Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.
Abstract
As proteínas intracelular numerosas interagem fisicamente de acordo com suas circunstâncias intracelular e extracelular. De fato, as funções celulares dependem em grande parte das interações proteína-proteína intracelular. Portanto, a pesquisa sobre essas interações é indispensável para facilitar a compreensão dos processos fisiológicos. A co-precipitação das proteínas associadas, seguida pela análise de espectrometria de massas (MS), possibilita a identificação de novas interações proteicas. Neste estudo, nós fornecemos detalhes da técnica nova da imunoprecipitação-cromatografia líquida (LC)-análise de MS/MS combinada com a digestão da em-membrana para a análise de interações da proteína-proteína. Esta técnica é apropriada para immunoprecipitants crus e pode melhorar a produção de análises proteômica. As proteínas recombinantes marcadas foram precipitadas com anticorpos específicos; em seguida, os immunoprecipitants inchados em partes da membrana do difluluoreto do polyvinylidene foram sujeitados ao alkylation redutora. Após a tripsinização, os resíduos de proteínas digeridas foram analisados utilizando-se LC-MS/MS. utilizando esta técnica, pudemos identificar várias proteínas associadas a candidatos. Assim, esse método é conveniente e útil para a caracterização de novas interações proteína-proteína.
Introduction
Embora as proteínas desempenham papéis constitutivos em organismos vivos, eles são continuamente sintetizados, processados e degradadas no ambiente intracelular. Além disso, as proteínas intracelulares freqüentemente interagem fisicamente e bioquimicamente, o que afeta a função de um ou ambos1,2,3. Por exemplo, a ligação direta do homólogo CWC22 da proteína do spliceosome-associado com o fator 4a3 da iniciação da tradução eucarióticas (eIF4A3) é necessário para a montagem do complexo4da junção do eXoN. Consistente com isso, um mutante eIF4A3 que carece de afinidade por CWC22 não consegue facilitar a junção de exon emenda de mRNA de complexo-driven4. Assim, o estudo das interações protéicas é crucial para a compreensão precisa da regulação fisiológica, bem como das funções celulares.
Os avanços recentes na espectrometria maciça (MS) foram aplicados à análise detalhada de interações da proteína-proteína. Por exemplo, a coprecipitação de proteínas endógenas ou de proteínas marcadas com as proteínas associadas, seguida pela análise de MS, possibilita a identificação de novas interações protéicas5. Entretanto, um grande gargalo da análise de MS/MS é recuperação pobre das escavações tríptico de amostras da proteína. Para a realização de análises proteômicas em lisados celulares, as técnicas de digestão em gel e na membrana são geralmente empregadas para preparar amostras de MS/MS. Nós temos comparado previamente um procedimento da digestão do em-gel com uma técnica da digestão da em-membrana6, e mostramos que o último estêve associado com a melhor cobertura da seqüência. A membrana do difluoreto do polyvinylidene (PVDF) pode ser apropriada para esta finalidade porque é mecanicamente robusta e resistente às concentrações elevadas de solventes orgânicos7,8, permitindo a digestão enzimática de imobilizados proteínas na presença de 80% acetonitrila9. Além disso, a imobilização em uma membrana pode induzir alterações conformacionais nas proteínas alvo, levando a melhorias na eficiência da digestão tripética10. Consequentemente, neste artigo, nós descrevemos o uso da análise da imunoprecipitação-LC/MS/MS de interações da proteína usando uma técnica da digestão da em-membrana. Este método simples facilita a análise conveniente de interações proteína-proteína mesmo em laboratórios não-especializados.
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Protocol
1. imunoprecipitação
Nota: utilizou-se tampão de lise de sulfato de dodecilo (SDS) não-sódico e eluição de citrato, conforme descrito nas seções a seguir. No entanto, o uso de uma técnica de imunoprecipitação em casa alternativa pode ser também aplicável para a preparação de amostras de LC-MS/MS.
- Transfect cultivou pilhas com os vetores que codificam um Tag do epítopo sozinho ou uma proteína da fusão. Para a aquisição de dados representativos, transferir J774 células (1 x 106) com vetores de codificação de proteína verde fluorescente (GFP) sozinho ou GFP-fundido Capn6 (calpain-6 gene) usando lipossomas catiônicos.
- Conjugar o anticorpo aos grânulos magnéticos.
- Para este efeito, misture o anticorpo anti-GFP (2 μL/reacção) com grânulos magnéticos (25 μL/reacção) em 500 μL de tampão de fosfato de citrato (24,5 mM de ácido cítrico, 51,7 mM de fosfato de sódio dibásico; pH 5,0) num tubo de ensaio de 1,5 mL.
- Gire a mistura a 50 rpm por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave as esferas conjugadas com IgG três vezes com tampão de fosfato de citrato contendo 0,1% de polioxietileno (20) de monolaurato de sorbitano.
- Lyse as células transfected usando um tampão de Lise apropriado. Para a aquisição de dados representativos, lyse as células transfected por 30 min no gelo em 400 μL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% poli (oxyethelene) octilfenilo éter) contendo 40 μmol/L de fenilmetilsulfonila fluoreto, 50 μg/mL leupeptina mL aprotinina, 200 μmol/L de sódio orthovanadate, e 1 mM etileno glicol tetraacético ácido (EGTA) em 1,5 mL tubos de ensaio 24 h após a transfecção.
- Limpar o lisado por centrifugação em 15.000 x g por 5 min e recolher o sobrenadante.
- Preclear o lisado. Adicionar contas magnéticas sem rótulo (25 μL/reacção) num tubo de ensaio de 1,5 mL. Lave as contas três vezes com 500 μL de tampão de fosfato de citrato. Após a remoção do tampão do fosfato do citrato na lavagem final, adicione o lisado da pilha sobre os grânulos magnéticos. Gire a mistura usando rotador a 50 rpm por 30 min à temperatura ambiente.
- Coloc o tubo de teste em um suporte magnético por 5 minutos para a separação magnética, e colete o lysate da pilha. Recomenda-se a utilização do suporte magnético designado pelo fabricante.
- Vincular as proteínas alvo para os grânulos conjugados. Coloc os grânulos G-conjugados da imunoglobulina (IG) em um suporte magnético por 5 minutos para a separação magnética, rejeite o tampão do citrato, e adicione então o lisado da pilha aos grânulos separados.
- Gire a mistura a 50 rpm por 1 h à temperatura ambiente.
- Separe as proteínas alvo de proteínas não-alvo livres. Lave as contas três vezes usando 500 μL de tampão de fosfato de citrato contendo 0,1% de polioxietileno (20) de monolaurato de sorbitano. Após a lavagem final, adicionar 30 μL de tampão citrato (pH 2 – 3), e incubar por 5 min à temperatura ambiente para eluir as proteínas-alvo.
Nota: se a recuperação da imunoprecipitação for insuficiente, o uso de Tags de epítopo alternativos, como FLAG ou HIS, pode melhorar a eficiência. Se a eficiência da eluição for insuficiente, o uso de outros eluantes, como uma solução baseada em SDS, pode melhorar a eficiência.
2. digestão da em-membrana das proteínas
Nota: o uso de materiais e equipamentos sem proteínas é necessário para evitar a contaminação com proteínas exógenas. Além disso, recomenda-se que o operador Use uma máscara cirúrgica e luvas para evitar a contaminação por proteínas humanas.
- Corte as membranas de PVDF em peças de 3 mm x 3 mm usando tesouras cirúrgicas que foram limpas com metanol e secas imediatamente antes do uso.
- Adicionar 2 – 5 μL de etanol nas peças de membrana de PVDF em folha de alumínio limpa.
- Antes de secar completamente, adicione o eluante (2 – 5 μL cada, 4 – 6 peças por amostra) nas membranas hidrofílicas de PVDF e, em seguida, seque as membranas até que a superfície da membrana se torne fosca. As membranas secas podem ser armazenadas a 4 ° c.
- Transfira todas as membranas para 1,5 mL de tubos plásticos, acrescente 20 – 30 μL de etanol para fazer as membranas hidrófilas, e depois retire o etanol usando uma pipeta.
- Antes que a membrana seque completamente, adicione 200 μL de solução de reação baseada em ditiotreitol (DTT) (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT e 20% acetonitrila) e incubar-lo a 56 ° c por 1 h.
- Substitua a solução de reacção por 300 μL de solução de iodoacetamida (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamida e 20% acetonitrila), e incubar para 45 min à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as membranas duas vezes com 1 mL de água destilada e uma vez com 1 mL de acetonitrila a 2% por mistura Vortex por > 10 s.
- Dissolva a tripsina liofilizada MS-grade (tabela de materiais) diretamente na solução de reação (30 mm NH4hco3 contendo 70% acetonitrila). Adicionar 100 μL da solução de reacção contendo 1 μg de tripsina (tabela de materiais) (30 mm NH4hco3 contendo 70% de acetonitrila) e incubar a 37 ° c durante a noite.
- Transfira a solução de reacção que contém as escavações trióticas para um tubo de ensaio limpo de 1,5 mL utilizando uma pipeta.
- Adicionar 100 μL de solução de lavagem (70% de acetonitrila/1% de ácido trifluoroacético) à membrana e incubar a 60 ° c durante 2 h. recolher a solução de lavagem e misturá-la com a solução de reacção. Adicione outro 100 μl de solução de lavagem à membrana e a proceda durante 10 min. Em seguida, colete a solução de lavagem e misture com a solução de reação.
- Cubra o tubo de ensaio com um pedaço de filme de laboratório e fazer um par de pequenos buracos com uma agulha. Seque a solução usando um concentrador de vácuo.
- Dissolver o resíduo em 10 μL de 0,2% de ácido fórmico. Após a centrifugação (12.000 × g, 3 min à temperatura ambiente), transfira o sobrenadante para um tubo de amostra.
Nota: as lavas são as etapas críticas desta seção. Durante a digestão da proteína na membrana, a lavagem das membranas contendo as proteínas imobilizadas após a redução e alquilação com água destilada, seguida de acetonitrila a 2%, por mais de 10 seg cada, é fundamental para a remoção dos reagentes.
3. ionização LC-electrospray (ESI)-análise MS/MS
- Ative um instrumento ESI-MS/MS (tabela de materiais) acoplado a um sistema de HPLC nano-LC (tabela de materiais). Vincule uma pré-coluna (tabela de materiais) e uma coluna analítica (tabela de materiais).
- Antes da análise, calibrar o espectrómetro de massas utilizando digere tripóticos de albumina sérica bovina dissolvida em 0,2% de ácido fórmico, que fornece peptídeos padrão.
- Analise as amostras usando o modo íon positivo e uma faixa de massa de 400 – 1250 m/z; em seguida, adquira até 10 MS/MS Spectra (100 ms cada) com uma faixa de massa de 100 – 1600 m/z e um gradiente linear de 2% – 80% acetonitrila e 0,2% de ácido fórmico para 80 min a um caudal de 300 nL/min.
- Analise os dados de saída usando software para identificação de proteínas (tabela de materiais) para identificar as proteínas associadas ao candidato. Para a identificação positiva de uma proteína candidata, é necessária a detecção de pelo menos um fragmento peptídico de alta fidelidade (> 95% de fidelidade).
- Omita as proteínas que são precipitadas similarmente em lysates GFP-expressando (transfection do vetor que expressa uma etiqueta de GFP sozinho) da lista de proteínas do candidato.
Nota: se poucas proteínas forem identificadas na análise do banco de dados, a modificação das condições de aquisição MS/MS (por exemplo, mudando o tempo de 100 ms cada para 50 ms cada) pode aumentar o número de proteínas identificadas.
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Representative Results
Por meio do procedimento descrito acima, os imunoprecipitantes foram analisados utilizando-se LC-MS/MS (Figura 1). Após a exclusão de proteínas derivadas exogenamente (proteínas de outras espécies e IgGs), 17 proteínas foram identificadas em imunoprecipitantes associados ao calpain-6 (tabela 1) e 15 proteínas foram identificadas em imunoprecipitantes associados à GFP ( Tabela 2). Das proteínas calpain-6 e GFP-associadas, 11 foram identificadas em ambos os imunoprecipitantes (Figura 2). Uma vez que estes e calpain-6 próprios foram excluídos, cinco proteínas associadas do calpain-6 do candidato permaneceram: subunidade C do subcomponente do complemento de 1, tipo II do queratina cytoesquelético 8, proteína IgE-obrigatória, ADP/ATP acilcarnitina 1, e ubiquitin.
Figura 1. Esquema para a técnica da digestão da em-membrana
Os lysates da pilha foram precipitados usando grânulos magnéticos conjugados com os anticorpos específicos. O eluente da imunoprecipitação foi apagado em pedaços de membrana de PVDF. Subseqüentemente, as membranas foram tratadas com os reagentes para o alkylation redutora, e incubadas então com Trypsin. A solução de reação foi então analisada utilizando-se LC-MS/MS. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Visão geral dos dados representativos
Dezessete proteínas foram identificadas no imunoprecipitante associado ao calpain-6 e 15 proteínas foram detectadas no imunoprecipitante associado ao GFP. Destes, 11 proteínas foram identificadas em ambos os imunoprecipitantes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Adesão | Peptídeos (95%) | % COV |
| Actina, citoplasmática 2 | SP | P63260 | ACTG | 5 | 18,4 |
| Actina, músculo liso aórtico | SP | P62737 | ACTA | 5 | 18,57 |
| Actina, citoplasmática 1 | SP | P60710 | ACTB | 5 | 18,41 |
| Actina, músculo esquelético alfa | SP | P68134 | Atos | 5 | 13,53 |
| Actina, músculo cardíaco alfa 1 | SP | P68033 | ACTC | 5 | 13,53 |
| Actina, músculo liso gama-entérico | SP | P63268 | Acth | 5 | 13,56 |
| Fator de alongamento 1-Alpha 1 | SP | P10126 | EF1A1 | 3 | 33,33 |
| Fator de alongamento 1-Alpha 2 | SP | P62631 | EF1A2 | 3 | 16,2 |
| Queratina, tipo II citoesquelético 8 | SP | P11679 | K2C8 | 3 | 22,65 |
| Subunidade C do subcomponente do complemento de i | SP | Q02105 | C1QC | 2 | 8,94 |
| Proteína de ligação IgE | SP | P03975 | O IGEB | 2 | 21,72 |
| Calpain-6 | SP | O35646 | CAN6 | 1 | 15,91 |
| Acilcarnitina 2 de ADP/ATP | SP | P51881 | ADT2 | 1 | 27,52 |
| Acilcarnitina 1 de ADP/ATP | SP | P48962 | ADT1 | 1 | 19,13 |
| Ubiquitin | SP | P62991 | UBIQ | 1 | 40,79 |
| Fator de transcrição relacionado ao Runt 3 | SP | Q64131 | RUNX3 | 1 | 15,89 |
| Isoform 2 do fator de transcrição Runt-Related 3 | SP | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "Peptídeos (95%)" indica o número de peptídeos identificados com um escore de fidelidade > 95% nos dados MS/MS. "% COV" refere-se à percentagem de resíduos de aminoácidos identificados em todos os peptídeos (com > 95% de fidelidade) em relação ao número total de resíduos de aminoácidos que constituem a proteína correspondente. Para melhorar a clareza, as proteínas exógenas (proteínas de outras espécies e IgGs), proteínas ribossômicas e histonas não são mostradas. | |||
Tabela 1. Proteínas associadas ao calpain-6
| Nome | Adesão | Peptídeos (95%) | % COV |
| Fator de alongamento 1-Alpha 1 | SP | P10126 | EF1A1 | 3 | 24,24 |
| Fator de alongamento 1-Alpha 2 | SP | P62631 | EF1A2 | 3 | 24,41 |
| Actina, músculo esquelético alfa | SP | P68134 | Atos | 3 | 13,53 |
| Actina, músculo cardíaco alfa 1 | SP | P68033 | ACTC | 3 | 13,53 |
| Actina, músculo liso gama-entérico | SP | P63268 | Acth | 3 | 13,56 |
| Actina, citoplasmática 2 | SP | P63260 | ACTG | 3 | 13,6 |
| Actina, músculo liso aórtico | SP | P62737 | ACTA | 3 | 13,53 |
| Actina, citoplasmática 1 | SP | P60710 | ACTB | 3 | 13,6 |
| Acilcarnitina 2 de ADP/ATP | SP | P51881 | ADT2 | 2 | 25,5 |
| rRNA 2 '-O-Metiltransferase fibrilarina | SP | P35550 | O FBRL | 2 | 14,37 |
| Proibitina | SP | P67778 | Phb | 1 | 9,19 |
| Ribonucleoproteína nuclear heterogênea U | SP | Q8VEK3 | HNRPU | 1 | 10,63 |
| Fator de transcrição relacionado ao Runt 3 | SP | Q64131 | RUNX3 | 1 | 39,12 |
| Isoform 2 do fator de transcrição Runt-Related 3 | SP | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| Fator de alongamento 1-Gamma | SP | Q9D8N0 | EF1G | 1 | 12,36 |
| "Peptídeos (95%)" indica o número de peptídeos identificados com um escore de fidelidade > 95% nos dados MS/MS. "% COV" refere-se à percentagem de resíduos de aminoácidos identificados em todos os peptídeos (com > 95% de fidelidade) em relação ao número total de resíduos de aminoácidos que constituem a proteína correspondente. Para melhorar a clareza, as proteínas exógenas (proteínas de outras espécies e IgGs), proteínas ribossômicas e histonas não são mostradas. | |||
Tabela 2. Proteínas associadas ao GFP
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Discussion
Nós descrevemos previamente uma análise das modificações oxidativas do apolipoproteína B-100 na lipoproteína de baixa densidade oxidado usando LC-MS/MS precedido por uma técnica da digestão da em-membrana6. No presente estudo, combinamos esta técnica com imunoprecipitação e identificamos várias proteínas associadas ao calpain-6. Esta técnica nova representa um método conveniente da seleção para proteínas associadas do candidato. Calpain-6 é um membro não-proteolítico da família proteolítica Calpain11 que supostamente modificou as funções celulares através de suas interações proteína-proteína12,13. Usando uma técnica da digestão da em-membrana, nós identificamos previamente outras proteínas calpain-6-associadas que empregam um MS diferente ajustou-acima12. Portanto, recomendamos testar várias condições de MS para maximizar o número de candidatos identificados. Pela mesma razão, a avaliação das condições de imunoprecipitação, como os tipos de epítopo mapeado tag, detergente e solução de eluição utilizada, é importante para a obtenção de saídas ideais.
No presente estudo, foram identificadas 11 proteínas nos imunoprecipitantes associados ao calpain-6 e GFP. A maioria das proteínas sobrepostas foram isotipos de actina, e a contaminação com proteínas citoesqueléticas de actina é comum nas análises das interações proteína-proteína celular, pois os níveis de expressão dessas proteínas são muito elevados. Por conseguinte, estes candidatos devem ser omitidos de uma análise ulterior. Além, os fatores do alongamento foram detectados em ambos os immunoprecipitants. Eles regulam a velocidade e fidelidade da síntese proteica e afetam a proteína-dobrável14, e, portanto, a coimunoprecipitação de fatores de alongamento não é surpreendente. Estas proteínas devem igualmente ser omitidas da avaliação mais adicional.
Os imunoprecipitantes podem ser submetidos à alquilação redutora e digestão enzimática diretamente na solução de eluição15, e este método de digestão em solução também pode ser aplicado para a preparação de amostras para MS/MS. Entretanto, nós consideramos o uso da digestão da em-membrana para ter vantagens consideráveis sobre a digestão da em-solução. A membrana de PVDF sere como um andaime para o alquilação redutora subseqüente e a digestão enzimática, significando que os solventes exigidos para estes processos podem ser substituídos facilmente. Conseqüentemente, é possível usar uma variedade de soluções da eluição para a imunoprecipitação. Por outro lado, para a digestão em solução, pode ser desafiador usar soluções de eluição de pH baseadas em SDS ou baixa porque a atividade da protease pode ser limitada nessas condições. Além disso, a imobilização das proteínas-alvo pode facilitar o procedimento de lavagem subsequente. Daqui, a digestão da em-membrana é altamente apropriada para a preparação dos immunoprecipitants para a análise de MS/MS. Um número limitado de proteases pode ser apropriado para este protocolo. Até o momento, apenas o lysyl-C, além da tripsina, é declaradamente ativo na presença de até 80% de acetonitrila6,9,10,15.
Nossa técnica da digestão da em-membrana é apropriada para a identificação das proteínas em uma quantidade pequena de immunoprecipitant com um limite altamente sensível da deteção. No entanto, deve-se lembrar que a eficiência de detecção de uma proteína alvo depende da quantidade presente. As proteínas que estão presentes em quantidades maiores são preferencialmente detectadas e podem impedir que outras proteínas presentes em quantidades menores sejam detectadas pela SM. Não obstante, circunstâncias normais as proteínas numerosas são detectadas usando a análise de LC-MS/MS, e outros ensaios devem ser usados para esclarecer que das proteínas do candidato são do significado biológico apropriado.
Neste estudo, nós avaliamos uma técnica da digestão da em-membrana para a análise dos immunoprecipitants. Um método tão conveniente e abrangente para a análise das interações proteína-proteína deve ser amplamente aplicável para melhorar a produtividade de futuras análises proteômicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado em parte pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI conceder número 17K09869 (para AM), a sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant Number 15K09418 (para TM), uma bolsa de pesquisa da Kanehara Ichiro Medical Science Foundation e uma bolsa de pesquisa da Suzuken Memorial Foundation (tudo para TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
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