Summary
Beskrevet er en protokol til udvikling af målrettede lokale læsioner i genomer (TILLING) af små kornafgrøder med anvendelse af ethylmethanesulfonat (EMS) som mutagent. Der findes også en protokol til mutation Detection ved hjælp af cel-1-analysen.
Abstract
Målretning induceret lokale læsioner i genomer (TILLING) er en kraftfuld reverse genetik værktøj, der omfatter kemisk mutagenese og påvisning af sekvens variation i Target gener. Tilling er et yderst værdifuldt funktionelt genomforskning-værktøj til genvalidering, især i små kerner, hvor Transformations baserede tilgange har alvorlige begrænsninger. Udvikling af en robust, mutageniceret population er afgørende for at bestemme effektiviteten af et TILLING-baseret genvaliderings studie. En FLISEinddelt population med en lav samlet mutation frekvens indikerer, at en upraktisk stor population skal screenes for at finde de ønskede mutationer, hvorimod en høj mutagen koncentration fører til høj dødelighed i befolkningen, hvilket fører til en utilstrækkelig antallet af mutagenicerede individer. Når en effektiv population er udviklet, er der flere måder at detektere mutationer i et gen af interesse, og valget af platform afhænger af eksperimentel skala og tilgængelighed af ressourcer. Cel-1-analysen og agrose gel-baseret tilgang til mutant identifikation er praktisk, reproducerbar og en mindre ressourceintensiv platform. Det er fordelagtigt i, at det er simpelt, kræver ingen beregningsmæssige viden, og det er især egnet til validering af et lille antal gener med grundlæggende laboratorieudstyr. I denne artikel beskrives metoderne til udvikling af en god TILLING-population, herunder forberedelse af doserings kurven, mutagenese og opretholdelse af den mutante population samt screening af den mutante population ved anvendelse af PCR-baseret cel-1-analyse .
Introduction
Punktmutationer i genomer kan tjene mange nyttige formål for forskere. Afhængigt af deres art og placering, kan disse mutationer bruges til at tildele funktioner til gener eller endda særskilte domæner af proteiner af interesse. På den anden side, som en kilde til nye genetiske variation, nyttige mutationer kan vælges til ønskede træk ved hjælp af fænotypebestemmelse skærme og yderligere anvendes i afgrøde forbedring. TILLING er en kraftfuld reverse genetik værktøj, der omfatter kemisk mutagenese og påvisning af sekvens variation i målgenet. Først udviklet i Arabidopsis1 og Drosophilia melanogaster2, tilling populationer er blevet udviklet og udnyttet i mange små kornafgrøder såsom Hexaploid brødhvede (Triticum aestivum)3, Byg (Hordeum vulgare)4, hård hvede (t. dicoccoides hård)5, diploide hvede (t. monococcum)6 og "D" genom stamfader af hvede Aegilops tauschii7 . Disse ressourcer er blevet brugt til at validere rollerne af gener i reguleringen af abiotisk og biotisk stress tolerance8, regulere blomstringstid9, og udvikle ernæringsmæssigt overlegne afgrødesorter5.
TILLING, sammen med brugen af alkylerende mutagene stoffer såsom ethyl methansulfonat (EMS), natriumazid, N-methyl-N-nitrosourea (MNU), og methylmethanesulfonat (MMS), har fordele i forhold til andre reverse Genetics værktøjer af flere årsager. For det første kan mutagenese udføres på praktisk taget enhver art eller variation af plante10 og er uafhængig af Transformations flaskehalsen, hvilket er særlig udfordrende i tilfælde af små korn11. For det andet, ud over at generere knockout-mutationer, der kan opnås ved andre gen validering tilgange, en række missense og splejsning mutationer kan induceres, som kan skelne funktioner af individuelle domæner af proteiner af interesse12. Desuden genererer TILLING en udødelig samling af mutationer i hele genomet; således kan en enkelt population bruges til funktionel validering af flere gener. I modsætning hertil genererer andre reverse Genetics-værktøjer kun ressourcer, som er specifikke for genet under studie13. Nyttige mutationer identificeret gennem TILLING kan anvendes til avlsformål og er ikke omfattet af regulering, i modsætning til genredigering, hvis ikke-transgene klassifikation stadig er usikker i mange lande. Dette bliver især relevant for små korn, der handles internationalt14.
TILLING er en enkel og effektiv genvaliderings strategi og kræver, at der udvikles mutagenicerede populationer til undersøgelse af gener af interesse. Udvikling af en effektiv mutageniceret population er afgørende for at bestemme effektiviteten af en TILLING-baseret genvaliderings undersøgelse. En FLISEinddelt population med en lav samlet mutationsfrekvens indikerer, at en upraktisk stor population skal screenes for de ønskede mutationer, hvorimod en høj mutagen koncentration fører til høj dødelighed i befolkningen og et utilstrækkeligt antal mutagenicerede individer. Når en god befolkning er udviklet, der er flere måder at opdage mutationer i de gener af interesse, og valget af platform afhænger af eksperimentel skala og tilgængelighed af ressourcer. Hele genomsekvensering og exome sekventering er blevet brugt til at karakterisere alle mutationer i tilling populationer i planter med små genomer15,16. Der er udført exome sekventering af to TILLING populationer i brød og hård hvede og er tilgængelig for offentligheden til identificering af ønskværdige mutationer og bestilling af mutant linjer af interesse17. Det er en stor offentlig ressource med hensyn til tilgængeligheden af ønskværdige mutationer; i genvaliderings undersøgelser bør Wild-type-linjen dog være i besiddelse af det kandidat-gen, som er af interesse. Desværre er det stadig koste-uoverkommelige at sekvens af exome af hele TILLING befolkning for reverse genetik-baseret validering af et par kandidat gener i en anden baggrund. Amplicon sekvensering og cel-1-baserede assays har været anvendt til påvisning af mutationer i målrettede populationer i hvede, og cel-1 assays er enklere, kræver ingen beregningsmæssige viden, og er særligt velegnede til validering af et lille antal gener med grundlæggende laboratorieudstyr6,18.
I denne artikel beskrives metoder til udvikling af en god TILLING af populationen, herunder fremstilling af doserings kurven, mutagenese og vedligeholdelse af den mutante population og screening af den mutante population ved anvendelse af PCR-baseret cel-1-analyse . Denne protokol er allerede blevet gennemført med succes med at udvikle og udnytte mutagenicerede populationer af Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, Byg, Aegilops tauchii7og flere Andre. Inkluderet er eksplicitte detaljer om disse metoder sammen med nyttige tips, der vil hjælpe forskerne med at udvikle TILLING populationer, ved hjælp af EMS som et mutagent i enhver lille korn plantevalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af doserings kurven for effektiv mutagenese
- Soak 100 frø med genotype af interesse i 6 250 mL glaskolber (100 i hver kolbe) indeholdende 50 mL destilleret vand. Ryst ved 100 rpm i 8 timer ved stuetemperatur (RT) for opsugning af frøene.
- I en røg hætte, forberede 50 mL af 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, og 1,2% (w/v) ethyl methanesulfonat (EMS) opløsning ved at opløse 0,167, 0,249, 0,331, 0,415, og 0,498 mL EMS i destilleret vand, hhv.
Bemærk: EMS er flydende ved RT med en densitet på 1,206 g/mL.
Forsigtig: Brug passende personlige værnemidler (PPE) under håndtering af EMS. - Vandet hældes ud af fem kolber, og der tilsættes 50 mL EMS-opløsning i hver kolbe, der indeholder imbisofrø, således at seks forskellige behandlinger med 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% og 1,2% EMS-opløsning. Ryst kolberne i 16 timer ved 75 rpm og RT.
- Den afleder EMS-opløsningen og samler de behandlede frø separat for hver behandling med oste klud. Inaktivér den brugte EMS-løsning ved at tilføje en volumen EMS-inaktiverende løsning (0,1 M NaOH, 20% w/v na2S2O3) i 24 timer. Behandl også de forurenede kolber og pipettespidser med EMS-inaktiverende løsning i 24 timer.
- Skyl de EMS-behandlede frø under rindende vand fra hanen i 2 h. transplantation hver frø individuelt til root undervisere, der indeholder indstøbning jord.
- Dyrk planter ved 20 – 25 °C under en lysperiode på 16 timer.
- Registrere data om plantens overlevelse efter 15 dages transplantation. Brug følgende ligning til at beregne overlevelsesraten for hver behandling:
Bemærk: Hvis spire hastigheden er lavere end 100% i kontrollerne, skal der beregnes nøjagtige overlevelsesrater i alle behandlingerne efter fradrag af antallet af frø, der ikke spire i kontrollerne. En overlevelsesrate på 40% – 60% er ønskelig for effektiv mutagenicese. Det kan være nødvendigt at udføre en anden runde af dosis optimering med en modificeret koncentration i henhold til overlevelsen af de behandlede frø indtil opnåelse af den ønskede dødelighed på 40% – 60%.
2. mutagenicese og opretholdelse af mutant population
- Den endelige batch af mindst 3.000 frø fordeles ligeligt (600 frø hver) i 5 1.000 mL kolber, der indeholder 300 mL destilleret vand. Ryst i 8 timer ved 100 rpm under RT for imbibition.
Bemærk: den endelige størrelse af den ønskede population vil afhænge af mutationsfrekvensen og Ploidi niveau af genotypen, men det er tilrådeligt at bruge mindst 3.000 frø til hexaploids, 4.000 frø til tetraploids, og mere end 7.000 frø til diploids. - I en stinkhætte, Forbered 1.500 mL af den optimerede EMS-koncentrations opløsning i destilleret vand.
- Vandet hældes ud af kolberne og tilsættes 300 ml af den optimale koncentration af EMS-opløsningen i hver kolbe, der indeholder 600 drukket-frø. Ryst kolberne i 16 timer ved 75 rpm og RT.
- Decant EMS og indsamle de behandlede frø i oste klud. Inaktivér EMS-opløsningen og behandlings beholderne med EMS-inaktiverende løsning som udført i trin 1,4.
- Skyl de EMS-behandlede frø under rindende ledningsvand i 2 h. transplantation hver EMS-behandlet M1 frø individuelt til root trænere.
- Grow M1 planter (afledt af m0 frø) ved 20 – 25 °c under en 16 h lys periode.
Bemærk: det kan være nødvendigt at vernalize frøplanterne på de to blad trin i 6 uger ved 4 °C, hvis den genotype af interesse har en vinter-type vækst vane. - Tillad M1 planterne at selv bestøve, og høst m2 frø separat for hver frugtbar m1 plante.
Bemærk: for at undgå chancer for potentiel udpassage, dække pigge af M1 planter med bestøvning poser før anthesis. - Plant en enkelt M2 frø fra hver m1 plante for at undgå genetisk redundans.
- Saml væv fra M2 planter på to-bladet fase i 1,1 ml martret 96 brønd mikrorør. Saml ca. 80 mm blad vævet fra hver plante og Optag ID'ET for hver prøve i en vævs indsamlings plan.
- Fryse-tørre blad vævet ved hjælp af en lyophilizer og opbevares ved-80 °C.
- Vedligehold M2 -planterne ved 20 – 25 °c under en lysperiode på 16 timer.
- Optag data om mutant fænotyper af M2 -planterne med jævne mellemrum. De forventede fænotyper er albino, chlorina, græsklædte skyde, broget, delvist frugtbar, steril osv.
- Tillad M2 planterne til selv befrugte og modne. Særskilt høst og gemme M3 frø af M2 planter (figur 1).
Bemærk: M frø anvendes til validering af fænotype i reverse genetik undersøgelser. Derfor skal M være omhyggeligt katalogiseret og opbevaret under kølige og tørre forhold. Alternativt, hvis frøet skal øges i marken, kan hoved rækker plantes for hver M plante, og M frø fra hver række kan høstes og gemmes separat som den TILLING befolkning ressource.
3. cel-1-assay til genetisk karakterisering af mutanter
- Udpak DNA fra blad vævet på M2 ved hjælp af et Plant DNA-ekstraktions udstyr med et DNA-rensningssystem (Se tabel over materialer) efter fabrikantens anvisninger.
- Kvantificere DNA ved hjælp af et spektrofotometer og normalisere DNA-koncentrationerne til 25 ng/μL med nuklease frit vand i 96 brønd blokke.
Bemærk: det er vigtigt at kontrollere kvaliteten af DNA ved at køre det på en gel, da lav-kvalitet DNA (smurt DNA) kan resultere i falske negativer i poolede prøver. - Opret 4X DNA-puljer ved at kombinere DNA fra 4 96 brønd blokke i én plade, samtidig med at række-og kolonne identiteten for hver prøve bevares. Tilsæt 50 μL DNA fra hver enkelt prøve i poolpladen, så hver poolplade godt indeholder 200 μL DNA fra fire forskellige 96 brønd blokke.
- Katalog identiteten af poolede DNA i formatet af Poolpladen-række-kolonne (f. eks pool 1 a1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
- Design genom-specifikke primere [a1] for det gen af interesse ved hjælp af genomspecifikke primere (GSP) side < https://probes.pw.USDA.gov/GSP > med standardindstillinger for polyploide arter. For diploids skal du bruge primer 3 < http://primer3.UT.ee/> til at designe primere ved hjælp af standardindstillinger. Design flere primere, hvis det er nødvendigt, at dække hele kodning region af genet af interesse.
Bemærk: den seneste IWGSC-assembly kan bruges til at opnå sekvenser for genet af interesse for hvede ved hjælp af URGI BLAST Tool < https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST >. Den optimale amplikonen længde er i intervallet 800 – 1500 BP. tabel 1 viser eksempler på primere for voksagtige gener i hexaploid hvede. - Kør en PCR for gen-specifikke primere på poolede DNA som følger:
- Tilsæt 5 μL PCR-buffer, 2 μL (hver) af 4 μM fremadgående og omvendte primere, 0,1 μL DNA-Polymerase (Se tabel over materialer), 5 μl af den samlede DNA-skabelon, og øg derefter lydstyrken til 25 μl ved hjælp af nuklease frit vand.
- Brug en touchdown-profil til at køre PCR-reaktionen på en termisk variator på følgende måde: 95 °c i 1 min, syv cyklusser af 95 °c i 1 min, 67 °c til 60 °c i 1 min med temperaturfald på 1 °c pr. cyklus og 72 °c i 2 min , efterfulgt af 30 cyklusser af 95 °C i 1 min, 60 °C i 1 min, 72 °C i 2 min, og endelig forlængelse ved 72 °C i 7 min.
Bemærk: over PCR profil arbejder på hvede DNA skabelon for de fleste af de primere designet ved hjælp af primer 3 standardindstillinger. I tilfælde af ikke-specifik forstærkning bør PCR-profilen gøres stringent, før du går videre til næste trin.
- Generer heteroduplexer mellem uoverensstemmende DNA ved inkuberet PCR produkter i termisk variator ved hjælp af profilen som følger: 95 °c i 2 min, fem cyklusser af 95 °c for 1 s, 95 °c til 85 °c i 1 min med temperaturfald på 2 °c pr. cyklus, og 60 cyklusser af 85 °c til 25 °c med fald på 1 °C pr. cyklus.
- Tilsæt 2,5 μl hjemmelavet cel-1 endonuklease til de heteroduplexede PCR-produkter og Inkuber i 45 min ved 45 °c. Cel-1-reaktionen afsluttes ved tilsætning af 2,5 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Bemærk: cel-1 endonuklease kan ekstraheres fra friske selleri stilke ved hjælp af den protokol, der udføres af till et al.19 det er meget vigtigt at teste aktiviteten og den optimale mængde af cel-1 endonuklease, som kan testes ved hjælp af tidligere karakteriserede mutanter eller et kommercielt tilgængeligt Mutations detektionssæt. - Kør de cel-1-behandlede produkter på en 3,0% agopstået gel ved 100 V for 2,5 h. Brøndene, der indeholder mindre og unikke spaltet bånd (r), foruden fuld længde uncleaved bands, vil indeholde den mutante DNA-prøve.
- Denconvolute mutant pools.
- Følg trin 3,6, 3,7, 3,8 og 3,9 for individuelle M2 -DNA-prøver, der udgør de mutante puljer identificeret i trin 3,9.
- For at bestemme Zygosity af mutanter, køre to PCR (som beskrevet i trin 3,6) for individuelle M2 DNA, hvor den første reaktion indeholder 2,5 ΜL af m2 DNA og 2,5 μl af vild-type DNA og den anden reaktion indeholder kun 5 μl m2 DNA. Hvis mutationen er heterozygot, vil et ekstra kløvet bånd være til stede i begge reaktioner. På den anden side vil yderligere kløvede bånd kun blive fundet i den første reaktion, hvis mutant er homozygot.
- For at identificere mutationens art skal PCR-produkterne fra de bekræftede mutanter anvendes med en sanger sekvensering, der følger producentens anvisninger.
4. beregning af mutationsfrekvensen
Bemærk: mutationsfrekvensen for en FLISEinddelt population refererer til den gennemsnitlige fysiske afstand, hvor en mutation forekommer i personerne i den pågældende population. For eksempel betyder en mutation frekvens på 1/35 KB i en TILLING befolkning, at en gennemsnitlig person af denne population besidder 1 mutation pr hver 35 KB i genomet.
- For at bestemme mutationsfrekvensen for en FLISEinddelt population beregnes det samlede antal afskærmede baser.
- For at beregne det samlede antal afskærmede baser multipliceres PCR-produktets størrelse med det samlede antal screenede personer.
- Dividerer det samlede antal baser, der er screenet med antallet af unikke mutationer observeret ved hjælp af følgende ligning, som vil give den fysiske region besidder 1 mutation i den givne TILLING befolkning:
Bemærk: for at begrænse begrænsningen i opløsning på 50 BP i begge ender baseret på en agrose gel-baseret platform, trækkes 100 BP fra produktstørrelsen i beregningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser doserings kurven for hexaploid brødhvede sort Jagger, diploide hvede Triticum monococcum6, og en genom donor af hvede Aegilops tauschii7. EMS-doserne for de ønskede 50% overlevelsesrater var omkring 0,25%, 0,6% og 0,7% for t. monococcum, AE. tauschii, og t. aestivum, hhv. Den højere EMS-tolerance over for hexaploid hvede skyldes dens genom-bufferings kapacitet. Men på trods af både at være diploid, EMS tolerance af T. monococcum var næsten halvdelen af AE. tauschii. Derfor understreger disse resultater vigtigheden af at bestemme den relevante EMS-dosis for individuelle genotyper af interesse.
Tilstedeværelsen af let identificerbare fænotyper i M2 populationen bekræfter effektiviteten af mutagenese i små korn populationer. De mutante fænotyper omfatter typisk albino, chlorina, hæmmet, græsklædte skud, brogede, tidlige/sene blomstring, delvist frugtbar og steril. Figur 3 viser nogle typiske mutante fænotyper opnået i tilling populationer.
Cel-1-analysen og agrose gel-baseret tilgang til mutant identifikation er praktisk, reproducerbar og mindre ressourceintensiv platform. Figur 4 viser en mutant identifikation ved hjælp af cel-1 på agrose gel-platforme. Det skal bemærkes, at mutant DNA-baner indeholder unikke mønstre af spaltet bånd. Den første runde af 4X pool screening reducerer arbejdskraft behov, ressourcer, og tid udgifter. For eksempel, som vist i figur 4a, blev en mutant pool identificeret ud af 12 poolede prøver, der repræsenterede 48 individer ved at udføre PCR og cel-1-analysen. Dekoncentreringen af mutante puljer fastsatte Zygosity of mutation og hjalp med at spore mutationen ned til individuelle prøver (figur 4b,C). Figur 3b viser påvisning af heterozygot mutationer i A4-puljen, da unikke, spaltet bånd er til stede i både boks 4-A4 og box 4-A4 + Wild-type DNA-prøver. På den anden side indeholder H5-puljen homozygot mutationer, da unikke, spaltet bånd kun findes i boksen 5-H5 + vild-type DNA-prøve.
Figur 1: skematisk udvikling af EMS-mutagenicerede TILLING populationer i små kornafgrøder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: EMS-doserings kurve i tre forskellige arter af hvede, herunder Triticum aestivum, T. monococcumog Aegilops tauschii. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mutant fænotyper (gule pile) i forskellige små korn M2 vippe populationer. A) en albino mutant i en Byg m2-population,B) chlorina-mutant i en Byg m2-population,C) broget mutant med lyserød misfarvning i en AE. Tauschii m2-population og (D) lav overspænding af mutant i en T. monococcum M2 befolkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mutant-identifikation i 4X-puljer efter dekoncentrering ved hjælp af cel-1-analysen og agrose-gel-baseret tilgang. Vist er (A) mutant pool i Lane 7 med unikke spaltet bånd, (B) dekoncentrering af den heterozygot mutant pulje, detektering af mutationen i A4-prøven af DNA box 4 med unikke spaltet bånd i boks 4-A4 og boks 4-A4 + vild-type DNA-prøver , og (C) dekoncentrering af homozygot mutant, påvisning af mutationen i prøveeksemplar H5 af DNA boks 5 med unikke spaltet bånd kun i boksen 5-H5 + vild-type DNA prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen | Primer-navn | Primer sekvens (5 '-3 ') | Produktstørrelse |
| Voksagtig | Wx_AF | TCGCTCTGCATATCAATTTTGC | 1022 |
| Wx_AR | GGAACTGGCAAGAAGGACTG | ||
| Voksagtig | Wx_BF | GCGTCGTCTCCGAGGTACAC | 870 |
| Wx_BR | GTCGAAGGACGACTTGAACC | ||
| Voksagtig | Wx_DF | CCATGGCCGTAAGCTAGAC | 1124 |
| Wx_DR | GTCGAAGGACGACTTGAACC |
Tabel 1: primere til forstærkning af voksagtige gener i hexaploid hvede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING er et meget værdifuldt omvendt genetik værktøj til genvalidering, især for små korn, hvor Transformations baserede tilgange har alvorlige flaskehalse11. Udvikling af en mutageniceret population med høj mutationsfrekvens er et af de afgørende trin i gennemførelsen af funktionelle genomundersøgelser. Det vigtigste skridt i udviklingen af en robust TILLING befolkning er at bestemme den optimale koncentration af EMS. Overlevelsesraten på 40%-60% i M1 er blevet fundet som en god indikator for effektiviteten af EMS-mutagenese i hvede og Byg4,6,18. De overlevende planter kan give anstændige mutation frekvenser til at hjælpe med at opdage mutationer i ethvert gen af interesse. I ris, frugtbarhed af M1 planten er en anden determinant, ud over overlevelse af m1 planter, og er rapporteret at variere blandt forskellige genotyper20.
Hexaploid brødhvede og tetraploide hård hvede på grund af deres polypoidy, har homoeoalleler i hvert genom for de fleste gener, kompensere for tab af funktion af vigtige gener på grund af mutationer. Dette kaldes genom-buffering. Således, polyploider kan tolerere højere niveauer af EMS doser sammenlignet med diploids på grund af genom buffering21,22. Det er imidlertid velkendt, at tolerance over for forskellige diploide arter til mutagener varierer og kan reguleres af diversitet i genetiske baggrunde. For eksempel, AE. tauschii viste en 55% overlevelsesrate på 0,6% EMS, mens T. monococcum viste en 51% sats med 0,24% EMS; Desuden førte enhver højere koncentration i sidstnævnte art til overdreven plante dødelighed6,7. Vi har tidligere oplevet, at selv i hexaploids, forskellige kultivarer tolerere forskellige mutagene koncentrationer (data ikke vist). Desuden varierer EMS-tolerancen betydeligt mellem de forskellige risgeno typer20. Derfor anbefales det stærkt at få doserings kurver for individuelle genotyper af interesse.
For at analysere effekten af mutagenese bør flere typer af fænotypiske mutanter være synlige fra frøplante stadiet til modenhed af en tilling befolkning7,23,24. De fænotypiske mutanter at bemærke omfatter chlorina, albinoer, brogede blade, hæmmet, bred/smal blade, lav/høj till ering, tidlig/sen blomstring, delvist frugtbar, og steril. Enhver afvigelse fra den vilde type fænotype repræsenterer en potentiel fænotypisk mutant.
Da G og C er de primære målrester af EMS-mutagenese, vil der være bias i Mutations frekvenserne for gener afhængigt af GC-indholdet. En region med højere GC-indhold vil give en høj mutationsfrekvens, hvorimod en region med lavt GC-indhold vil give en lav mutationsfrekvens. For at beregne den korrekte Mutations hyppighed for en TILLING population foreslås det derfor at opnå et gennemsnit på to til tre gener med varierende GC-indhold eller normalisere mutationen til et 50% GC-indhold13.
Cel-1-analysen og agrose gel-baseret protokol beskrevet her er enkle metoder, der ikke kræver dyre instrumentering eller kompleks analyse. Men, det skal bemærkes, at denne metode er kun egnet og effektiv til mutation påvisning i et par gener. For screening mutationer i et større sæt af gener, multiplex amplikonen sekvensering metode anbefales3,24. For en detaljeret protokol om multiple amplikonen sekvensering metode, læsere kan henvise til Tsai et al.25 med fremskridt i sekvensering teknologi og reducerede omkostninger til sekvensering, platforme såsom exome Capture har været brugt i karakterisering af mutationer på tværs af en hele genomet i hele populationen af hvede TILLING17. For planter med små genomer, kan selv hele genomer af alle individer i den tilling befolkning være sekventeret15,16. Men omkostningerne ved screening alle mutationer i enkeltpersoner af en given TILLING befolkning gør det dyrt udføre hel-genomsekvensering for en population udviklet til specifikke formål. Derfor, for at udføre reverse genetik-baseret validering for et begrænset antal kandidat gener i ethvert laboratorium med regelmæssig molekylær biologi instrumentering, cel-1 baserede assays er en anstændig metode til valg. Ikke desto mindre er valget af platform til påvisning af mutationer sekundært til at udvikle en TILLING befolkning, der harkedeligt flere mutationer i hele genomet. Derfor er det mest kritiske trin i protokollen udvikling af en robust VIPPE population med en høj mutationsfrekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1016879 og Maryland Agricultural eksperiment Station via MAES Grant No. 2956952.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R.
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L.
