Summary
RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA 'nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.
Abstract
Transkripsiyon faktörü (TF), RNA polimeraz, başka bir TF ve/veya şablon DNA 'Sı ile etkileşime girerek gen ifadesini düzenleyen bir proteindir. Grga, özellikle zorunlu hücre içi bakteriyel patojen klamidya 'da bulunan yeni bir transkripsiyon aktivatörü. Benzeşme boncukları kullanarak protein PULLDOWN asdiyor GrgA iki σ faktörleri bağlar ortaya çıktı, yani σ66 ve σ28, hangi ürünleri farklılaşarak gelişimsel aşamalarında gerekli genler için organizatörler farklı setleri tanımak. Biz onaylamak ve daha fazla etkileşimleri karakterize BLı kullandık. BLI PULLDOWN üzerinde çeşitli avantajları gösterir: 1) bu bağlama ortakları arasında gerçek zamanlı dernek ve ayrışma ortaya çıkarır, 2) bu nicel kinetik parametreler üretir Bu özellikler, Chlamydia'daki gen ifade yönetmeliğinde Grga 'nın fizyolojik rollerini ve olası detaylı etkileşim mekanizmalarını anlamak için bize olanak sağladı. Biz bu nispeten ekonomik teknoloji son derece transkripsiyon ve diğer biyolojik süreçler eğitim için yararlı olabilir hayal.
Introduction
DNA 'yı şablon olarak kullanan RNA molekülleri üreten transkripsiyon, Gen ifadesinin ilk adımıdır. RNA polimeraz (RNAP) holoenziminin bir hedef promotör1,2' ye bağlanması sonrasında bakteriyel RNA sentezi başlar. RNAP holoenzim (RNAPholo), organizatör sırasını tanımak için gerekli olan Multi-subunit katalitik çekirdeğinden (RNAPcore) ve σ faktörden oluşur. Transkripsiyon aktivizörleri ve baskıcılar, topluca TFs olarak adlandırılan, RNAPcore, σ faktörleri ve/veya DNA bağlayıcı bileşenleri ile gen ifadesi düzenler. Organizmaya bağlı olarak, genomunun önemli bir kısmı, fizyolojik ihtiyaçlara ve çevresel ipuçları3' e yanıt olarak transkripsiyon düzenleyen TFs 'ye tahsis edilebilir.
Klamidya insan ve hayvanların çeşitli hastalıklarından sorumlu bir zorunlu hücre içi bakterinin4,5,6,7,8. Örneğin, klamidya trachomatis tartışmasız insanlarda dünya çapında bir numaralı cinsel yolla bulaşan patojen ve bazı az gelişmiş ülkelerde körlük önde gelen nedeni4,5. Klamidya , temel vücut (EB) ve retikül vücut (RB)9olarak adlandırılan iki alternatif hücresel form ile karakterize benzersiz bir gelişim döngüsüne sahiptir. Ancak EBs, hücre dışı bir ortamda hayatta kalabiliyorlar, proliferasyon kabiliyetine sahip değiller. EBs, ana hücreleri endositoz yoluyla girip, ana sitoplazmada bir vakumda daha büyük RBs 'e, sonrası inokülasyon saatleri içinde ayırt ederler. Artık bulaşıcı değil, RBS ikili Fission ile çoğalırlar. Yaklaşık 20 h, onlar geri EBs ayırt etmeye başlar, hangi 30-70 civarında ana hücre çıkış h.
Klamidya gelişimsel döngüsünün ilerlemesi transkripsiyon ile düzenlenir. Yaklaşık 1.000 klamidya genlerinin bir büyük çoğunluğu, RBs 'nin aktif olarak çoğaldığı orta döngü sırasında ifade edilse de, sadece az sayıda gen, EBs 'nin girdinin ana hücrelerine girilmesinden hemen sonra dönüştürülmesini başlatmak için yazılmış EBs, RBs içine ve başka bir küçük genleri kümesi, KBS, EBs10,11farklılaşma sağlamak için transkripsiyonu veya giderek transkripsiyonu.
Klamidya genomu σ66, σ28 ve σ54gibi üç σ faktörü kodlıyor. E. coli ve diğer bakterilerin σ70 temizliği ile eşdeğer olan σ66, erken ve orta döngüdeki genlerin yanı sıra bazı geç genler ile ilgili promotörler tanınması nedeniyle, σ28 ve σ54 için gerekli olan Bazı geç genlerin transkripsiyonu. Çeşitli genlerin hem σ66bağlı promotör hem de σ28bağımlı Organizatör12' ye taşınması bilinmektedir.
Karmaşık bir gelişimsel döngüye rağmen, Chlamydiales13' te yalnızca az sayıda TFs bulunmuştur. GrgA (önceden varsayımsal bir protein CT504 c. trachomatis serovar D ve CTL0766 c. trachomatis L2) olarak açıklamalı bir klamidyaözgü TF başlangıçta σ66-bağımlı genler14aktivatörü olarak kabul edilir. Benzeşimi PULLDOWN deneyleri Grga hem σ66 ve DNA bağlayarak kendi transkripsiyon aktive gösterdiğini göstermiştir. İlginç bir şekilde, daha sonra bu GrgA ile σ28ile birlikte çökerek bulundu ve σ28' den bağımlı promotörler in vitro15' ten transkripsiyon aktifleştirir. GrgA 'nın σ66 ve σ28için benzer veya farklı benzerlikleri olup olmadığını araştırmak için Bli 'yi kullanmaya başvurdular. BLı asder, GrgA 'nın σ66 ile bir 30 kat daha yüksek benzeşte σ28Ile etkileşiminin, grga 'nın σ66bağımlı transkripsiyon ve σ28bağımlı transkripsiyon içinde diferansiyel roller oynayabilir olduğunu göstermiştir 15 yaşında.
BLI bir biyosensör ucunda immobilize protein katmanından yansıtan beyaz ışık girişim deseni algılar ve bir iç referans katmanı16karşılaştırır. Bu iki girişim deseninin analizi sayesinde BLı, biyosensörün ucuna bağlı protein miktarı hakkında değerli ve gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Biyosensör ucunu immobilize protein ligand olarak adlandırılır ve genellikle ortak bir antikor veya epitopu etiketi yardımıyla immobilize (örneğin, bir Poly-onun-veya biotin-Tag) bir ilişkili parçacık için bir yakınlık vardır (gibi NTA veya Streptavidin) biosensor ucunda. Biyosensörün ucunda ligand ile analit olarak adlandırılan ikincil bir proteinin bağlanması, biosensörlerin opaklığındaki değişimlere neden olur ve bu nedenle girişim desenlerinin değişikliklerine neden olur. Analitin farklı konsantrasyonlarda tekrarlandığında, BLI sadece nitel değil, aynı zamanda ligand ve analit16arasındaki yakınlık hakkında niceliksel bilgiler sağlayabilir.
Bilgimizin en iyisi, biz transkripsiyon15protein-protein etkileşimlerini karakterize etmek için BLI istihdam ilk oldu. Bu yayında, daha önce σ28bağlayıcı için gerekli olduğu gösterilmiştir bir Grga parçası, gerçekten bağlayıcı aracılık gösterir. Bu yazıda BLı 'nin adımları ve bağlayıcı kinetiklerin BLı grafikleri ve parametreleri oluşturulması üzerinde duruluyor. Ligin ve analitlerin üretim (ve arıtma) yöntemleri burada kapsamındadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. proteinlerin hazırlanması
- Bir diyaliz çantası kullanın (uygun bir cut-off boyutu ile) BLI olarak kullanılan her protein Dialyze için (hem onun tarafından etiketlenmiş ligand ve analit dahil) BLı tampon 1.000 hacimleri karşı (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, 4 °c ' ye ön soğutulmuş) 4 °C için 4 h.
Not: BLı asder, ligand, biyosensördeki bağlayıcı siteleri doyuran konsantrasyonlarda ve analitin ligle reaksiyon gösteren molar konsantrasyonlarının bilinmesi için yüksek derecede arındırılmış olması gerekir. Onun-ve strep etiketli proteinlerin ifade ve arıtma metodolojileri burada kapsanmaz, ancak önceki yayınlarda14,15' te bulunabilir. Bu sistem ligand yüksek derecede arıtılmış formda olmasını gerektirmez, ancak test sırasında herhangi bir arabellek değişiklikleri neden beyaz ışık girişim desenleri vardiyaları en aza indirmek için BLI tampon bile saflaştırılmamış Ligleri Dialyze esastır. - Taze BLı tampon geçiş ve başka bir 4 h için diyaliz devam.
2. biyosensör hidrasyon ve tahlil ayarlama
- Yaklaşık 10 dakika önce bir tahlil başlamadan, pipet 200 μL BLı tampon bir PCR tüp içine.
- Biyosensörün geniş kısmını eldiven ile tutarak orijinal ambalajından bir ni-NTA-biyosensör çıkarın.
- Biosensörün BLı tamponunun içinde sadece biyosensörün cam ucunun batacağı şekilde PCR-Tube üzerine yerleştirin.
- Tam hidrasyon sağlamak için biyosensör ucunu en az 10 dakika boyunca alt edin.
- Ni-NTA-biosensörün cam ucunun, yukarıdaki adımda BLI tampondan başka bir şeye dokunmaz olduğunu doğrulayın.
Not: Bu protokol bir nı-NTA-biosensor bir onun tarafından etiketlenmiş ligand ile birlikte kullanır. Gerekirse, bir sa-streptavidin-biyosensör bir biyotinlenmiş ligand ile birlikte kullanılabilir: (ı) hem ligand ve analit bir onun etiketi taşımak veya (II) hiçbiri yok.
- Ni-NTA-biosensörün cam ucunun, yukarıdaki adımda BLI tampondan başka bir şeye dokunmaz olduğunu doğrulayın.
- BLItz makinesini açın.
- Makinenin bilgisayarın arkasındaki USB veri çıkış bağlantı noktası üzerinden bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.
- Bilgisayarda, ilişkili yazılımı (örn., BLItz Pro) açın ve ekranın sol tarafındaki Gelişmiş kinetiği tıklayın.
- Yazılım üzerinde, ilgili her başlık altında deneyle ilgili tüm uygun bilgileri (deneme adı, açıklama, örnek KIMLIĞI ve protein konsantrasyonu dahil) yazın.
- Biosensor türü tıklayın ve açılır menüden nı-NTA seçin.
- Çalıştır ayarları başlığının altında, çalkalayıcı 'nın Etkinleştirolarak ayarlandığını doğrulayın.
- Adım türü listesi başlığı altında 5 öğe listelendiğini doğrulayın: başlangıç temel, yükleme, temel, Ilişkilendirme ve dissociation.
Not: her adımın süresi gerektiği gibi varsayılan olarak değiştirilebilir. En iyi sonuçlar için, başlangıç taban çizgisi ve taban çizgisi için en az 30 sn kullanın; ve 120 dernek ve dissociation için s. Yükleme adımının süresi (120 ila 240 s arasında değişen), ligand üzerindeki onun-epitope etiketinin ligand ve yakınlık konsantrasyonuna göre ni-NTA-biyosensörüne bağlıdır.
- Hidralı ni-NTA-biyosensör ' i PCR tüpünden çıkarın ve biosensörün geniş kısmını montajın üzerine kaydırarak makinenin üzerindeki biyosensör montajına takın.
Not: deney sırasında biyosensörün kurumasına izin vermeyin. - 0,5 mL 'Lik siyah mikrosantrifüjli tüpü makinenin tüp tutucusuna yerleştirin ve BLı tamponunun 400 μL pipet içine takın.
- Makinenin kaydırıcının, tüp tutucunun makinenin üzerindeki siyah okun önünde yer alan şekilde konumlandırıldığından emin olun.
- Mikrosantrifüjlü tüpteki tamponda biyosensör ucunun batacağı şekilde makinenin kapağını kapatın.
- Ilk taban çizgisini kaydetmeye başlamak için yazılım üzerinde İleri 'yi tıklatın.
3. biyosensör üzerine ligand yükleme
- Başlangıç taban çizgisi adımı kaydı tamamlandıktan sonra makinenin kapağını açın.
- Kaydırıcıyı sağa doğru taşıyın, böylece damla tutucu (tüp tutucu yerine) siyah okun önünde yer alır.
- Pipet 4 μL bir Medil onun tarafından etiketlenmiş ligand (adım 1,1) damla tutucu üzerine ve makinenin kapağını kapatın.
Not: kullanılmak üzere ligand optimum konsantrasyon her protein için farklılık gösterebilir. 1,0 ila 2,0 mg/ml arasında bir konsantrasyon genellikle 240 s biyosensör ucunda NTA doyurmak için yeterlidir. - Yazılım üzerinde, yüklemeye başlamak için İleri 'yi tıklatın.
4. ek ligand yıkama
- Yükleme adımı kaydı tamamlandıktan sonra makinenin kapağını açın.
- Tüp tutucu bir kez daha siyah ok önünde yer alır gibi kaydırıcıyı sola taşıyın.
- Makinenin kapağını kapatın ve biyosensör ucunun tüp tutucudan gelen tüpün BLı tamponunun içine batdığından emin olun.
- Temel kayıt başlatmak için yazılım üzerinde bir kez daha İleri ' yi tıklatın.
5. dernek analit ligand için
- Temel adım kaydı tamamlandıktan sonra makinenin kapağını açın.
- Damla tutucu çıkarın ve herhangi bir protein pipetleme ve çift deiyonize su ile durulama ile temizleyin (ddH2O) Toplam 5 kez.
- Yıkama sonra damla tutucu yüzeyini temizlemek için bir doku silmek kullanın.
- Damla tutucuyu tekrar makineye yerleştirin.
- Makine üzerindeki kaydırıcıyı sağa doğru taşıyın, böylece damla tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer alır.
- 4 μL bir Medil analit pipet (adım 1,1) damla tutucu üzerine ve makinenin kapağını kapatın.
- Yazılım üzerinde, Ilişkilendirmeyi başlatmak için İleri 'yi tıklatın.
6. ligand 'den analitin dağılma
- Dernek adımı kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın.
- Makinenin üzerindeki kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, böylece tüp tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer alır.
- Yazılım üzerinde, dissociation başlamak için İleri ' yi tıklatın.
- Dissociation adım kayıt bittikten sonra, makinenin kapağını açın.
- Damla tutucuyu ve tüp tutucuyu çıkarın.
- Herhangi bir proteini yıkamak için ddH2O ile iyice durulayın.
- Biosensörü çıkarın ve güvenli bir şekilde atın.
7. farklı konsantrasyonlarda etkileşimler tekrarlanan
- Farklı analit konsantrasyonları kullanarak aynı ligand-analit çifti için 2-7 adımları yineleyin.
Not: analitin konsantrasyonunun optimum sonuçlar elde etmeden önce birkaç çalıştırma boyunca ayarlanması gerekebilir. Deneyimimizde, 75 nM ile başlayan analit konsantrasyonlarının 1:5:10 oranı genellikle yeterlidir.
8. yazılımı kullanarak verileri analiz etme
- Tüm çalışır bittikten sonra, dosyayı tıklatarak yazılım verileri kaydedin ve sonra ekranın sol tarafında olarak deneme kaydedin .
- Veri Çalıştır başlığının altında adım düzeltmesi ve sığdırma (1:1) öğesini seçin ve kinetik veriler oluşturmak için analiz et 'i tıklatın.
- Nicel verileri bir çalışma sayfasına ayıklamak ve grafikler oluşturmak için CSV 'ye dışa aktar 'ı tıklatın ve kaydedilmiş verileri bir. csv dosyası olarak kaydedin. Elektronik tablo yazılımını kullanarak. csv dosyasını açın.
- Dernek ve dissociation kinetiği en etkili şekilde göstermek için, temel adımından önce tüm çizim noktalarını kaldırın ve sonraki tüm çizim noktalarını son taban çizgisi değerinden Normalleştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BLı sayesinde, daha önce σ28 ' e Grga bağlanması, Grga15' in 28 amino asit orta bölgesine (kalıntıları 138-165) bağlı olduğunu tespit ettik. Buna göre, N-Terminally onun etiketli tam uzunlukta Grga (NH-Grga), bu bölge (NH-grgaδ 138-165) eksik bir Grga silme yapı ile karşılaştırıldığında bir azalan dernek oranı ve artan ayrışma oranı, genel bir 3.000.000-kat kaybına yol benzeşimi (Tablo 1). Burada, bu Orta bölgenin doğrudan σ28 ' i Grga proteininin yokluğunda bağlamalarını gösteriyoruz. Bu deneylerde, N-Terminally onun-Tag (NH-GrgA138-165) ile etiketlenmiş orta bölge, ilk olarak bir ni-NTA biyosensörünün ucuna immobilize olan ligand olarak kullanılmıştır (Şekil 1a). Biosensörün ilişkisiz NH-GrgA138-165 ' i yıkandıktan sonra σ 28 ' in eklenmesiyle birlikte gerçek zamanlı Son olarak, gerçek zamanlı ayrışma yıkama sonrasında kaydedildi. Üç farklı analitik konsantrasyonu ile ligand bağlayıcı önce 30 s başlayan ve yıkama başlangıcından sonra 2 dakika biten deneylerin kayıtları Şekil 1a'da gösterilir. Ligand-analyte etkileşimi daha iyi görselleştirmek için, ligand eklenmeden önce verileri kaldırıp Şekil 1B'yi türetmek için taban çizgisini 0 ' a sıfırlayın.
Σ28 ile NH-GrgA138-165 parça etkileşimi için kinetik parametrelerin değerleri Tablo 1' de sunulmaktadır. NH-GrgA X σ28 etkileşimi ile KARŞıLAŞTıRıLDıĞıNDA, NH-GrgA138-165 X σ28 etkileşimi, k a'da istatistiksel olarak önemli bir ölçüde% 60 azalma, kd 'de oldukça istatistiksel olarak anlamlı% 64 artış gösteriliyor ve KD'de son derece istatistiksel olarak önemli 3,5 kat artış Bu değişiklikler, NH-GrgA ile karşılaştırıldığında, NH-GrgA138-165 σ28 ' i daha yavaş bağlar, σ28 ' den daha hızlı ayırır ve σ28ile genel yakınlık azalmış olur. Bu nedenle, GrgA 'daki kalıntı 138-165, σ28 ' e bağlanır ancak tam uzunlukta Grga 'ya kıyasla azaltılmış benzeşimi vardır.
Şekil 1: A 28 amino asit orta bölge GrgA bağlar σ28 in vitro.
(A) dört aşamada kaydedilen ışık girişim desenlerinin gerçek zamanlı değişiklikleri: (i) NH-GrgA138-165 (Ligand) ' ın bir nı-NTA biyosensörüne bağlanması (ii) yıkayın, (iii) farklı KONSANTRASYONLARDA NS-σ28 (analyte) bağlantısını immobilize NH-GrgA-138-165 (Ligand) ve (IV) sonraki yıkama. (B) ilk iki aşamada değerlerin kaldırılması aşağıdaki ligand-analit Birliği ve ayrışma gelişmiş görselleştirme (A) ve temel Sıfırla. B paneli Desai ve ark., 201815. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Ligand | n | kadira | kadird | kadirD | Başvuru | |||||||||||
| 1/MS | % Denetim | 1/s | % Denetim | M | % Denetim | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 ± 1,7) x 104 | 100 | (2,8 ± 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 ± 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ 138-165 | 2 | (5,6 ± 0,1) x 103 | 37 | (4,1 ± 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 ± 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p = 0.125 | p < 0.002 | p < 0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 ± 1,0) x 103 | 40 | (4,6 ± 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 ± 0,3) x 10-7 | 350 | Bu çalışma | ||||||||
| p = 0.074 | p = 0.006 | p < 0.001 | ||||||||||||||
Tablo 1: sadece amino asit kalıntıları 138-165 içeren GrgA bir mutant, tam uzunlukta GrgA kıyasla daha düşük yakınlık rağmen σ28 bağlar.
BLı asdiyor ni-NTA biyosensörler ile onun-etiketli tam uzunluklu GrgA veya silme mutantlar ligleri ve saflaştırılmış strep etiketli σ28 bir analit olarak kullanılarak yapılmıştır. Kayıt grafikleri Şekil 1' de gösterilir. Kinetik parametrelerin değerleri (ortalamalar ± standart sapmalar) ilişkili yazılım17ile oluşturuldu. k a (dernek oranı sabiti), a ve B. kd 'nin 1 molar çözeltisinde s başına oluşturulan kompleksleri sayısı olarak tanımlanır (dissosyasyon hızı sabiti), saniyedeki çürüme kompleksler sayısı olarak tanımlanır. K D (dissosyasyon denge sabiti), ligand bağlayıcı sitelerin% 50 ' inin analitler tarafından işgal edildiği konsantrasyon olarak tanımlanan kD kabölünmüştür. n, deneysel tekrarlar sayısı. p değerleri 2 kuyruklu öğrencinin t testleri kullanılarak hesaplanmıştır. NH-GrgA ve NH-GrgAΔ 138-165 için kinetik parametreler Desai et al., 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein etkileşimleri transkripsiyon ve diğer biyolojik süreçlerin düzenlenmesi için çok önemlidir. En sık PULLDOWN öğrenimi ile incelenmiştir. PULLDOWN analizlerinin gerçekleştirmek nispeten kolay olmasına rağmen, onlar kötü niceliksel ve zayıf ama biyolojik olarak anlamlı etkileşimleri algılamak için başarısız olabilir. Karşılaştırıldığında, bir ligand ve bir analit arasında gerçek zamanlı dernek ve ayrışma tespit ederek, BLI ilişkilendirme ve ayrışma oranı sabitler, yanı sıra, genel benzeşimi sağlar.
BLı, daha yüksek hassasiyet sunar. Örneğin, GrgA-σ28 ETKILEŞIMLERI BLI tarafından daha düşük nm konsantrasyonları ile algılanır, ancak PULLDOWN (yayımlanmamış veriler) tarafından değil. PULLDOWN aksine, BLı duyarlılık önemli ölçüde etkileyebilir bir algılama antikor, güvenmez.
Daha da önemlisi, BLı analizleri, proteinler arasındaki etkileşimle ilgili mekanik öngörüler sağlayabilir, ancak PULLDOWN çalışmaları yapamaz. Bu, σ28 ' ın farklı Grga yapıları ile etkileşimleriyle örneklenmiştir. NH-GrgA, NH-GrgAΔ 138-165 ve NH-GrgA138-165 ile karşılaştırıldığında σ28' deki ka 'da sadece% 60 ' lık bir kaybı yaşayacaktır. Bu bulgular, Grga 'nın N-terminal 64 kalıntılarının eksikliğini gösteren önceki BLı verilerimiz ile tutarlı, σ28ile azaltılmış bir yakınlık vardır, Grga N-terminal dizisinin σ28 bağlayıcı katkısı olduğunu düşündürmektedir. NH-GrgAΔ 138-165 ve NH-GrgA138-165, σ28' e benzer k değerlerine sahip olsa da, eski bir 91.000-kat daha yüksek kd ikincisi daha vardır. Bu sonuçlar, 138-165 bağlama GrgA yapısal değişiklikleri tetikler, büyük ölçüde karmaşık stabilize olduğunu gösterir.
Bli 'den daha uzun bir geçmişle, yüzey plasmon rezonans (SPR) da gerçek zamanlı protein-protein etkileşimlerini ölçülebilir18,19. BLı duyarlılık SPR20daha düşük olduğu düşünülmektedir iken, eski Şu anda maliyet-etkinliği ikincisi aşılacak. Örneğin, SPR biyosensörlerin maliyetleri BLı biyosensörlerden çok daha yüksektir.
SPR temel ilkesinin doğası nedeniyle, protein çevreleyen medyanın Mikroakiskan sistemler ağır etkilenir. Bu nedenle, bazı spr aletleri içeren deneyler en iyi tampon koşulları21,22,23,24sağlamak için araştırmacı bölümünde önemli algı gerektirir. Öte yandan, mevcut BLı aletleri çok sınırlı bir sıcaklık kontrol aralığı25 özelliği ve bu nedenle, belirli bir etkileşim için termodinamik parametreleri (entalpi ve Gibbs serbest enerji gibi) belirlemek için kötü monte edilmiştir.
Yaygın olarak kullanılan bir kriyoprotektan olan gliserol, geniş kimyasal uyumluluğuna rağmen BLı ile uyumsuzdur. Bu nedenle, Dializ tarafından ligand ve analit gliserol kaldırmak için önemlidir. Elde edilen gliserol içermeyen proteinler 4 °C ' de depolanmalıdır, bu da istikrarsızlık ve yanlış kinetik parametrelere yol açabilir. Özellikle tutarsız kinetik parametreler farklı zamanlarda elde ediliyorsa, BLı 'nın diyaliz sonrası kısa sürede gerçekleştirilmesi önerilir. BLı 'nin tamamlanması gereken tam zaman dilimi proteinler arasında farklılık gösterecektir ve konsantrasyonlarından etkilenir.
SPR gibi, BLı küçük molekül taraması için kullanılmıştır26. Yeni BLı enstrümanların tarama için yüksek verimlilik seçenekleri sunmasını göz önünde bulundurarak, BLı 'nın protein-protein etkileşimlerini kolaylaştıran veya engelleyen küçük moleküllerin tanımlanması ve karakterize edilmesi için çok yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Ulusal Enstitüleri (hibe # AI122034 ve AI140167) ve New Jersey Sağlık Vakfı (Grant # PC 20-18) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
