial, carregamento, linha de base, associação e dissociação.
Observação: a duração de cada etapa pode ser alterada de padrão, conforme necessário. Para obter resultados ideais, use um mínimo de 30 s para linha de base inicial e linha de base; e 120 s para associação e dissociação. A duração da etapa de carregamento (variando de 120 a 240 s) dependerá da concentração do ligante e da afinidade da etiqueta his-epitope no ligante ao NI-NTA-biosensor.
- Retire o NI-NTA-biosensor hidratado do tubo do PCR e afixe-o à montagem do biosensor na máquina deslizando a parcela larga do biosensor na montagem.
Nota: não deixe o biosensor secar durante o experimento. - Coloque um tubo de microcentrífuga preto de 0,5 mL no suporte do tubo da máquina e pipetar 400 μL do tampão BLI nele.
- Verifique se o controle deslizante da máquina está posicionado de forma que o suporte do tubo esteja situado na frente da seta preta na máquina.
- Feche a tampa da máquina de tal forma que a ponta do biosensor se torne submersa no tampão no tubo de microcentrífuga.
- Clique em Avançar no software para começar a gravar a linha de base inicial.
3. carregamento do ligante no biosensor
- Depois que a etapa de linha de base inicial terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
- Mova o controle deslizante para a direita de tal forma que o suporte da gota (em vez do suporte do tubo) esteja situado na frente da seta preta.
- Pipete 4 μL de um ligador dialítico com a tag (da etapa 1,1) para o suporte de queda e feche a tampa da máquina.
Nota: a concentração óptima do ligante a ser usado pode variar para cada proteína. Uma concentração entre 1,0 a 2,0 mg/mL é geralmente adequada para saturar o NTA na ponta do biosensor em 240 s. - No software, clique em Avançar para começar a carregar.
4. lavar afastado ligante adicional
- Depois que a etapa de carregamento terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
- Mova o controle deslizante para a esquerda, de forma que o suporte do tubo esteja novamente situado na frente da seta preta.
- Feche a tampa da máquina e assegure-se de que a ponta do biosensor esteja submersa no amortecedor BLI do tubo no suporte do tubo.
- Clique em Next novamente no software para começar a gravar a linha de base.
5. Associação de analito ao ligante
- Depois que a etapa linha de base terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
- Retire o suporte da gota e limpe-o introduzindo toda a proteína e enxaguando-a com água dobro-deionized (ddH2O) para um total de 5 vezes.
- Use uma limpeza do tecido para limpar a superfície do suporte da gota após a lavagem.
- Volte a colocar o suporte da gota na máquina.
- Mova o controle deslizante na máquina para a direita de tal forma que o suporte da gota é novamente situado na frente da seta preta.
- Pipetar 4 μL de um analito dialítico (da etapa 1,1) para o suporte da gota e fechar a tampa da máquina.
- No software, clique em Avançar para iniciar associação.
6. dissociação do analito do ligante
- Depois que a etapa de associação terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
- Mova o controle deslizante na máquina para a direita de tal forma que o suporte do tubo é novamente situado na frente da seta preta.
- No software, clique em Avançar para iniciar a dissociação.
- Depois que a etapa de dissociação terminar a gravação, abra a tampa da máquina.
- Retire o suporte da gota e o suporte do tubo.
- Enxágüe ambos com ddH2o completamente para lavar afastado toda a proteína.
- Retire o biosensor e descarte-o com segurança.
7. repetição de interações com diferentes concentrações
- Repita as etapas 2-7 para o mesmo par ligand-analito usando concentrações diferentes do analito.
Nota: a concentração do analito pode necessitar de ser ajustada em várias corridas antes de obter resultados óptimos. Em nossa experiência, uma relação de 1:5:10 de concentrações do analito, começando com 75 nanômetro, é geralmente adequada.
8. analisando os dados utilizando o software
- Depois que todas as execuções tiverem terminado, salve os dados no software clicando em arquivo e, em seguida, salvar experimento como no lado esquerdo da tela.
- No título executar dados, selecione correção e ajuste de etapa (1:1) e clique em analisar para gerar dados cinéticos.
- Para extrair os dados quantitativos em uma planilha e gerar gráficos, clique em exportar para CSV e salve os dados gravados como um arquivo. csv. Abra o arquivo. CSV usando o software de planilha.
- Para mostrar de forma mais eficaz a cinética de associação e dissociação, remova todos os pontos de plotagem antes da etapa de linha de base e normalizar todos os pontos de plotagem subsequentes do valor final da linha de base.
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Representative Results
Através dos ensaios de BLI, nós estabelecemos previamente que a ligação de GrgA a σ28 é dependente de uma região média do ácido aminado 28 (resíduos 138-165) de Grga15. Conformemente, comparado com N-terminally his-etiquetou o comprimento cheio GrgA (NH-GrgA), um constructo do apagamento de GrgA que falta esta região (NH-GrgAΔ 138-165) teve uma taxa de associação diminuída e uma taxa de dissociação aumentada, conduzindo a uma perda 3 milhões-fold de global afinidade (tabela 1). Aqui, demonstramos que esta região média liga diretamente σ28 na ausência do resto da proteína Grga. Nestas experiências, a região média marcada com um N-terminally his-Tag (NH-GrgA138-165) foi usada como o ligand, que foi imobilizada primeiramente à ponta de um biosensor de NI-NTA (Figura 1a). Após a lavagem não acoplada NH-GrgA138-165 fora do biosensor, a associação do tempo real com o σ28 do analito foi gravada depois da adição de σ28. Finalmente, a dissociação em tempo real foi registrada após a lavagem. As gravações de experimentos com três diferentes concentrações de analito a partir de 30 s antes da ligação do ligante e terminando 2 minutos após o início da lavagem são mostradas na Figura 1a. Para melhor Visualizar a interação ligante-analyte, removemos os dados antes da adição do ligante e redefinimos a linha de base para 0 para derivar a Figura 1b.
Os valores dos parâmetros cinéticos para interação do fragmento NH-GrgA138-165 com σ28 estão apresentados na tabela 1. Em comparação com a interação NH-GrgA X σ28 , a interação NH-GrgA138-165 x σ28 apresentou uma tendência de redução estatisticamente significante de 60% em ka, um aumento de 64% altamente estatisticamente significativo em kd , e um aumento estatisticamente significativo de 3,5 vezes em KD. Estas alterações demonstram que, em comparação com o NH-GrgA, o NH-GrgA138-165 liga σ28 mais lentamente, dissocia de σ28 mais rápido, e tem uma afinidade global diminuída com σ28. Portanto, os resíduos 138-165 em GrgA liga σ28 , mas com afinidade reduzida em comparação com Grga comprimento total.
Figura 1: uma região média de 28 aminoácidos do GrgA liga σ28 in vitro.
(A) mudanças em tempo real nos padrões de interferência de luz registrados em quatro estágios: (i) ligação do NH-GrgA138-165 (ligante) a um biosensor NI-NTA, (II) lavagem, (III) ligação do NS-σ28 (analyte) em diferentes concentrações à NH-GrgA-138-165 (ligante), e (IV) lavagem subsequente. (B) visualização aprimorada da Associação de ligantes-analito e dissociação após a remoção dos valores nas duas primeiras etapas a partir de (a) e redefinição da linha de base. O painel B é modificado de Desai et al., 201815. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ligante | N | Kellya | Kelly daSilva | Kelly daSilva | Referências | |||||||||||
| 1/MS | % de controle | 1/s | % de controle | M | % de controle | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 ± 1,7) x 104 | 100 | (2,8 ± 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 ± 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ 138-165 | 2 | (5,6 ± 0,1) x 103 | 37 | (4,1 ± 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 ± 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p = 0,125 | p < 0,002 | p < 0,001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 ± 1,0) x 103 | 40 | (4,6 ± 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 ± 0,3) x 10-7 | 350 | Este estudo | ||||||||
| p = 0.074 | p = 0,006 | p < 0,001 | ||||||||||||||
Tabela 1: um mutante de GrgA, contendo apenas resíduos de aminoácidos 138-165, liga σ28 apesar da menor afinidade comparada com a Grga de comprimento total.
Os ensaios de BLI foram realizados com biosensores NI-NTA usando o seu-Tagged full-length GrgA ou deleção mutantes como ligantes e purificada Strep-Tagged σ28 como um analito. Gráficos de gravações são mostrados na Figura 1. Os valores dos parâmetros cinéticos (médias ± desvios padrão) foram gerados com o software associado17. k a (constante da taxa de associação) é definida como o número de complexos formados por s em uma solução de 1 molar de a e B. kd (constante de taxa de dissociação) é definido como o número de complexos que decaem por segundo. K D (constante de equilíbrio de dissociação), definida como a concentração na qual 50% dos sítios de ligação de ligante são ocupados pelos analitos, é kD dividido por ka. n, número de repetições experimentais. os valores de p foram calculados por meio de testes t de Student de 2-tailed. Os parâmetros cinéticos para NH-GrgA e NH-GrgAΔ 138-165 foram de Desai et al., 201815.
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Discussion
As interações proteína-proteína são cruciais para a regulação da transcrição e outros processos biológicos. Eles são mais comumente estudados através de ensaios de pulldown. Embora os ensaios de pulldown sejam relativamente fáceis de executar, eles são pouco quantitativos e podem não detectar interações fracas, mas biologicamente significativas. Em comparação, detectando associação e dissociação em tempo real entre um ligantes e um analito, o BLI fornece constantes de taxa de associação e dissociação, bem como, afinidade geral.
Comparado aos ensaios de pulldown, os ensaios de BLI oferecem maior sensibilidade. Por exemplo, as interações GrgA-σ28 são detectadas com concentrações mais baixas de nm de analitos por bli, mas não por ensaios de pulldown (dados não publicados). Ao contrário do pulldown, BLI não confia em um anticorpo da deteção, que possa significativamente afetar a sensibilidade.
Mais importante, as análises de bli podem fornecer introspecções mecanicista na interação entre proteínas, visto que os ensaios do pulldown não podem. Isto é exemplificado pelas interações de σ28 com diferentes construções Grga. Comparado com o NH-GrgA, o NH-GrgAΔ 138-165 e o NH-GrgA138-165 sofrem apenas uma perda de 60% em ka na ligação σ28. Estes resultados são consistentes com nossos dados precedentes de BLI que mostram que GrgA que falta seus resíduos do N-terminal 64 tem uma afinidade diminuída com σ28, sugerindo que a seqüência do n-terminal de Grga contribua a σ28 emperramento. Embora o NH-GrgAΔ 138-165 e o NH-GrgA138-165 tenham valores de k semelhantes na ligação σ28, o primeiro tem um kd 91.000 maior do que o último. Estes resultados indicam que a ligação de 138-165 desencadeia mudanças estruturais no GrgA, estabilizando grandemente o complexo.
Com uma história mais longa que bli, a ressonância Plasmon de superfície (SPR) também pode quantificar as interações proteína-proteína em tempo real18,19. Quando a sensibilidade de BLI for pensada para ser mais baixa do que aquela de SPR20, o anterior supera atualmente o último na custo-eficácia. Por exemplo, os custos dos biossensores SPR são muito superiores aos dos biossensores BLI.
Devido à natureza do princípio subjacente da SPR, é fortemente influenciado pela microfluídica dos meios que cercam a proteína. Portanto, experimentos envolvendo alguns instrumentos de SPR requerem uma percepção considerável por parte do pesquisador para garantir condições ideais de tampão21,22,23,24. Por outro lado, os instrumentos atuais da BLI apresentam uma faixa de controle de temperatura muito limitada25 e, como tal, estão mal equipados para determinar parâmetros termodinâmicas (como entalpia e energia livre de Gibbs) para uma determinada interação.
O glicerol, um crioprotectante comumente usado, é incompatível com a BLI, apesar de sua ampla compatibilidade química. Conseqüentemente, é crítico remover o glicerol do ligante e do analito pela diálise. As proteínas resultantes do glicerol-livre devem ser armazenadas a 4 ° c, o que pode levar a uma maior instabilidade e parâmetros cinéticos imprecisos. Nós recomendamos que os ensaios de BLI sejam executados logo após a diálise, particular se os parâmetros cinéticos inconsistentes são obtidos em épocas diferentes. O tempo exato dentro do qual os ensaios de BLI devem ser concluídos variarão entre as proteínas e serão afetados por suas concentrações.
Tal como na SPR, a BLI tem sido utilizada para a triagem de pequenas moléculas26. Considerando que os instrumentos mais novos de BLI oferecem opções elevadas da taxa de transferência para a seleção, nós imaginamos que BLI pode tornar-se muito útil para a identificação e a caracterização de moléculas pequenas que facilitam ou interferem com interações da proteína-proteína.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (Grants # AI122034 e AI140167) e pela New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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