Summary
Las interacciones de los factores de transcripción (TO) con el ARN polimerasa generalmente se estudian mediante ensayos desplegables. Aplicamos una tecnología Biolayer Interferometry (BLI) para caracterizar la interacción de GrgA con el ARN polimeraso clamítico. En comparación con los ensayos desplegables, BLI detecta la asociación y disociación en tiempo real, ofrece una mayor sensibilidad y es altamente cuantitativa.
Abstract
Un factor de transcripción (TF) es una proteína que regula la expresión génica mediante la interacción con el ARN polimerasa, otro TF y/o el ADN de la plantilla. GrgA es un nuevo activador de transcripción que se encuentra específicamente en el patógeno bacteriano intracelular obligatorio Clamydia. Los ensayos de extracción de proteínas con cuentas de afinidad han revelado que GrgA une dos factores de los mismos, a saber,66 y28,que reconocen diferentes conjuntos de promotores de genes cuyos productos son necesarios diferencialmente en las etapas del desarrollo. Hemos utilizado BLI para confirmar y caracterizar aún más las interacciones. BLI demuestra varias ventajas sobre el desplegable: 1) Revela asociación en tiempo real y disociación entre socios de unión, 2) Genera parámetros cinéticos cuantitativos, y 3) Puede detectar enlaces que los ensayos desplegables a menudo no detectan. Estas características nos han permitido deducir las funciones fisiológicas de la GrgA en la regulación de la expresión génica en la clamidia,y los posibles mecanismos de interacción detallados. Prevemos que esta tecnología relativamente asequible puede ser extremadamente útil para estudiar la transcripción y otros procesos biológicos.
Introduction
La transcripción, que produce moléculas de ARN utilizando el ADN como plantilla, es el primer paso de la expresión génica. La síntesis de ARN bacteriano comienza después de la unión de la holoenzima de ARN polimerasa (RNAP) a un promotor objetivo1,2. La holoenzima RNAP (RNAPholo) se compone de un núcleo catalítico multisubunidad (RNAPcore) y un factor de -, que es necesario para reconocer la secuencia promotora. Los activadores y represores de transcripción, llamados colectivamente TF, regulan la expresión génica a través de los componentes de unión del ARNPcore, los factores y/o el ADN. Dependiendo del organismo, una parte significativa de su genoma puede dedicarse a los TF que regulan la transcripción en respuesta a las necesidades fisiológicas y las señales ambientales3.
La clamidia es una bacteria intracelular obligatoria responsable de una variedad de enfermedades en humanos y animales4,5,6,7,8. Por ejemplo, La clamidia trachomatis es posiblemente el patógeno de transmisión sexual número uno en humanos en todo el mundo, y una de las principales causas de ceguera en algunos países subdesarrollados4,5. La clamidia tiene un ciclo de desarrollo único caracterizado por dos formas celulares alternasque se denominan cuerpo elemental (EB) y reticulado cuerpo (RB) 9. Mientras que, los EB son capaces de sobrevivir en un entorno extracelular, son incapaces de proliferar. Los EB entran en las células huésped a través de la endocitosis y se diferencian en RBs más grandes en una vacuola en el citoplasma del huésped en cuestión de horas después de la inoculación. Ya no son infecciosos, los RAB proliferan a través de la fission binaria. Alrededor de 20 h, comienzan a diferenciar de nuevo a los EB, que salen de las células anfitrionas alrededor de 30-70 h.
La progresión del ciclo de desarrollo clamidia está regulada por la transcripción. Mientras que una supermayoría de los casi 1.000 genes clamidiados se expresan durante el ciclo medio durante el cual los BRAD se replican activamente, sólo un pequeño número de genes se transcriben inmediatamente después de la entrada de los EB en las células huésped para iniciar la conversión de Los EB en los BB, y otro pequeño conjunto de genes se transcriben o se transcriben cada vez más para permitir la diferenciación de los BB en los EB10,11.
El genoma chlamidia codifica tres factores de los que se codifican en los documentos66,28 y54. 66, que es equivalente a la limpieza70 de E. coli y otras bacterias, es responsable de reconocer a los promotores de genes de ciclo temprano y medio, así como a algunos genes tardíos, mientras que los modelos28 y54 son necesarios para la transcripción de ciertos genes tardíos. Se sabe que varios genes llevan tanto a un promotor dependientede66o 66 o a un promotor dependiente de28o2.
A pesar de un ciclo de desarrollo complicado, sólo un pequeño número de TFs se han encontrado en clamidia13. GrgA (anteriormente anotado como una proteína hipotética CT504 en C. trachomatis serovar D y CTL0766 en C. trachomatis L2) es un TF específico de Clamydiainicialmente reconocido como un activador de66genes dependientes14. Los ensayos desplegables de afinidad han demostrado que GrgA activa su transcripción al unir tanto el n.o66 como el ADN. Curiosamente, más tarde se encontró con que GrgA también coprecipita conel 28, y activa la transcripción de los promotores dependientes de28euros in vitro15. Para investigar si GrgA tiene afinidades similares o diferentes por66 y28euros, recurrimos al uso de BLI. Los ensayos de BLI han demostrado que GrgA interactúa conel 66 o 66 con una afinidad 30 veces mayor que conel 28,lo que sugiere que GrgA puede desempeñar roles diferenciales en la transcripción dependiente de66y la transcripción dependiente de28euros 15.
BLI detecta el patrón de interferencia de la luz blanca que se refleja a partir de una capa de proteína inmovilizada en la punta de un biosensor y lo compara con el de una capa de referencia interna16. A través del análisis de estos dos patrones de interferencia, BLI puede proporcionar información valiosa y en tiempo real sobre la cantidad de proteína unida a la punta del biosensor. La proteína que se inmoviliza a la punta del biosensor se conoce como el ligando, y generalmente se inmoviliza con la ayuda de un anticuerpo común o etiqueta de epítopo (por ejemplo, una etiqueta poli-His- o biotina) que tiene una afinidad por una partícula asociada (como NTA o Streptavidin) en la punta del biosensor. La unión de una proteína secundaria, conocida como analito, con el ligando en la punta del biosensor crea cambios en la opacidad del biosensor y, por lo tanto, da lugar a cambios en los patrones de interferencia. Cuando se repite sobre diferentes concentraciones del analito, BLI puede proporcionar no sólo información cualitativa, sino también cuantitativa sobre la afinidad entre el ligando y el analito16.
Hasta donde sabemos, fuimos los primeros en emplear a BLI para caracterizar las interacciones proteína-proteína en la transcripción15. En esta publicación, demostramos que un fragmento de GrgA, que anteriormente se mostraba necesario para el enlace de28euros, de hecho media el enlace. Este manuscrito se centra en los pasos de los ensayos BLI y la generación de gráficos BLI y parámetros de cinética de encuadernación. Los métodos para la producción (y purificación) de ligandos y analitos no están cubiertos aquí.
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Protocol
1. Preparación de proteínas
- Utilice una bolsa de diálisis (con un tamaño de corte adecuado) para dializar cada proteína que se utilizará para ensayos BLI (incluyendo el ligando con etiqueta His y el analito) contra 1.000 volúmenes del búfer BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , TDT de 0,1 mM, pH 8,0, preenfriado a 4oC) a 4oC durante 4 h.
NOTA: Los ensayos BLI requieren que el ligando esté presente en concentraciones que saturan los sitios de unión en el biosensor y el analito para ser altamente purificados de modo que se conozcan las concentraciones molares del analito que reaccionan con el ligando. Las metodologías para la expresión y purificación de proteínas etiquetadas con His y Strep no se tratan aquí, pero se pueden encontrar en las publicaciones anteriores14,15. Aunque este sistema no requiere que el ligando esté en forma altamente purificada, es esencial dializar incluso los ligandos no purificados al búfer BLI para minimizar los cambios en los patrones de interferencia de luz blanca causados por cualquier cambio en el búfer durante el ensayo. - Cambie al nuevo búfer BLI y continúe la diálisis durante otras 4 horas.
2. Configuración de la hidratación y el ensayo del biosensor
- Aproximadamente 10 minutos antes del inicio de un ensayo, la pipeta 200 l del búfer BLI en un tubo de PCR.
- Retire un biosensor Ni-NTA del embalaje original sosteniendo la amplia parte del biosensor con una mano enguantada.
- Coloque el biosensor sobre el tubo PCR de forma que solo la punta de vidrio del biosensor esté sumergida en el búfer BLI.
- Mantenga la punta del biosensor sumergida durante al menos 10 minutos para garantizar una hidratación completa.
- Verifique que la punta de vidrio del Ni-NTA-biosensor no toque nada que no sea el buffer BLI durante el paso anterior.
NOTA: Este protocolo utiliza un ni-NTA-biosensor junto con un ligando con etiqueta His. Si es necesario, un biosensor SA-Streptavidin se puede utilizar junto con un ligando biotintida en su lugar si: (i) tanto el ligando como el analito llevan una etiqueta Su etiqueta o (ii) ninguno de ellos lo hace.
- Verifique que la punta de vidrio del Ni-NTA-biosensor no toque nada que no sea el buffer BLI durante el paso anterior.
- Encienda la máquina BLItz.
- Asegúrese de que el equipo esté conectado al ordenador a través de un puerto de salida de datos USB en la parte posterior de la máquina.
- En el ordenador, abra el software asociado (por ejemplo, BLItz Pro) y haga clic en Advanced Kinetics en el lado izquierdo de la pantalla.
- En el software, escriba toda la información adecuada sobre el experimento (incluido el nombre del experimento, la descripción, el ID de muestra y la concentración de proteínas) en cada encabezado respectivo.
- Haga clic en Tipo de Biosensor y elija Ni-NTA en el menú desplegable.
- En el encabezado Configuración de ejecución, compruebe que el Agitador esté establecido en Habilitar.
- En el encabezado Lista de tipos de paso, compruebe que hay 5 elementos enumerados: Línea base inicial, Carga, Línea base, Asociación y Disociación.
NOTA: La duración de cada paso se puede cambiar de forma predeterminada según sea necesario. Para obtener resultados óptimos, utilice un mínimo de 30 s para la línea de base inicial y la línea de base; y 120 s para la Asociación y la Disociación. La duración del paso de carga (que oscila entre 120 y 240 s) dependerá de la concentración del ligando y la afinidad de la etiqueta His-epitope en el ligando al biosensor Ni-NTA.
- Retire el biosensor De-NTA hidratado del tubo PCR y fíjelo al soporte del biosensor en la máquina deslizando la amplia parte del biosensor sobre el soporte.
NOTA: No deje que el biosensor se seque durante el experimento. - Coloque un tubo de microcentrífuga negro de 0,5 ml en el soporte del tubo de la máquina y la pipeta 400 l del búfer BLI en él.
- Compruebe que el control deslizante de la máquina esté colocado de tal manera que el soporte del tubo esté situado delante de la flecha negra de la máquina.
- Cierre la cubierta de la máquina de modo que la punta del biosensor se sumerja en el tampón del tubo de microcentrífuga.
- Haga clic en Siguiente en el software para comenzar a grabar la línea base inicial.
3. Carga de ligando en el biosensor
- Una vez que el paso de línea base inicial haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
- Mueva el control deslizante hacia la derecha de forma que el soporte de caída (en lugar del soporte del tubo) esté situado delante de la flecha negra.
- Pipetear 4 l de un ligando marcado con etiqueta His (del paso 1.1) en el soporte de caída y cerrar la cubierta de la máquina.
NOTA: La concentración óptima del ligando a utilizar puede variar para cada proteína. Una concentración entre 1,0 y 2,0 mg/ml suele ser adecuada para saturar la NTA en la punta del biosensor en 240 s. - En el software, haga clic en Siguiente para comenzar a cargar.
4. Lavar ligando adicional
- Una vez que el paso de carga haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
- Mueva el control deslizante hacia la izquierda de forma que el soporte del tubo se sitúe una vez más delante de la flecha negra.
- Cierre la tapa de la máquina y asegúrese de que la punta del biosensor esté sumergida en el tampón BLI del tubo del soporte del tubo.
- Haga clic en Siguiente una vez más en el software para comenzar a grabar la línea de base.
5. Asociación de analito sin ligar
- Una vez que el paso De línea de base haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
- Retire el portagotas y límpielo pipeteando cualquier proteína y enjuajándola con agua de doble desionizada (ddH2O) para un total de 5 veces.
- Use una toallita de tejido para limpiar la superficie del soporte de gota después del lavado.
- Vuelva a colocar el soporte de caída en la máquina.
- Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha para que el soporte de caída se sitúe una vez más delante de la flecha negra.
- Pipetear 4 l de un analito dializado (del paso 1.1) en el soporte de caída y cerrar la cubierta de la máquina.
- En el software, haga clic en Siguiente para comenzar la asociación.
6. Disociación del analito del ligando
- Una vez que el paso de asociación haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
- Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha de tal manera que el soporte del tubo se sitúe una vez más delante de la flecha negra.
- En el software, haga clic en Siguiente para comenzar la disociación.
- Después de que el paso de disociación haya terminado de grabar, abra la cubierta de la máquina.
- Retire el soporte de gota y el soporte del tubo.
- Enjuague ambos con ddH2O a fondo para lavar cualquier proteína.
- Retire el biosensor y deséchelo de forma segura.
7. Repetir interacciones con diferentes concentraciones
- Repita los pasos 2-7 para el mismo par de ligando-analito utilizando diferentes concentraciones de analito.
NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la concentración del analito en varias carreras antes de obtener resultados óptimos. En nuestra experiencia, una proporción de 1:5:10 de concentraciones de analito, a partir de 75 nM, suele ser adecuada.
8. Análisis de los datos utilizando el software
- Una vez que todas las ejecuciones hayan terminado, guarde los datos en el software haciendo clic en Archivo y luego en Guardar experimento como en el lado izquierdo de la pantalla.
- En el encabezado Ejecutar datos, seleccione Corrección y ajuste de pasos (1:1) y haga clic en Analizar para generar datos cinéticos.
- Para extraer los datos cuantitativos en una hoja de trabajo y generar gráficos, haga clic en Exportar a CSV y guarde los datos grabados como un archivo .csv. Abra el archivo .csv con el software de hoja de cálculo.
- Para mostrar de la forma más eficaz la cinética Asociación y Disociación, elimine todos los puntos de trazado antes del paso Línea de base y normalice todos los puntos de trazado posteriores del valor de línea base final.
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Representative Results
A través de los ensayos de BLI, previamente establecimos que la unión de GrgA a28 euros depende de una región media de 28 aminoácidos (residuos 138-165) de GrgA15. En consecuencia, en comparación con N-terminally His-tagged Full length GrgA (NH-GrgA), una construcción de eliminación de GrgA que carecía de esta región (NH-GrgA-138-165) tuvo una tasa de asociación disminuida y una tasa de disociación creciente, lo que llevó a una pérdida de 3 millones de afinidad (Tabla 1). Aquí, demostramos que esta región media se une directamente a28 euros en ausencia del resto de la proteína GrgA. En estos experimentos, la región media etiquetada con una etiqueta N-terminally His (NH-GrgA138-165) se utilizó como ligando, que primero fue inmovilizado a la punta de un biosensor Ni-NTA (Figura1A). Después de lavar NH-GrgA138-165 sin ataduras del biosensor, se registró una asociación en tiempo real con el analito28 tras la adición de28euros. Finalmente, la disociación en tiempo real se registró después del lavado. Las grabaciones de experimentos con tres concentraciones de analitodiferentes diferentes a partir de 30 s antes de la unión de ligandos y terminando 2 minutos después del comienzo del lavado se muestran en la Figura 1A. Para visualizar mejor la interacción ligando-analito, eliminamos los datos antes de la adición del ligando y restablecemos la línea de base a 0 para derivar la Figura 1B.
En la Tabla 1se presentan los valores de los parámetros cinéticos para la interacción del fragmento NH-GrgA138-165 con el n.o28. En comparación con la interacción NH-GrgA X x28, la interacción NH-GrgA138-165 X 28 mostró una reducción estadísticamente significativa del 60% en ka , un aumento del 64% de la , y un aumento de 3,5 veces estadísticamente significativo en KD. Estos cambios demuestran que, en comparación con NH-GrgA, NH-GrgA138-165 se une28 más lentamente, se disocia a partir de28 o 28 o 28 euros más rápido y tiene una menor afinidad general con28euros. Por lo tanto, los residuos 138-165 en GrgA se unen a28, pero con una afinidad reducida en comparación con grgA de longitud completa.
Figura 1: Una región media de 28 aminoácidos de GrgA se une a28 in vitro.
(A) Cambios en tiempo real en los patrones de interferencia de luz registrados en cuatro etapas: (i) unión de NH-GrgA138-165 (Ligand) a un biosensor Ni-NTA, (ii) lavado, (iii) unión de NS-o28 (Analito) a diferentes concentraciones a los inmovilizados NH-GrgA-138-165 (Ligand), y (iv) lavado posterior. (B) Visualización mejorada de la asociación de ligando-analito y disociación tras la eliminación de valores en las dos primeras etapas de (A) y el restablecimiento de la línea de base. El panel B se modifica de Desai et al., 201815. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ligando | N | ka | kd | KD | Referencias | |||||||||||
| 1/Ms | % de control | 1/s | % de control | M | % de control | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 x 1,7) x 104 | 100 | (2,8 x 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 x 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgA-138-165 | 2 | (5,6 x 0,1) x 103 | 37 | (4,1 x 0,3) x 102 | 1.5 x 107 | (6,9 x 4,5) x 10-2 | 3.1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| pág. 0,125 | p<0.002 | p<0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 x 1,0) x 103 | 40 | (4,6 x 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 x 0,3) x 10-7 | 350 | Este estudio | ||||||||
| pág. 0,074 | pág. 0,006 | p<0.001 | ||||||||||||||
Tabla 1: Un mutante de GrgA, que contiene sólo residuos de aminoácidos 138-165, se une a28 a pesar de una menor afinidad en comparación con el GrgA de longitud completa.
Los ensayos de BLI se realizaron con biosensores Ni-NTA usando GrgA de longitud completa o mutantes de eliminación como ligandos y Strep-etiquetado strep purificado como analito. Los gráficos de las grabaciones se muestran en la Figura1. Se generaron valores de parámetros cinéticos (promedios de desviaciones estándar) con el software asociado17. k a (constante de tasa de asociación) se define como el número de complejos formados por s en una solución de 1 molar de A y B. kd (constante de tasa de disociación) se define como el número de complejos que se descomponen por segundo. K D (constante de equilibrio de disociación), definida como la concentración en la que el 50% de los sitios de unión de ligandos están ocupados por los analitos, es kd dividido por ka . n, número de repeticiones experimentales. los valores p se calcularon utilizando las pruebas t de 2 colas de Student. Los parámetros cinéticos para NH-GrgA y NH-GrgA-138-165 eran de Desai et al., 201815.
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Discussion
Las interacciones proteínas-proteínas son cruciales para la regulación de la transcripción y otros procesos biológicos. Se estudian más comúnmente a través de ensayos desplegables. Aunque los ensayos desplegables son relativamente fáciles de realizar, son poco cuantitativos y pueden no detectar interacciones débiles pero biológicamente significativas. En comparación, al detectar la asociación y disociación en tiempo real entre un ligando y un analito, BLI proporciona constantes de tasa de asociación y disociación, así como, afinidad general.
En comparación con los ensayos desplegables, los ensayos BLI ofrecen una mayor sensibilidad. Por ejemplo, las interacciones GrgA-28 se detectan con concentraciones más bajas de nM de analitos por BLI, pero no mediante ensayos desplegables (datos no publicados). A diferencia de la extracción, BLI no se basa en un anticuerpo de detección, lo que puede afectar significativamente a la sensibilidad.
Lo que es más importante, los análisis de BLI pueden proporcionar información mecanicista sobre la interacción entre las proteínas, mientras que los ensayos desplegables no pueden. Esto se ejemplifica con las interacciones de28 s con diferentes construcciones de GrgA. En comparación con NH-GrgA, NH-GrgA-138-165 y NH-GrgA138-165 sufren sólo una pérdida del 60% en k a en la unión 28 . Estos hallazgos son consistentes con nuestros datos anteriores de BLI que muestran que GrgA carente de sus residuos N-terminal 64 tiene una menor afinidad con el n.o28,lo que sugiere que la secuencia N-terminal de GrgA contribuye a la unión de28 euros. Aunque NH-GrgA-138-165 y NH-GrgA138-165 tienen valores k similares en la unión28,el primero tiene un kd de 91.000 veces más alto que el segundo. Estos resultados indican que la unión de 138-165 desencadena cambios estructurales en GrgA, estabilizando en gran medida el complejo.
Con una historia más larga que BLI, la resonancia de plasmón superficial (SPR) también puede cuantificar las interacciones proteína-proteína en tiempo real18,19. Si bien se cree que la sensibilidad de la BLI es inferior a la del SPR20,el primero actualmente supera a este último en rentabilidad. Por ejemplo, los costos de los biosensores SPR son mucho más altos que los de los biosensores BLI.
Debido a la naturaleza del principio subyacente de la SPR, está fuertemente influenciado por las microfluídicos de los medios que rodean la proteína. Por lo tanto, los experimentos que involucran algunos instrumentos SPR requieren una percepción considerable por parte del investigador para garantizar condiciones óptimas de amortiguación21,22,23,24. Por otro lado, los instrumentos BLI actuales cuentan con un rango de control de temperatura muy limitado25 y, como tal, no están equipados para determinar parámetros termodinámicos (como la entalpía y la energía libre de Gibbs) para una interacción dada.
El glicerol, un crioprotector de uso común, es incompatible con BLI, a pesar de su amplia compatibilidad química. Por lo tanto, es fundamental eliminar el glicerol del ligando y el analito mediante diálisis. Las proteínas resultantes libres de glicerol deben almacenarse a 4 oC, lo que puede dar lugar a una mayor inestabilidad y parámetros cinéticos inexactos. Recomendamos que los ensayos BLI se realicen poco después de la diálisis, especialmente si se obtienen parámetros cinéticos inconsistentes en diferentes momentos. El marco de tiempo exacto dentro del cual deben completarse los ensayos BLI variará entre las proteínas y se verá afectado por sus concentraciones.
Al igual que con SPR, BLI se ha utilizado para el cribado de moléculas pequeñas26. Teniendo en cuenta que los instrumentos BLI más nuevos ofrecen opciones de alto rendimiento para el cribado, prevemos que BLI puede llegar a ser muy útil para la identificación y caracterización de moléculas pequeñas que facilitan o interfieren con las interacciones proteína-proteína.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Grants AI122034 y AI140167) y La Fundación de La Salud de Nueva Jersey (Grant - PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
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