Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتقنية الهضم على الغشاء لإعداد عينات لقياس الطيف الكتلي. تسهل هذه التقنية التحليل المريح للتفاعلات بين البروتين والبروتين.
Abstract
العديد من البروتينات داخل الخلايا تتفاعل جسديا وفقا لظروفها داخل الخلايا وخارج الخلية. في الواقع، تعتمد الوظائف الخلوية إلى حد كبير على تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. ولذلك، فإن البحوث المتعلقة بهذه التفاعلات لا غنى عنها لتيسير فهم العمليات الفسيولوجية. يمكن التهطول المشترك للبروتينات المرتبطة بها، متبوعًا بتحليل الطيف الكتلي (MS)، تحديد تفاعلات البروتين الجديدة. في هذه الدراسة، قدمنا تفاصيل تقنية جديدة من المناعية هطول الأمطار السائلة الكروماتوغرافيا (LC)-MS / MS تحليل جنبا إلى جنب مع الهضم على الغشاء لتحليل التفاعلات بين البروتين والبروتين. هذه التقنية مناسبة للمناعة الخام ويمكن أن تحسن الإنتاجية من التحليلات البروتيومية. وقد عجلت البروتينات المؤتلفة الموسومة باستخدام أجسام مضادة محددة؛ بعد ذلك، تعرض علماء المناعة المناوئون على قطع غشاء الديفيلوريد البولي فينيليدين إلى الألكلة الاختزالية. بعد التجرب، تم تحليل بقايا البروتين المهضوم باستخدام LC-MS/MS. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من تحديد العديد من البروتينات المرتبطة بالمرشح. وبالتالي، فإن هذه الطريقة مريحة ومفيدة لتوصيف التفاعلات الجديدة بين البروتين والبروتين.
Introduction
على الرغم من أن البروتينات تلعب أدوارًا تأسيسية في الكائنات الحية، إلا أنها يتم تصنيعها ومعالجتها وتدهورها باستمرار في البيئة داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تتفاعل البروتينات داخل الخلايا في كثير منالأحيان جسديا وكيميائيا بيولوجيا، مما يؤثر على وظيفة واحد أو كليهما 1،2،3. على سبيل المثال، الربط المباشر للبروتين المتجانس المرتبط بـ spliceosome CWC22 مع عامل بدء الترجمة eukaryotic 4A3 (eIF4A3) ضروري لتجميع مجمع تقاطع الإكسون4. وتماشيا مع ذلك، فإن متحولة eIF4A3 التي تفتقر إلى التقارب لCWC22 يفشل في تسهيل تقاطع exon معقدة يحركها mRNA الربط4. وهكذا، فإن دراسة تفاعلات البروتين أمر بالغ الأهمية لفهم دقيق للتنظيم الفسيولوجي وكذلك للوظائف الخلوية.
وقد تم تطبيق التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي (MS) على التحليل الشامل للتفاعلات البروتينالبروتينية. على سبيل المثال، يمكن الترسيب المشترك للبروتينات الذاتية أو البروتينات ذات العلامات الخارجية مع البروتينات المرتبطة بها، تليها تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، من تحديد تفاعلات البروتين الجديدة5. ومع ذلك، فإن أحد الاختناقات الرئيسية لتحليل التصلب المتعدد/التصلب المتعدد هو ضعف الانتعاش من الملخصات التربتيكية لعينات البروتين. لإجراء التحليلات البروتيومية على lysates الخلية، وتستخدم عموما في هلام وتقنيات الهضم على غشاء لإعداد عينات MS / MS. لقد قارنا سابقا إجراء الهضم في هلام مع تقنية الهضم على الغشاء6، وأظهرت أن هذا الأخير كان مرتبطا مع تغطية تسلسل أفضل. غشاء ثنائي الفينيل (PVDF) قد يكون مناسبا لهذا الغرض لأنه قوي ميكانيكيا ومقاومة لتركيزات عالية من المذيبات العضوية7،8، مما يسمح بالهضم الأنزيمي للتعطيل البروتينات في وجود 80٪ أسيتوتريل9. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الجمود على الغشاء إلى تغييرات في البروتينات المستهدفة، مما يؤدي إلى تحسينات في كفاءة الهضم التربتيكي10. وفقا لذلك، في هذه المقالة، وصفنا استخدام تحليل المناعة-LC/MS/MS لتفاعلات البروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء. تسهل هذه الطريقة البسيطة التحليل المريح للتفاعلات البروتينية حتى في المختبرات غير المتخصصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- هطول الأمطار المناعية
ملاحظة: استخدمنا كبريتات دودسيل غير الصوديوم (SDS) التحلل العازلة وelution سيترات، كما هو موضح في الأقسام التالية. ومع ذلك، قد يكون استخدام تقنية بديلة في المنزل هطول الأمطار المناعية ينطبق أيضا لإعداد عينات LC-MS/MS.
- الخلايا المستزرعة عبر الفيكتمع مع ناقلات ترميز علامة الظهارة وحدها أو بروتين الانصهار. للحصول على البيانات التمثيلية، نقل الخلايا J774 (1 × 106)مع ناقلات ترميز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) وحدها أو GFP تنصهر Capn6 (كالبين-6 الجينات) باستخدام liposomes الموجبة.
- تترافق الأجسام المضادة إلى الخرز المغناطيسي.
- لهذا الغرض، مزيج المضادة للGFP الأجسام المضادة (2 ميكرولتر / رد فعل) مع الخرز المغناطيسي (25 ميكرولتر / رد فعل) في 500 ميكرولتر من احتياطي الفوسفات سيترات (24.5 مم حامض الستريك، 51.7 مليون متر فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة؛ درجة الحموضة 5.0) في أنبوب اختبار 1.5 مل.
- تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل الخرز IgG-المترافق ثلاث مرات مع حاجز الفوسفات سيترات التي تحتوي على 0.1٪ البولي أوكسي إيثيلين (20) مونولوريت السوربيتان.
- Lyse الخلايا المنقولة باستخدام المخزن المؤقت lysis المناسبة. للحصول على بيانات تمثيلية، تسين الخلايا المنقولة لمدة 30 دقيقة على الجليد في 400 ميكرولتر من المخزن الاحتياطي للليسات (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك؛ درجة الحموضة 7.5، 120 مل كلوريد الفينيل، 0.5٪ بولي (أوكسيثيلين) الإيثر الثنائي الفينيل الثماني) التي تحتوي على 40 ميكرومول /L فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد، 50 ميكروغرام / مل ليوبيبين، 50 ميكروغرام / مل ليوبيبين، 50 ميكروغرام / مل أبروتينين، 200 ميكرومول / لتر أورثوفادات الصوديوم، و 1 مم حمض الإيثيلين غليكول رباعي الأسيتيك (EGTA) في أنابيب اختبار 1.5 مل 24 ساعة بعد التغوط.
- مسح lysate عن طريق الطرد المركزي في 15،000 × ز لمدة 5 دقائق وجمع supernatant.
- امسح الليسات. إضافة حبات مغناطيسية غير مسماة (25 درجة مئوية / رد فعل) في أنبوب اختبار 1.5 مل. غسل الخرز ثلاث مرات مع 500 درجة مئوية من المخزن المؤقت الفوسفات سيترات. بعد إزالة حاجز فوسفات سيترات في الغسيل النهائي، إضافة lysate الخلية على الخرز المغناطيسي. تدوير الخليط باستخدام الدوار في 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وضع أنبوب الاختبار على موقف المغناطيسي لمدة 5 دقائق لفصل المغناطيسي، وجمع lysate الخلية. ينصح باستخدام الحامل المغناطيسي المعين من قبل الشركة المصنعة.
- ربط البروتينات المستهدفة إلى الخرز المترافق. ضع الغلوبولين المناعي (Ig) G-مترافق الخرز على حامل مغناطيسي لمدة 5 دقائق للفصل المغناطيسي، وتجاهل المخزن المؤقت للسترات، ثم أضف الليزات الخلية إلى الخرز المنفصل.
- تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- فصل البروتينات المستهدفة من البروتينات غير المستهدفة الحرة. غسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 500 درجة مئوية من حاجز الفوسفات سيترات التي تحتوي على 0.1٪ بوليأوكسي إيثيلين (20) مونولوريت السوربيتان. بعد الغسيل النهائي، أضف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسيترات (الرقم الهيدروجيني 2-3)، واحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لelute البروتينات المستهدفة.
ملاحظة: إذا كان الانتعاش من الترسيب المناعي غير كافية، فإن استخدام علامات النعت البديلة، مثل FLAG أو HIS، قد يحسن الكفاءة. وإذا كانت كفاءة الإلتذى غير كافية، فإن استخدام الأيلونات الأخرى، مثل الحل القائم على SDS، قد يحسن الكفاءة.
2. على غشاء الهضم من البروتينات
ملاحظة: استخدام المواد والمعدات الخالية من البروتين ضروري لتجنب التلوث بالبروتينات الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن أن المشغل ارتداء قناع الجراحية والقفازات لتجنب التلوث بالبروتينات البشرية.
- قطع أغشية PVDF إلى قطع 3 مم × 3 مم باستخدام مقص الجراحية التي تم مسحها مع الميثانول والمجففة مباشرة قبل الاستخدام.
- أضف 2-5 ميكرولتر من الإيثانول على قطع غشاء PVDF على رقائق الألومنيوم النظيفة.
- قبل أن تجف تماما، إضافة eluant (2-5 ميكرولتر لكل منهما، 4-6 قطع لكل عينة) على أغشية PVDF المائية، ومن ثم الهواء الجاف الأغشية حتى يصبح سطح الغشاء غير لامع. يمكن تخزين الأغشية المجففة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- نقل جميع الأغشية في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل، إضافة 20-30 درجة مئوية من الإيثانول لجعل الأغشية المائية، ومن ثم إزالة الإيثانول باستخدام ماصة.
- قبل أن يجف الغشاء تماما، إضافة 200 درجة مئوية من dithiothreitol (DTT) القائم على حل رد الفعل (80 mM NH4HCO3،10 MM DTT، و 20٪ acetonitrile) واحتضانه في 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- استبدال حل رد الفعل مع 300 درجة مئوية من محلول يودواسيتاميد (80 مل NH4هكو3،55 mM يودواسيتاميد، و 20٪ أسيتوتريل)، وحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- غسل الأغشية مرتين مع 1 مل من الماء المقطر ومرة واحدة مع 1 مل من 2٪ acetonitrile عن طريق خلط دوامة ل > 10 s.
- حل lyophilized MS-الصف التربسين (جدولالمواد)مباشرة في حل رد الفعل (30 mM NH4HCO3 تحتوي على 70٪ acetonitrile). إضافة 100 درجة مئوية من محلول التفاعل الذي يحتويعلى 1 ميكروغرام من التربسين (جدول المواد) (30 mM NH4HCO3 التي تحتوي على 70٪ acetonitrile) وحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- نقل حل التفاعل الذي يحتوي على هضم اتّصال في أنبوب اختبار نظيف بـ 1.5 مل باستخدام ماصة.
- إضافة 100 درجة مئوية من محلول الغسيل (70٪ acetonitrile / 1٪ حمض ثلاثي الفلوروسيتيك) إلى الغشاء واحتضانه في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. إضافة آخر 100 درجة مئوية من محلول الغسيل إلى الغشاء وsonicate لمدة 10 دقيقة. ثم جمع حل غسل ومزيج مع حل رد الفعل.
- تغطية أنبوب الاختبار مع قطعة من فيلم المختبر وجعل اثنين من الثقوب الصغيرة مع إبرة. تجفيف الحل باستخدام المكثف فراغ.
- إذابة بقايا في 10 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.2٪. بعد الطرد المركزي (12،000 × ز، 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة)، نقل supernatant في أنبوب عينة.
ملاحظة: الwashes هي الخطوات الهامة لهذا المقطع. خلال هضم البروتين على الغشاء ، فإن غسل الأغشية التي تحتوي على البروتينات المعطلة بعد التخفيض والألكيلية بالماء المقطر ، يليه 2٪ أسيتونتريل ، لأكثر من 10 ثوان لكل منهما ، أمر بالغ الأهمية لإزالة الكواشف.
3. LC-الكهربائي التأين (ESI) - MS / MS تحليل
- تفعيل أداة ESI-MS/MS (جدولالمواد)إلى جانب نظام نانو LC HPLC (جدولالمواد). ربط عمود مسبق(جدولالمواد) وعمود تحليلي (جدولالمواد).
- قبل التحليل، معايرة مطياف الكتلة باستخدام هضمات التربتيك من الزلال المصل البقري المذاب في حمض الفورميك 0.2٪، والذي يوفر الببتيدات القياسية.
- تحليل العينات باستخدام وضع أيون إيجابي ونطاق كتلة من 400-1,250 م / ض؛ ثم الحصول على ما يصل إلى 10 MS / MS الأطياف (100 مللي ثانية لكل منهما) مع نطاق كتلة من 100-1600 م / ض وتدرج خطي من 2٪ -80٪ acetonitrile و 0.2٪ حمض الفورميك لمدة 80 دقيقة بمعدل تدفق 300 مل / دقيقة.
- تحليل بيانات الإخراج باستخدام برنامجلتحديد البروتين (جدول المواد) لتحديد البروتينات المرتبطة بالمرشح. لتحديد إيجابي للبروتين مرشح، مطلوب الكشف عن واحد على الأقل جزء الببتيد عالية الدقة (> 95٪ الإخلاص).
- حذف البروتينات التي عجلت بالمثل في GFP التعبير عن lysates (transfection من ناقلات التعبير عن علامة GFP وحدها) من قائمة البروتينات المرشحة.
ملاحظة: إذا تم تحديد عدد قليل من البروتينات في تحليل قاعدة البيانات، فإن تعديل شروط الحصول على MS/MS (على سبيل المثال، تغيير الوقت من 100 مللي ثانية لكل منها إلى 50 مللي ثانية) قد يزيد من عدد البروتينات المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من خلال الإجراء المذكور أعلاه، تم تحليل مضادات المناعة باستخدام LC-MS/MS (الشكل1). بعد استبعاد البروتينات المشتقة من البروتينات الخارجية (البروتينات من الأنواع الأخرى وIgGs)، تم تحديد17 بروتينًا في مضادات المناعة المرتبطة بالكالبين-6 (الجدول 1) وتم تحديد 15 بروتينًا في مضادات المناعة المرتبطة بـ GFP ( الجدول2). ومن بين البروتينات المرتبطة بالكالبين-6 والبروتينات المرتبطة بـGFP، تم تحديد 11 في كل من البروتينات المناعية (الشكل 2). مرة واحدة تم استبعاد هذه وكالبين-6 نفسها, بقيت خمسة البروتينات المرشحة كالبين-6 المرتبطة: تكمل C1q الوحدة الفرعية C, الكيراتين نوع الثاني سيتوالهيكلية 8, إيغ- ملزمة البروتين, ADP / ATP translocase 1, وubiquitin.
الشكل 1 مخطط لتقنية الهضم على الغشاء
وقد عجلت lysates الخلية باستخدام الخرز المغناطيسي المترافقمع مع الأجسام المضادة محددة. تم مسح المناع من الترسيب المناعي على قطع من غشاء PVDF. في وقت لاحق ، تم التعامل مع الأغشية مع الكواشف للألكلة الاختزالية ، ومن ثم احتضنت مع التربسين. ثم تم تحليل حل رد الفعل باستخدام LC-MS/MS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 لمحة عامة عن البيانات التمثيلية
تم تحديد سبعة عشر بروتينًا في المناوّق المناعي المرتبط بالكالبين-6 وتم اكتشاف 15 بروتينًا في المناعي المناعي المرتبط بـ GFP. ومن بين هذه البروتينات، تم تحديد 11 بروتينًا في كلا البروتينات المناعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | الانضمام | الببتيدات (95٪) | %Cov |
| أكتين، سيتوبلازميك 2 | sp| P63260 | فى الانماع | 5 | 18.4 |
| أكتين، عضلة ملساء الأبهر | sp| P62737 | Acta | 5 | 18.57 |
| أكتين، سيتوبلازميك 1 | sp| P60710 | فى السنوات | 5 | 18.41 |
| أكتين، ألفا العضلات الهيكلية | sp| P68134 | الاعمال | 5 | 13.53 |
| أكتين، عضلة القلب ألفا 1 | sp| P68033 | الوكاله | 5 | 13.53 |
| أكتين، عضلة ملساء غاما المعوية | sp| P63268 | فى هذا الهوونش | 5 | 13.56 |
| عامل استطالة 1-ألفا 1 | sp| P10126 | EF1A1 | 3 | 33.33 33 |
| استطالة عامل 1-ألفا 2 | sp| P62631 | EF1A2 | 3 | 16.2 |
| كيراتين، النوع الثاني من العظام الهيكلية 8 | sp| P11679 | K2C8 | 3 | 22.65 |
| تكملة C1q المكون الفرعي C | sp| Q02105 | C1QC | 2 | 8.94 |
| بروتين ملزم IgE | sp| P03975 | IGEB | 2 | 21.72 |
| كالبين-6 | sp| O35646| CAN6 | 1 | 15.91 |
| ADP/ATP translocase 2 | sp| P51881 | ADT2 | 1 | 27.52 |
| ADP/ATP translocase 1 | sp| P48962 | ADT1 | 1 | 19.13 |
| يوبيكويتين | sp| P62991 | يوبيكيو | 1 | 40.79 |
| عامل النسخ المتصل بـ Runt 3 | sp| Q64131| RUNX3 | 1 | 15.89 |
| Isoform 2 من عامل النسخ المتصل بـ Runt 3 | sp| Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "الببتيدات (95٪) يشير إلى عدد الببتيدات التي تم تحديدها بدرجة الدقة > 95% في بيانات MS/MS. "٪ كوف" يشير إلى النسبة المئوية لبقايا الأحماض الأمينية المحددة في جميع الببتيدات (مع > 95٪ الإخلاص) بالنسبة إلى العدد الإجمالي لبقايا الأحماض الأمينية التي تشكل البروتين المقابلة. لتحسين الوضوح، لا تظهر البروتينات الخارجية (البروتينات من الأنواع الأخرى وIgGs)، والبروتينات ريبوسومال، والهيستونات. | |||
الجدول 1 البروتينات المرتبطة بالكالبين-6
| اسم | الانضمام | الببتيدات (95٪) | %Cov |
| عامل استطالة 1-ألفا 1 | sp| P10126 | EF1A1 | 3 | 24.24 |
| استطالة عامل 1-ألفا 2 | sp| P62631 | EF1A2 | 3 | 24.41 |
| أكتين، ألفا العضلات الهيكلية | sp| P68134 | الاعمال | 3 | 13.53 |
| أكتين، عضلة القلب ألفا 1 | sp| P68033 | الوكاله | 3 | 13.53 |
| أكتين، عضلة ملساء غاما المعوية | sp| P63268 | فى هذا الهوونش | 3 | 13.56 |
| أكتين، سيتوبلازميك 2 | sp| P63260 | فى الانماع | 3 | 13.6 |
| أكتين، عضلة ملساء الأبهر | sp| P62737 | Acta | 3 | 13.53 |
| أكتين، سيتوبلازميك 1 | sp| P60710 | فى السنوات | 3 | 13.6 |
| ADP/ATP translocase 2 | sp| P51881 | ADT2 | 2 | 25.5 |
| rRNA 2'-O-ميثيل ترانسفيراز فيبريلرين | sp| P35550 | FBRL | 2 | 14.37 |
| ناوتينين | sp| P67778 | PHB | 1 | 9.19 |
| الريبونوكليوبروتين النووي غير المتجانس U | sp| Q8VEK3 | HNRPU | 1 | 10.63 |
| عامل النسخ المتصل بـ Runt 3 | sp| Q64131| RUNX3 | 1 | 39.12 |
| Isoform 2 من عامل النسخ المتصل بـ Runt 3 | sp| Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| عامل استطالة 1-غاما | sp| Q9D8N0| EF1G | 1 | 12.36 |
| "الببتيدات (95٪) يشير إلى عدد الببتيدات التي تم تحديدها بدرجة الدقة > 95% في بيانات MS/MS. "٪ كوف" يشير إلى النسبة المئوية لبقايا الأحماض الأمينية المحددة في جميع الببتيدات (مع > 95٪ الإخلاص) بالنسبة إلى العدد الإجمالي لبقايا الأحماض الأمينية التي تشكل البروتين المقابلة. لتحسين الوضوح، لا تظهر البروتينات الخارجية (البروتينات من الأنواع الأخرى وIgGs)، والبروتينات ريبوسومال، والهيستونات. | |||
الجدول 2 البروتينات المرتبطة بـ GFP
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد سبق لنا وصف تحليل التعديلات التأكسدية للبروتين اللابولي ب-100 في البروتين الدهني منخفض الكثافة المؤكسد باستخدام LC-MS/MS يسبقه تقنية الهضم على الغشاء6. في هذه الدراسة، جمعنا هذه التقنية مع الترسيب المناعي وحددنا العديد من البروتينات المرتبطة بالكالبين-6. هذه التقنية الجديدة تمثل طريقة مريحة لفحص البروتينات المرتبطة بالمرشح. Calpain-6 هو عضو غير بروتيوليتيك من عائلة كالبين بروتيوليتيك11 التي يقال أنها تعدل الوظائف الخلوية من خلال تفاعلاتالبروتين والبروتين12،13. باستخدام تقنية الهضم على الغشاء، لقد حددنا سابقا البروتينات الأخرى المرتبطة بالكالبين-6 التي تستخدم مجموعة MS مختلفة12. لذلك، نوصي باختبار العديد من شروط MS لزيادة عدد المرشحين المحددين إلى أقصى حد. ولنفس السبب، فإن تقييم ظروف هطول الأمطار المناعية، مثل أنواع علامات الظهارة، والمنظفات، ومحلول الإلتواء المستخدم، مهم للحصول على النواتج المثلى.
في هذه الدراسة، حددنا 11 بروتينًا في كل من الكالبين-6 وGFP المرتبطة بالمناعة. كانت غالبية البروتينات المتداخلة متساويات الأكتين، والتلوث بالبروتينات الأكتين الخلوية الهيكلية شائع في تحليلات تفاعلات البروتين والبروتين الخلوي لأن مستويات التعبير عن هذه البروتينات عالية جداً. ولذلك ينبغي حذف هؤلاء المرشحين من مزيد من التحليل. وبالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن عوامل استطالة في كل من المناعي. أنها تنظم سرعة وإخلاص تخليق البروتين وتؤثر على البروتين للطي14، وبالتالي ، فإن الهطول المناعي المشترك لعوامل الاستطالة ليس من المستغرب. وينبغي أيضا حذف هذه البروتينات من مزيد من التقييم.
يمكن أن تخضع مضادات المناعة للألجيلة الاختزالية والهضم الأنزيمي مباشرة في محلول الإلتبيلة15، ويمكن أيضا تطبيق طريقة الهضم هذه في الحل لإعداد عينات لالتصلب المتعدد / التصلب المتعدد. ومع ذلك، فإننا نعتبر استخدام الهضم على الغشاء أن يكون لها مزايا كبيرة على الهضم في الحل. غشاء PVDF بمثابة سقالة للألعل الاختزالي اللاحقة والهضم الأنزيمي، وهذا يعني أنه يمكن استبدال المذيبات المطلوبة لهذه العمليات بسهولة. وبالتالي، فمن الممكن استخدام مجموعة متنوعة من حلول الإلهون لالترسيب المناعي. وعلى العكس من ذلك، قد يكون من الصعب استخدام حلول الإثارة القائمة على SDS أو منخفضة درجة الحموضة لأن نشاط البروتياز قد يكون محدوداً في ظل هذه الظروف. وعلاوة على ذلك، فإن تجميد البروتينات المستهدفة يمكن أن يجعل إجراء الغسيل اللاحق أسهل. وبالتالي، على الغشاء الهضم هو مناسبة للغاية لإعداد مناعي لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد / MS. قد يكون عدد محدود من البروتياز مناسبة لهذا البروتوكول. حتى الآن، فقط Lysyl-C، بخلاف التربسين، ويقال أنها نشطة في وجود ما يصل إلى 80٪ acetonitrile6،9،10،15.
لدينا تقنية الهضم على الغشاء هو مناسبة لتحديد البروتينات في كمية صغيرة من المناعة مع حد الكشف حساسة للغاية. ومع ذلك، ينبغي أن نتذكر أن كفاءة الكشف عن البروتين المستهدف يعتمد على الكمية الموجودة. يتم الكشف عن البروتينات الموجودة بكميات أكبر بشكل تفضيلي، وقد تمنع البروتينات الأخرى الموجودة بكميات أصغر يتم اكتشافها من قبل مرض التصلب المتعدد. ومع ذلك، في ظل الظروف العادية يتم الكشف عن العديد من البروتينات باستخدام تحليل LC-MS/MS، ويجب استخدام الاختبارات الأخرى لتوضيح أي من البروتينات المرشحة ذات أهمية بيولوجية مناسبة.
في هذه الدراسة، قمنا بتقييم تقنية الهضم على الغشاء لتحليل المناعة. وينبغي أن تكون هذه الطريقة المريحة والشاملة لتحليل التفاعلات بين البروتين والبروتين قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحسين الإنتاجية للتحليلات البروتيومية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI منحة رقم 17K09869 (إلى AM)، الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI منحة رقم 15K09418 (إلى TM)، وهي منحة بحثية من مؤسسة كانهارا ايشيرو للعلوم الطبية ومنحة بحثية من مؤسسة سوزوكان التذكارية (جميعها إلى TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
