Summary
ここでは、質量分析用サンプルの調製のための膜上消化技術のプロトコルを提示する。この技術は、タンパク質とタンパク質の相互作用の便利な分析を容易にします。
Abstract
多数の細胞内タンパク質は、細胞内および細胞外の状況に応じて物理的に相互作用します。実際、細胞機能は細胞内タンパク質とタンパク質の相互作用に大きく依存します。したがって、これらの相互作用に関する研究は、生理学的プロセスの理解を促進するために不可欠である。関連するタンパク質の共沈降、続いて質量分析(MS)分析により、新規なタンパク質相互作用の同定が可能になります。本研究では、タンパク質とタンパク質の相互作用の解析のための膜上消化と組み合わせた免疫沈殿-液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MS解析の新しい技術の詳細を提供した。この技術は粗い免疫沈殿物のために適し、プロテオミクス分析のスループットを改善できる。タグ付けされた組換えタンパク質は、特定の抗体を使用して沈殿した。次に、ポリビニリデンジフッ化物膜片にブロットした免疫沈殿物を還元アルキル化を行った。トリプシン化後、消化されたタンパク質残元をLC-MS/MSを用いて分析し、この技術を用いて、いくつかの候補関連タンパク質を同定することができた。したがって、この方法は、新規タンパク質-タンパク質相互作用の特性化に便利で有用である。
Introduction
タンパク質は生物に構成的な役割を果たしますが、細胞内環境では継続的に合成、処理、分解されます。さらに、細胞内タンパク質は頻繁に物理的および生化学的に相互作用し、1、2、3の一方または両方の機能に影響を与える。例えば、真核陽子翻訳開始係数4A3(eIF4A3)を用いたスプライセオソーム関連タンパク質ホモロCWC22の直接結合は、エキソン接合複合体4の組み立てに必要である。これと一致して、CWC22に親和性を欠くeIF4A3変異体は、エキソン接合複雑駆動mRNAスプライシング4を容易にすることができない。したがって、タンパク質相互作用の研究は、生理的調節と細胞機能を正確に理解するために重要である。
近年の質量分析(MS)の進歩は、タンパク質とタンパク質の相互作用の包括的な分析に適用されている。例えば、内因性タンパク質または外因性に導入されたタグ付きタンパク質の同時沈殿を関連タンパク質と共に、MS分析に続いて、新規タンパク質相互作用5の同定を可能にする。しかし、MS/MS分析の主なボトルネックの1つは、タンパク質サンプルのトピプティックダイジェストからの回復が不十分である。細胞液分にプロテオミクス解析を行う場合、一般的にMS/MSサンプルを調製するために、インゲルおよび膜上消化技術が採用されています。我々は以前に、インゲル消化手順を膜上消化技術6と比較し、後者がより良い配列カバレッジに関連していることを示した。ポリビニリデン二フッ化物(PVDF)膜は、機械的に堅牢であり、高濃度の有機溶媒7、8に耐性があり、固定化された酵素消化を可能にするため、この目的に適している可能性があります。80%アセトニトリル9の存在下のタンパク質。さらに、膜上の固定化は、標的タンパク質の立体構造変化を誘発し、トリプティック消化効率10の改善につながる。そこで本稿では、膜上消化技術を用いてタンパク質相互作用の免疫沈殿-LC/MS/MS解析の使用について述べた。この簡単な方法は非専門の実験室でまた蛋白質の相互作用の便利な分析を促進する。
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Protocol
1. 免疫沈殿
注:以下のセクションで説明するように、非ドデシル硫酸非ナトリウム(SDS)溶解バッファーおよびクエン酸溶出液を使用しました。しかし、代替の社内免疫沈殿技術の使用は、LC-MS/MSサンプルの製造にも適用可能である。
- エピトープタグ単独または融合タンパク質をコードするベクターを有するトランスフェクト培養細胞。代表的なデータを得る場合は、カチオンリポソームを用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)単独またはGFP融合Capn6(カルパイン-6遺伝子)をコードするベクターでJ774細胞(1 x 10 6)を送り込む。
- 磁気ビーズに対する結合抗体。
- この目的のために、抗GFP抗体(2μL/反応)と磁気ビーズ(25μL/反応)を500 μLのクエン酸バッファー(24.5mMクエン酸、51.7mMの二塩基性リン酸、pH 5.0)を1.5mL試験管に混合します。
- 室温で1時間50rpmで混合物を回転させます。次に、0.1%ポリオキシエチレン(20)ソルビタン単一を含むクチン酸リン酸バッファーでIgG結合ビーズを3回洗浄する。
- 適切なリシスバッファーを使用してトランスフェクトされた細胞をlyseします。代表的なデータを取得するには、400 μLのライシスバッファー(50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.5% ポリ(オキシエトヘレン) オクチルフェニルエーテル) 40 μmol/L フェニルメチルスルホニルフッ化物を含む, 50 μg/mL ルペプチン, 50 μg/mLアプロチニン、200 μmol/Lオルソバナデート、およびトランスフェクション後24時間の1.5mL試験管内の1mMエチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)。
- 15,000 x gで5分間遠心分離してリサートをクリアし、上清を回収します。
- ライサートを事前にクリアします。1.5 mL試験管にラベルのない磁気ビーズ(25 μL/反応)を追加します。500 μL のクエン酸バッファーでビーズを 3 回洗います。最終洗浄でクチン酸リン酸バッファーを除去した後、磁気ビーズの上に細胞リサートを加えます。室温で30分間、回転子を使用して混合物を50rpmで回転させます。
- 磁気分離のために5分間磁気スタンドに試験管を置き、細胞リサートを収集します。メーカー指定の磁気スタンドの使用をお勧めします。
- 標的タンパク質を共役ビーズに結合します。免疫グロブリン(Ig)G-共役ビーズを磁気分離のために5分間磁気スタンドに置き、ク硝子バッファーを廃棄し、分離されたビーズに細胞リサートを加えます。
- 室温で1時間50rpmで混合物を回転させます。
- 標的タンパク質を自由な非標的タンパク質から分離します。0.1%ポリオキシエチレン(20)ソルビタン単一を含むクエン酸リン酸バッファーの500 μLを使用してビーズを3回洗浄します。最終洗浄後、クエン酸バッファー(pH2-3)を30μL加え、室温で5分間インキュベートして標的タンパク質を溶出させます。
注:免疫沈殿からの回復が不十分な場合、FLAGまたはHISなどの代替エピトープタグを使用すると、効率が向上する可能性があります。溶出の効率が不十分な場合、SDSベースの溶液などの他の溶出剤を使用すると、効率が向上する可能性がある。
2. タンパク質の膜上消化
注:外因性タンパク質による汚染を避けるためには、タンパク質を含まない材料や機器を使用する必要があります。さらに、人間のタンパク質による汚染を避けるために、オペレータが外科用マスクと手袋を着用することをお勧めします。
- PVDF膜をメタノールで拭き取り、使用直前に乾燥させた外科用ハサミを使用して、PVDF膜を3mm x 3mmの部分に切断します。
- きれいなアルミ箔の上にPVDF膜の部分にエタノールの2-5 μLを追加します。
- 完全に乾燥する前に、親水性PVDF膜に溶出剤(各2~5μL、サンプル当たり4~6個)を加え、膜表面がマットになるまで膜を空気乾燥させます。乾燥膜は4°Cで貯えることができる。
- すべての膜を1.5mLのプラスチックチューブに移し、20~30μLのエタノールを加えて膜を親水性にし、ピペットを使ってエタノールを取り除きます。
- 膜が完全に乾燥する前に、200 μLのジチオスレイトール(DTT)ベースの反応溶液(80 mM NH4HCO 3、10 mM DTT、および20%アセトニトリル)を加え、1時間56°Cでインキュベートします。
- 反応溶液を300μLのヨードアセタミド溶液(80mM NH4HCO 3、55mMヨードアセツアミド、および20%アセトニトリル)に置き換え、暗闇の中で室温で45分間インキュベートします。
- 蒸留水の1 mLで2回膜を洗い、>10sの渦混合で2%アセトニトリルの1mLで1回洗います。
- 反応溶液(30mM NH4HCO3 70%アセトニトリルを含む)に直接凍結乾燥MSグレードトリプシン(材料の表)を溶解する。1μgのトリプシン(材料の表)を含む反応溶液の100 μLを加え(30mM NH4HCO3 70%アセトニトリルを含む)を一晩37°Cでインキュベートする。
- トリプティックダイジェストを含む反応溶液をピペットを使用してクリーンな1.5 mL試験管に移します。
- 100 μLの洗浄液(70%アセトニトリル/1%トリフルオロ酢酸)を膜に加え、60°Cで2時間インキュベートし、洗浄液を回収し、反応液と混合します。膜に洗浄液を100μL追加し、10分間超音波処理します。その後、洗浄液を収集し、反応溶液と混合します。
- 試験用フィルムで試験管を覆い、針で小さな穴をいくつか作ります。真空濃縮器を使用して溶液を乾燥させます。
- 残渣を0.2%ギ酸の10μLで溶解します。遠心分離(12,000×g、室温で3分)の後、上清を試料管に移す。
注: このセクションの重要な手順は、洗い物です。膜上タンパク質消化の間、還元後の固定化タンパク質を含む膜を蒸留水で洗浄し、続いて2%のアセトニトリルを、それぞれ10秒以上、試薬の除去に不可欠である。
3. LC-エレクトロスプレーイオン化(ESI)-MS/MS分析
- ナノLC HPLCシステム(材料表)と組み合わせたESI-MS/MS計測器(材料表)を起動します。事前列 (材料の表)と分析列 (材料の表) をリンクします。
- 分析の前に、標準的なペプチドを提供する0.2%ギ酸に溶解したウシ血清アルブミンのトリプティックダイジェストを使用して質量分析計を較正する。
- 正イオンモードと400-1,250 m/zの質量範囲を使用してサンプルを分析します。その後、100~1,600m/zの質量範囲で最大10MS/MSスペクトル(各100ミリ秒)、2%~80%のアセトニトリル、0.2%のギ酸を300nL/minの流量で80分間取得します。
- タンパク質同定のためのソフトウェア(材料の表)を使用して出力データを分析し、候補関連タンパク質を特定します。候補タンパク質の陽性同定のためには、少なくとも1つの高忠実度ペプチド断片(>95%忠実度)の検出が必要である。
- GFP発現リザテート(GFPタグを単独で発現するベクターのトランスフェクション)で同様に沈殿しているタンパク質を候補タンパク質のリストから省略します。
注:データベース分析で同定されたタンパク質が少ない場合、MS/MS取得条件の修飾(例えば、各々100ミリ秒から50ミリ秒に時間を変更する)は、同定されたタンパク質の数を増加させる可能性がある。
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Representative Results
上述の手順により、免疫沈殿物をLC-MS/MS(図1)を用いて分析した。外因性由来タンパク質(他の種およびIgG由来のタンパク質)を排除した後、17個のタンパク質をカルパイン-6関連免疫沈殿物(表1)で同定し、15個のタンパク質をGFP関連免疫沈殿物(GFP関連免疫沈殿物)で同定した(表2)カルパイン-6およびGFP関連タンパク質のうち、11は両方の免疫沈殿物で同定された(図2)。これらおよびcalpain-6自体を除外すると、5つの候補カルパイン-6関連タンパク質が残った:補体C1qサブコンポーネントサブユニットC、ケラチンタイプII細胞骨格8、IgE結合タンパク質、ADP/ATPトランスロケース1、およびユビキチン。
図 1.膜上消化技術のスキーム
細胞リサットは、特異的抗体と共役した磁気ビーズを用いて沈殿させた。免疫沈殿からの溶媒をPVDF膜の断片に消し取った。続いて、膜を還元アルキル化用試薬で処理し、次いでトリプシンでインキュベートした。その後、LC-MS/MSを用いて反応液を分析し、こちらをクリックして、この図のより大きなバージョンを表示してください。
図 2.代表データの概要
カルパイン6関連免疫沈殿物で17個のタンパク質が同定され、GFP関連免疫沈殿物で15個のタンパク質が検出された。このうち、11種類のタンパク質が両方の免疫沈殿物で同定された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | 加盟 | ペプチド(95%) | %コブ |
| アクチン、細胞質2 | sp |P63260 |アクトグ | 5 | 18.4年 |
| アクチン,大動脈平滑筋 | sp |P62737 |Acta | 5 | 18.57円 |
| アクチン、細胞質1 | sp |P60710 |アクトブ | 5 | 18.41円 |
| アクチン, アルファ骨格筋 | sp |P68134 |行為 | 5 | 13.53年 |
| アクチン、アルファ心筋 1 | sp |P68033 |アクト | 5 | 13.53年 |
| アクチン、ガンマ腸平滑筋 | sp |P63268 |Acth | 5 | 13.56年 |
| 伸び係数 1-アルファ 1 | sp |P10126 |EF1A1 | 3 | 33.33 |
| 伸び係数 1-アルファ 2 | sp |P62631 |EF1A2 | 3 | 16.2年 |
| ケラチン、II型細胞骨格8型 | sp |P11679 |K2C8 | 3 | 22.65年 |
| 補数 C1q サブコンポーネント サブユニット C | sp |Q02105 |C1QC | 2 | 8.94件 |
| IgE結合タンパク質 | sp |P03975 |イゲブ | 2 | 21.72の |
| カルパイン-6 | sp |O35646 |カン6 | 1 | 15.91年 |
| ADP/ATP トランスロケース 2 | sp |P51881 |ADT2 | 1 | 27.52年 |
| ADP/ATP トランスロケース 1 | sp |P48962 |ADT1 | 1 | 19.13年 |
| ユビキチン | sp |P62991 |ユビク | 1 | 40.79年 |
| ラント関連の転写係数 3 | sp |Q64131 |ランX3 | 1 | 15.89円 |
| ラント関連転写因子3のアイソフォーム2 | sp |Q64131-2 |ランX3 | 1 | 13歳 |
| "ペプチド (95%)"は、MS/MS データの忠実度スコア > 95% で識別されたペプチドの数を示します。「%Cov」とは、対応するタンパク質を構成するアミノ酸残渣の総数に対して、全てのペプチド中に同定されたアミノ酸残渣(>95%忠実度)の割合を指す。明瞭さを改善するために、外因性タンパク質(他の種およびIgG由来のタンパク質)、リボソームタンパク質、およびヒストンは示されていない。 | |||
表 1.カルパイン-6関連タンパク質
| 名前 | 加盟 | ペプチド(95%) | %コブ |
| 伸び係数 1-アルファ 1 | sp |P10126 |EF1A1 | 3 | 24.24 |
| 伸び係数 1-アルファ 2 | sp |P62631 |EF1A2 | 3 | 24.41年 |
| アクチン, アルファ骨格筋 | sp |P68134 |行為 | 3 | 13.53年 |
| アクチン、アルファ心筋 1 | sp |P68033 |アクト | 3 | 13.53年 |
| アクチン、ガンマ腸平滑筋 | sp |P63268 |Acth | 3 | 13.56年 |
| アクチン、細胞質2 | sp |P63260 |アクトグ | 3 | 13.6年 |
| アクチン,大動脈平滑筋 | sp |P62737 |Acta | 3 | 13.53年 |
| アクチン、細胞質1 | sp |P60710 |アクトブ | 3 | 13.6年 |
| ADP/ATP トランスロケース 2 | sp |P51881 |ADT2 | 2 | 25.5年 |
| rRNA 2'-O-メチルトランスフェラーゼフィブリラリン | sp |P35550 |FBRL | 2 | 14.37年 |
| 禁止 | sp |P67778 |Phb | 1 | 9.19件 |
| 異種核リボヌクレオタンパク質U | sp |Q8VEK3 |HNRPU | 1 | 10.63年 |
| ラント関連の転写係数 3 | sp |Q64131 |ランX3 | 1 | 39.12台 |
| ラント関連転写因子3のアイソフォーム2 | sp |Q64131-2 |ランX3 | 1 | 26歳 |
| 伸び係数1-ガンマ | sp |Q9D8N0 |EF1G | 1 | 12.36年 |
| "ペプチド (95%)"は、MS/MS データの忠実度スコア > 95% で識別されたペプチドの数を示します。「%Cov」とは、対応するタンパク質を構成するアミノ酸残渣の総数に対して、全てのペプチド中に同定されたアミノ酸残渣(>95%忠実度)の割合を指す。明瞭さを改善するために、外因性タンパク質(他の種およびIgG由来のタンパク質)、リボソームタンパク質、およびヒストンは示されていない。 | |||
表 2.GFP関連タンパク質
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Discussion
我々は、以前に、オン膜消化技術6に先行するLC-MS/MSを用いた酸化低密度リポタンパク質におけるアポリポタンパク質B-100の酸化修飾の分析について説明した。本研究では、この技術を免疫沈殿と組み合わせ、いくつかのカルパイン-6関連タンパク質を同定した。この新しい技術は、候補関連タンパク質のスクリーニングの便利な方法を表す。Calpain-6は、そのタンパク質相互作用12,13を介して細胞機能を修飾したと伝えられているカルパインタンパク質溶解ファミリー11の非タンパク質溶解部材である。膜上消化技術を用いて、我々は以前に別のMSセットアップ12を用いて他のカルパイン-6関連タンパク質を同定した。したがって、特定された候補の数を最大化するために、いくつかの MS 条件をテストすることをお勧めします。同様に、エピトープタグ、洗剤、溶出液の種類などの免疫沈殿条件の評価は、最適な出力を得るために重要である。
本研究では、カルパイン-6-およびGFP関連免疫沈殿物の両方で11のタンパク質を同定した。重なり合うタンパク質の大部分はアクチンアイソタイプであり、これらのタンパク質の発現レベルが非常に高いため、細胞タンパク質とタンパク質の相互作用の分析ではアクチンサイト骨格タンパク質による汚染が一般的である。したがって、これらの候補は、さらなる分析から除外する必要があります。さらに、伸び因子は両方の免疫沈殿物で検出された。それらはタンパク質合成の速度および忠実度を調節し、タンパク質折りたたみ14に影響を与え、したがって、伸び因子の共免疫沈殿は驚くべきことではない。これらのタンパク質も、さらなる評価から除外されるべきである。
免疫沈殿物は、溶出液15に直接還元アルキル化および酵素消化を行うことができ、かつこの溶液中消化法は、MS/MS用試料の調製にも適用され得る。しかし、膜上消化の使用は、溶液中消化に大きな利点があると考えています。PVDF膜は、その後の還元アルキル化および酵素消化のための足場として機能し、これらのプロセスに必要な溶媒を容易に交換できることを意味する。その結果、免疫沈殿に対して種々の溶出液を用いすることができる。逆に、溶液中消化のために、プロテアーゼ活性がこのような条件下で制限されてもよいため、SDSベースまたは低pH溶出液を使用することは困難な場合があります。さらに、標的タンパク質の固定化は、その後の洗浄手順を容易にすることができる。従って、膜上の消化はMS/MS分析のための免疫沈殿物の準備のために非常に適している。このプロトコルには、限られた数のプロテアーゼが適している場合があります。これまでのところ、トリプシン以外のリシル-Cのみが、最大80%のアセトニトリル6、9、10、15の存在下で活性であると伝えられている。
当社の膜上消化技術は、高感度検出限界を持つ少量の免疫沈殿物のタンパク質の同定に適しています。しかし、標的タンパク質の検出効率は存在する量に依存することを覚えておく必要があります。より多くの量に存在するタンパク質は優先的に検出され、MSによって検出される他のタンパク質が少量で存在するのを防ぐことができます。それにもかかわらず、通常の状況下では、LC-MS/MS分析を用いて多数のタンパク質が検出され、他のアッセイを使用して、候補タンパク質のどれが適切な生物学的有意性を有するのかを明らかにする必要があります。
本研究では、免疫沈殿物の分析のための膜上消化技術を評価した。タンパク質とタンパク質の相互作用の分析のためのこのような便利で包括的な方法は、将来のプロテオミクス分析のスループットを向上させるために広く適用されるべきである。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は、金原一郎医学財団の研究助成である日本学術振興会(AM)、日本学術振興会(TM)の一部で支援されました。そして、鈴研記念財団(すべてTM)からの研究助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
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