Summary
Her præsenterer vi en protokol for en membran fordøjelsesteknik til fremstilling af prøver til massespektrometri. Denne teknik letter den bekvemme analyse af protein-protein interaktioner.
Abstract
Talrige intracellulære proteiner interagerer fysisk i overensstemmelse med deres intracellulære og ekstracellulære omstændigheder. Faktisk, cellulære funktioner i vid udstrækning afhænger af intracellulære protein-protein interaktioner. Derfor er forskning vedrørende disse interaktioner uundværlig for at lette forståelsen af fysiologisk processer. Co-udfældning af associerede proteiner, efterfulgt af massespektrometri (MS) analyse, gør det muligt at identificere nye protein interaktioner. I denne undersøgelse, vi har givet oplysninger om den nye teknik immunopræcipitation-væskekromatografi (LC)-MS/MS analyse kombineret med on-membran fordøjelse til analyse af protein-protein interaktioner. Denne teknik er velegnet til rå immunoprecipitants og kan forbedre gennemløb af proteomiske analyser. Mærkede rekombinante proteiner udfældede ved hjælp af specifikke antistoffer; Dernæst blev immunopræcipitanter slettet på polyvinylidendifluorid membran stykker udsat for reduktiv alkylering. Efter trypsinisering blev de Ford øjede proteinrester analyseret ved hjælp af LC-MS/MS. ved hjælp af denne teknik, vi var i stand til at identificere flere kandidat associerede proteiner. Således, denne metode er praktisk og nyttig til karakterisering af nye protein-protein interaktioner.
Introduction
Selv om proteiner spiller konstitutive roller i levende organismer, de er kontinuerligt syntetiseres, forarbejdes, og nedbrydes i det intracellulære miljø. Desuden interagerer intracellulære proteiner ofte fysisk og biokemisk, hvilket påvirker funktionen af den ene eller begge1,2,3. For eksempel er den direkte binding af spliceosome-associeret protein ligner CWC22 med eukaryote Translation Initierings faktor 4A3 (eIF4A3) nødvendig for samlingen af exon Junction Complex4. I overensstemmelse med dette, en eIF4A3 mutant, der mangler affinitet for CWC22 undlader at lette exon Junction komplekse-drevet mRNA splejsning4. Således er studiet af protein interaktioner afgørende for den præcise forståelse af fysiologisk regulering samt cellulære funktioner.
De seneste fremskridt i massespektrometri (MS) er blevet anvendt på den omfattende analyse af protein-protein interaktioner. For eksempel, co-udfældning af endogene proteiner eller eksogent indførte mærkede proteiner med deres associerede proteiner, efterfulgt af MS analyse, gør det muligt at identificere nye protein interaktioner5. Men, en stor flaskehals af MS/MS analyse er dårlig opsving fra trypticase fordøjer af protein prøver. Til gennemførelse af proteomiske analyser af celle lysater anvendes in-gel-og membran fordøjelsesteknikker generelt til at forberede MS/MS-prøver. Vi har tidligere sammenlignet en in-gel Fordøjelsesprocedure med en on-membran fordøjelse teknik6, og viste, at sidstnævnte var forbundet med bedre sekvens dækning. Polyvinylidendifluorid (PVDF) membran kan være egnet til dette formål, fordi det er mekanisk robust og modstandsdygtig over for høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler7,8, tillader enzymatisk fordøjelse af immobiliseret proteiner i tilstedeværelse af 80% acetonitril9. Desuden kan immobilisering på en membran fremkalde konformationelle ændringer i målproteiner, hvilket fører til forbedringer i trypticase fordøjelse effektivitet10. I overensstemmelse hermed, i denne artikel, vi har beskrevet brugen af immunoprecipitation-LC/MS/MS analyse af protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik. Denne enkle metode letter den bekvemme analyse af protein-protein interaktioner selv i ikke-specialiserede laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunopræcipitation
Bemærk: vi brugte ikke-natriumdodecyl sulfat (SDS) lysis buffer og citrat eluering, som beskrevet i de følgende afsnit. Dog kan brugen af en alternativ in-House chromatinimmunpræcipitation teknik også anvendes til at forberede LC-MS/MS prøver.
- Transfect-dyrkede celler med vektorer, der koger et epitop-tag alene eller et fusionsprotein. For at erhverve repræsentative data, overføre J774 celler (1 x 106) med vektorer kodning grøn fluorescerende protein (gfp) alene eller gfp-smeltet Capn6 (calpain-6 gen) ved hjælp af kationiske Liposomer.
- Konjugat antistof til magnetiske perler.
- Til dette formål blandes anti-GFP-antistoffer (2 μL/reaktion) med magnetiske perler (25 μL/reaktion) i 500 μL citrat fosfatbuffer (24,5 mM citronsyre, 51,7 mM dibasisk natriumphosphat; pH 5,0) i et 1,5 mL test tube.
- Drej blandingen ved 50 rpm i 1 time ved stuetemperatur. Derefter vaskes de IgG-konjugeret perler tre gange med citrat fosfatbuffer indeholdende 0,1% Polyoxyethylen (20) sorbitanestere monolaurat.
- De transficeret celler ved hjælp af en passende lyse buffer. For at opnå repræsentative data, lyse de transficeret celler i 30 min på is i 400 μl lyse buffer (50 mm Tris-HCL; pH 7,5, 120 mm NaCl, 0,5% poly (oxyethelene) octylphenyl ether) indeholdende 40 μmol/L phenylmethylsulfonylfluorid, 50 μg/ml leupeptin, 50 μg/ mL aprotinin, 200 μmol/L natriumorthovanadat og 1 mM ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA) i 1,5 mL reagensglas 24 timer efter transfection.
- Fjern lysningen ved at centrifuge ved 15.000 x g i 5 min. og saml supernatanten.
- Preclear lysatet. Tilsæt ikke-mærkede magnetiske perler (25 μL/reaktion) i et 1,5 mL-testrør. Perlerne vaskes tre gange med 500 μL citrat fosfatbuffer. Efter fjernelse af citrat fosfatbuffer i sidste vask tilsættes celle lysatet over de magnetiske perler. Drej blandingen med rotator ved 50 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Anbring prøverøret på en magnetisk stander i 5 minutter for magnetisk adskillelse, og saml celle lyatet. Det anbefales at anvende den magnetiske stander, som fabrikanten har udpeget.
- Bind målproteinerne til de konjugerede perler. Placer immunglobulin (Ig) G-konjugeret perler på en magnetisk stativ i 5 min for magnetisk adskillelse, kassér citratbuffer, og tilsæt derefter celle lysatet til de adskilte perler.
- Drej blandingen ved 50 rpm i 1 time ved stuetemperatur.
- Adskil målproteinerne fra frie proteiner, som ikke er målarter. Perlerne vaskes tre gange med 500 μL citrat fosfatbuffer indeholdende 0,1% Polyoxyethylen (20) sorbitanestere monolaurat. Efter den sidste vask tilsættes 30 μL citratbuffer (pH 2 – 3) og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur for at eluere målproteinerne.
Bemærk: Hvis genvinding fra immunopræcipitation er utilstrækkeligt, kan brugen af alternative epitop Tags, såsom flag eller hans, forbedre effektiviteten. Hvis elueringsgraden er utilstrækkelig, kan brugen af andre hjælpemidler, såsom en SDS-baseret løsning, forbedre effektiviteten.
2. membran fordøjelse af proteiner
Bemærk: brug af protein frie materialer og udstyr er nødvendigt for at undgå kontaminering med eksogene proteiner. Desuden anbefales det, at operatøren bærer en kirurgisk maske og handsker for at undgå kontaminering med humane proteiner.
- Skære PVDF-membraner i 3 mm x 3 mm stykker ved hjælp af kirurgisk saks, der er blevet aftørres med methanol og tørret umiddelbart før brug.
- Tilsæt 2 – 5 μL ethanol på stykkerne af PVDF-membran på ren aluminiumsfolie.
- Før de tørrer helt, tilsættes eluanten (2 – 5 μL hver, 4 – 6 stykker pr. prøve) på de hydrofile PVDF-membraner, og derefter lufttørre membranerne, indtil membranens overflade bliver mat. Tørrede membraner kan opbevares ved 4 °C.
- Alle membraner overføres til 1,5 mL plastikrør, tilsæt 20 – 30 μL ethanol for at gøre membranerne hydrofile, og fjern derefter ethanol med en pipette.
- Før membranen tørrer helt ud, tilsættes 200 μl ditiotreitol (DTT)-baseret reaktions opløsning (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT og 20% acetonitril) og inkuberes ved 56 °c i 1 time.
- Reaktions opløsningen udskiftes med 300 μL iodoacetamid opløsning (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamid og 20% acetonitril) og inkubér i 45 min ved stuetemperatur i mørke.
- Membranerne vaskes to gange med 1 mL destilleret vand og en gang med 1 mL 2% acetonitril ved vortex-blanding for > 10 s.
- Lyofiliseret MS-grade trypsin (tabel over materialer) opløses direkte i reaktions opløsningen (30 mm NH4hco3 indeholdende 70% acetonitril). Der tilsættes 100 μL af reaktions opløsningen indeholdende 1 μg trypsin (tabel over materialer) (30 mm NH4hco3 indeholdende 70% acetonitril) og Inkubér ved 37 °c over natten.
- Den reaktions opløsning, der indeholder trypticase-fordøjer, overføres til et rent 1,5 ml-prøveglas ved hjælp af en pipette.
- Der tilsættes 100 μL vaskeopløsning (70% acetonitril/1% trifluoreddikesyre) til membranen, og den inkubates ved 60 °C i 2 timer. Saml Vaskeopløsningen, og bland den med reaktions opløsningen. Tilsæt endnu 100 μL vaskeopløsning til membranen og sonier den i 10 minutter. Derefter opsamles Vaskeopløsningen og blandes med reaktions opløsningen.
- Dæk prøverøret med et stykke laboratorie folie og lav et par små huller med en nål. Tør opløsningen ved hjælp af en vakuum koncentrator.
- Remanensen opløses i 10 μL 0,2% myresyre. Efter centrifugering (12.000 × g, 3 min ved stuetemperatur) overføres supernatanten til et prøveglas.
Bemærk: vaskerne er de kritiske trin i dette afsnit. Under on-membran protein fordøjelse, vask af membraner indeholdende de immobiliserede proteiner efter reduktion og alkylering med destilleret vand, efterfulgt af 2% acetonitril, for mere end 10 sekunder hver, er afgørende for fjernelse af reagenserne.
3. LC – elektro spray ionisering (ESI)-MS/MS analyse
- Aktiver et ESI-MS/MS-instrument (tabel over materialer) kombineret med et Nano-LC HPLC-system (tabel over materialer). Sammenkæde en præ-kolonne (tabel over materialer) og en analytisk kolonne (tabel over materialer).
- Før analysen kalibreres massespektrometer ved hjælp af trypticase fordøjer af bovin serumalbumin opløst i 0,2% myresyre, som giver standard peptider.
- Analysér prøverne ved hjælp af positiv ion-tilstand og et masse område på 400 – 1250 m/z; derefter erhverve op til 10 MS/MS Spectra (100 MS hver) med et masse område på 100 – 1600 m/z og en lineær gradient på 2% – 80% acetonitril og 0,2% myresyre for 80 min ved en strømningshastighed på 300 nL/min.
- Analyser output data ved hjælp af software til protein identifikation (tabel over materialer) for at identificere de kandidat associerede proteiner. For positiv identifikation af et kandidat protein er påvisning af mindst ét high-fidelity peptidfragment (> 95% fidelity) påkrævet.
- Udelad de proteiner, der på tilsvarende måde er fældet i gfp-udtrykte lysater (transfection af vektor, som udtrykker et gfp-tag alene) fra listen over kandidat proteiner.
Bemærk: Hvis få proteiner er identificeret i databasen analyse, ændring af MS/MS erhvervelse betingelser (f. eks ændre tiden fra 100 MS hver til 50 MS hver) kan øge antallet af proteiner identificeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den ovenfor beskrevne procedure blev immunopræcipitanter analyseret med LC-MS/MS (figur 1). Efter udelukkelse af eksogent afledte proteiner (proteiner fra andre arter og Igg'er) blev der identificeret 17 proteiner i calpain-6-associerede immunopræcipitanter (tabel 1), og der blev identificeret 15 proteiner i gfp-associerede immunopræcipitanter ( Tabel 2). Af calpain-6-og GFP-associerede proteiner blev 11 identificeret i både immunopræcipitanter (figur 2). Når disse og calpain-6 selv var udelukket, fem kandidat calpain-6-associerede proteiner forblev: komplement C1q underkomponent underenhed C, keratin type II cytoskelet 8, IgE-bindende protein, ADP/ATP translocase 1, og ubiquitin.
Figur 1. Ordning for fordøjelses teknikken på membranen
Celle lysater blev fældet ved hjælp af magnetiske perler konjugeret med specifikke antistoffer. Eluanten fra immunopræcipitation blev blottet på stykker af PVDF-membran. Efterfølgende blev membranerne behandlet med reagenser til reduktiv alkylering og derefter inkuberet med trypsin. Reaktions opløsningen blev derefter analyseret ved hjælp af LC-MS/MS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Oversigt over repræsentative data
Sytten proteiner blev identificeret i calpain-6-associeret immunoprecipitant og 15 proteiner blev påvist i GFP-associeret immunoprecipitant. Af disse blev der identificeret 11 proteiner i både immunopræcipitanter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Tiltrædelse | Peptider (95%) | % COV |
| Actin, cytoplasmisk 2 | Sp | P63260 | ACTG | 5 | 18,4 |
| Actin, aorta glat muskulatur | Sp | P62737 | Acta | 5 | 18,57 |
| Actin, cytoplasmisk 1 | Sp | P60710 | AKTER | 5 | 18,41 |
| Actin, alpha skeletmuskulatur | Sp | P68134 | Handlinger | 5 | 13,53 |
| Actin, alpha hjerte muskel 1 | Sp | P68033 | ACTC | 5 | 13,53 |
| Actin, gamma-enterisk glat muskulatur | Sp | P63268 | Acth | 5 | 13,56 |
| Forlængelse faktor 1-alpha 1 | Sp | P10126 | EF1A1 | 3 | 33,33 |
| Forlængelse faktor 1-alpha 2 | Sp | P62631 | EF1A2 | 3 | 16,2 |
| Keratin, type II cytoskelet 8 | Sp | P11679 | K2C8 | 3 | 22,65 |
| Komplement C1q underkomponent-underenhed C | Sp | Q02105 | C1QC | 2 | 8,94 |
| IgE-bindende protein | Sp | P03975 | IGEB | 2 | 21,72 |
| Calpain-6 | Sp | O35646 | CAN6 | 1 | 15,91 |
| ADP/ATP translocase 2 | Sp | P51881 | ADT2 | 1 | 27,52 |
| ADP/ATP translocase 1 | Sp | P48962 | ADT1 | 1 | 19,13 |
| Ubiquitin | Sp | P62991 | UBIQ | 1 | 40,79 |
| Runt-relateret transkriptionsfaktor 3 | Sp | Q64131 | RUNX3 | 1 | 15,89 |
| Isoform 2 af runt-relateret transkriptionsfaktor 3 | Sp | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "Peptider (95%)" Angiver det antal peptider, der identificeres med et pålidelighedscoren > 95% i MS/MS-data. "% COV" refererer til den procentdel af aminosyre rester, der er identificeret i alle peptider (med > 95% fidelity) i forhold til det samlede antal aminosyre rester, der udgør det tilsvarende protein. For at forbedre klarheden vises udefrakommende proteiner (proteiner fra andre arter og Igg'er), ribosomale proteiner og histoner ikke. | |||
Tabel 1. Calpain-6-associerede proteiner
| Navn | Tiltrædelse | Peptider (95%) | % COV |
| Forlængelse faktor 1-alpha 1 | Sp | P10126 | EF1A1 | 3 | 24,24 |
| Forlængelse faktor 1-alpha 2 | Sp | P62631 | EF1A2 | 3 | 24,41 |
| Actin, alpha skeletmuskulatur | Sp | P68134 | Handlinger | 3 | 13,53 |
| Actin, alpha hjerte muskel 1 | Sp | P68033 | ACTC | 3 | 13,53 |
| Actin, gamma-enterisk glat muskulatur | Sp | P63268 | Acth | 3 | 13,56 |
| Actin, cytoplasmisk 2 | Sp | P63260 | ACTG | 3 | 13,6 |
| Actin, aorta glat muskulatur | Sp | P62737 | Acta | 3 | 13,53 |
| Actin, cytoplasmisk 1 | Sp | P60710 | AKTER | 3 | 13,6 |
| ADP/ATP translocase 2 | Sp | P51881 | ADT2 | 2 | 25,5 |
| rRNA 2 '-O-methyltransferase fibrillarin | Sp | P35550 | FBRL | 2 | 14,37 |
| Prohibitin | Sp | P67778 | PHB | 1 | 9,19 |
| Heterogene nukleare ribonucleoprotein U | Sp | Q8VEK3 | HNRPU | 1 | 10,63 |
| Runt-relateret transkriptionsfaktor 3 | Sp | Q64131 | RUNX3 | 1 | 39,12 |
| Isoform 2 af runt-relateret transkriptionsfaktor 3 | Sp | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| Forlængelse faktor 1-gamma | Sp | Q9D8N0 | EF1G | 1 | 12,36 |
| "Peptider (95%)" Angiver det antal peptider, der identificeres med et pålidelighedscoren > 95% i MS/MS-data. "% COV" refererer til den procentdel af aminosyre rester, der er identificeret i alle peptider (med > 95% fidelity) i forhold til det samlede antal aminosyre rester, der udgør det tilsvarende protein. For at forbedre klarheden vises udefrakommende proteiner (proteiner fra andre arter og Igg'er), ribosomale proteiner og histoner ikke. | |||
Tabel 2. GFP-associerede proteiner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har tidligere beskrevet en analyse af de oxidativ modifikationer af apolipoprotein B-100 i oxideret low-density lipoprotein ved hjælp LC-MS/MS indledes med en on-membran fordøjelse teknik6. I denne undersøgelse kombinerede vi denne teknik med immunopræcipitation og har identificeret flere calpain-6-associerede proteiner. Denne nye teknik repræsenterer en bekvem metode til screening for kandidat associerede proteiner. Calpain-6 er et ikke-proteolytisk medlem af den calpain proteolytiske familie11 , der efter sigende har ændret cellulære funktioner gennem sine protein-protein interaktioner12,13. Ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik, har vi tidligere identificeret andre calpain-6-associerede proteiner, der beskæftiger en anden MS set-up12. Derfor anbefaler vi, at du tester flere MS-betingelser for at maksimere antallet af identificerede ansøgere. Af samme grund er vurderingen af immunopræcipitation, såsom typerne af epitop tag, rengøringsmiddel og elueringsopløsning, der anvendes, vigtig for opnåelse af optimale udgange.
I denne undersøgelse identificerede vi 11 proteiner i både calpain-6-og GFP-associerede immunoprecipitanter. De fleste af de overlappende proteiner var actin isotyper, og kontaminering med actin cytoskelet proteiner er almindeligt i analyserne af cellulære protein-protein interaktioner, fordi ekspressions niveauerne af disse proteiner er meget høje. Disse kandidater bør derfor udelades fra yderligere analyse. Desuden blev der påvist langstrakte faktorer i både immunopræcipitanter. De regulerer hastigheden og troskab af proteinsyntesen og påvirker proteinfoldning14, og derfor er co-immunoprecipitation af aflange faktorer ikke overraskende. Disse proteiner bør også udelades fra yderligere evaluering.
Immunopræcipitanter kan underkastes en reduktiv alkylering og enzymatisk fordøjelse direkte i elueringsopløsningen15, og denne nedbrydnings metode i opløsningen kan også anvendes til fremstilling af prøver til MS/MS. Vi mener dog, at brugen af membran fordøjelsen har betydelige fordele i forhold til fordøjelsen i opløsningen. PVDF-membranen fungerer som et stillads for den efterfølgende reduktive alkylering og enzymatisk fordøjelse, hvilket betyder, at de opløsningsmidler, der kræves til disse processer, nemt kan udskiftes. Derfor er det muligt at anvende en række elueringsopløsninger til immunopræcipitation. Omvendt kan det være en udfordring at anvende SDS-baserede eller lave pH-elueringsopløsninger til fordøjelse i opløsning, da proteaseaktiviteten kan være begrænset under sådanne forhold. Desuden kan immobilisering af målproteinerne gøre den efterfølgende vaske procedure lettere. Derfor, on-membran fordøjelsen er meget velegnet til fremstilling af immunoprecipitants til MS/MS analyse. Et begrænset antal proteaser kan være passende for denne protokol. Hidtil er kun lysyl-C, bortset fra trypsin, efter sigende aktiv i nærværelse af op til 80% acetonitril6,9,10,15.
Vores membran fordøjelsesteknik er velegnet til identifikation af proteiner i en lille mængde immunoprecipitant med en meget følsom detektionsgrænse. Det skal dog erindres, at detekterings effektiviteten for et målprotein afhænger af det beløb, der er til stede. Proteiner, der er til stede i større mængder er fortrinsvis detekteret, og de kan forhindre andre proteiner til stede i mindre mængder, der påvises ved MS. Under normale omstændigheder påvises der imidlertid talrige proteiner ved hjælp af LC-MS/MS-analyse, og andre analyser skal anvendes til at præcisere, hvilke af kandidat proteinerne der er af passende biologisk betydning.
I denne undersøgelse, vi har evalueret en on-membran fordøjelse teknik til analyse af immunoprecipitants. En sådan bekvem og omfattende metode til analyse af protein-protein interaktioner bør gælde i vid udstrækning for at forbedre gennemstrømningen af fremtidige proteomiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvis støttet af Japan Society for fremme af videnskab KAKENHI Grant nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for fremme af Science KAKENHI Grant nummer 15K09418 (til TM), et forskningsstipendium fra Kanehara Ichiro Medical Science Foundation og et forskningsstipendium fra Suzuken Memorial Foundation (alle til TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
