Summary
Описано это протокол для разработки ориентации индуцированных местных поражений в геномах (TILLING) населения в мелких зерновых культур с использованием этилового метанасульфоната (EMS) в качестве мутагена. Также предусмотрен протокол для обнаружения мутаций с помощью асссея Cel-1.
Abstract
Ориентация на индуцированные локальные поражения в геномах (TILLING) является мощным инструментом обратной генетики, который включает в себя химический мутагенез и обнаружение вариации последовательности в генах-мишенях. TILLING является очень ценным функциональным инструментом геномики для проверки генов, особенно в небольших зернах, в которых подходы, основанные на трансформации, имеют серьезные ограничения. Разработка надежной мутагенизированной популяции является ключом к определению эффективности исследования генной валидации на основе TILLING. Популяция TILLING с низкой общей частотой мутаций указывает на то, что непрактично большая популяция должна быть проверена, чтобы найти желаемые мутации, в то время как высокая концентрация мутагена приводит к высокой смертности в популяции, что приводит к недостаточной мутагенизированных особей. После того, как эффективная популяция будет разработана, существует несколько способов обнаружения мутаций в интересуемом гене, и выбор платформы зависит от экспериментального масштаба и наличия ресурсов. Cel-1 ассса и агарозный гель-подход для идентификации мутантов является удобным, воспроизводимым и менее ресурсоемким платформой. Это выгодно тем, что оно простое, не требующее вычислительных знаний, и особенно подходит для проверки небольшого количества генов с базовым лабораторным оборудованием. В настоящей статье описаны методы развития хорошей популяции TILLING, включая подготовку кривой дозировки, мутагенеза и поддержание популяции мутантов, а также скрининг популяции мутантов с использованием анализов Cel-1 на основе ПЦР .
Introduction
Точечные мутации в геномах могут служить исследователям многим полезными целями. В зависимости от их характера и местоположения, эти мутации могут быть использованы для присвоения функций генам или даже различным областям белков, представляющих интерес. С другой стороны, в качестве источника новых генетических вариаций, полезные мутации могут быть выбраны для желаемых признаков с помощью фенотипирования экранов и далее используется в улучшении урожая. TILLING является мощным инструментом обратной генетики, который включает в себя химический мутагенез и обнаружение изменения последовательности в гене-мишени. Впервые разработан в Arabidopsis1 и Drosophilia melanogaster2, TILLING популяций были разработаны и использованы во многих небольших зерновых культур, таких как гексаплоидный хлеб пшеницы (Triticum aestivum)3, ячмень (Hordeum vulgare)4, тетраплоидная пшеница дурума (T. dicoccoides durum)5, диплоидная пшеница (T. monococcum)6 и "D" геном прародитель пшеницы Aegilops tauschii7 . Эти ресурсы были использованы для проверки роли генов в регулировании абиотических и биотических стрессоустойчивость8, регулирующие время цветения9, и развивающихся питательно превосходных сортов сельскохозяйственных культур5.
TILLING, наряду с использованием алкилирующих мутагенных агентов, таких как этил метанесульфонат (EMS), азид натрия, N-метил-N-нитросурея (MNU), и метилметанесульфонат (MMS), имеет преимущества по сравнению с другими инструментами обратной генетики по нескольким причинам. Во-первых, мутагенез может проводиться практически на любом виде или сорте растения10 и не зависит от узкого места трансформации, что особенно сложно в случае мелких зерен11. Во-вторых, в дополнение к генерации нокаут мутации, которые могут быть получены с помощью других подходов проверки генов, ряд неправильности и сплайсинга мутации могут быть вызваны, которые могут различить функции отдельных областей белков, представляющих интерес12. Кроме того, TILLING генерирует бессмертную коллекцию мутаций по всему геному; таким образом, одна популяция может быть использована для функциональной проверки нескольких генов. В отличие от этого, другие инструменты обратной генетики генерировать ресурсы, характерные только для гена в исследовании13. Полезные мутации, выявленные с помощью TILLING, могут быть развернуты в целях размножения и не подлежат регулированию, в отличие от редактирования генов, чья нетрансгенная классификация по-прежнему не определена во многих странах. Это становится особенно актуальным для мелких зерен, которые на международном рынке торгуются14.
TILLING является простой и эффективной стратегией проверки генов и требует разработки мутагенизированных популяций для исследования генов, представляющих интерес. Разработка эффективной мутагенизированной популяции является ключом к определению эффективности исследования генной валидации на основе TILLING. Популяция TILLING с низкой общей частотой мутаций указывает на то, что непрактично большая популяция должна быть проверена на желаемые мутации, в то время как высокая концентрация мутагенов приводит к высокой смертности в популяции и недостаточному числу мутагенизированных особей. После того, как хорошая популяция будет разработана, существует несколько способов обнаружения мутаций в интересуемых генах, а выбор платформы зависит от экспериментального масштаба и наличия ресурсов. Полное секвенирование генома и секвенирование экзома было использовано для характеристики всех мутаций в популяциях TILLING в растениях с небольшими геномами15,16. Exome секвенирование двух популяций TILLING было выполнено в хлебе и пшенице durum и доступно для общественности для выявления желательных мутаций и заказа мутантных линий интереса17. Это большой общественный ресурс с точки зрения наличия желательных мутаций; однако, в исследованиях проверки гена, линия дикого типа должна обладать интересующим геном-кандидатом. К сожалению, это все еще непомерно затратный секвенировать экзома всей популяции TILLING для обратной генетики на основе проверки нескольких генов-кандидатов в другом фоне. Ампликон секвенирования и Cel-1 основе анализы были использованы в обнаружении мутаций в целевых популяций в пшенице, и Cel-1 анализы проще, не требуя вычислительных знаний, и особенно подходят для проверки небольшого числа генов с основными лабораторное оборудование6,18.
В настоящей статье описаны методы развития хорошей популяции TILLING, включая подготовку кривой дозировки, мутагенеза и поддержание популяции мутантов, а также скрининг популяции мутантов с использованием анализов Cel-1 на основе ПЦР . Этот протокол уже успешно реализован в разработке и использовании мутагенизированных популяций Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, ячменя, Aegilops tauchii7, и несколько Другие. Включены явные детали этих методов наряду с полезными советами, которые помогут исследователям развивать популяции TILLING, используя EMS в качестве мутагена в любом небольшом зерновом заводе выбора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка кривой дозировки для эффективного мутагенеза
- Замочите 100 семян с генотипом интереса в шести 250 мл стеклянных колб (100 в каждой колбе), содержащей 50 мл дистиллированной воды. Встряхните при 100 об/мин в течение 8 ч при комнатной температуре (RT) для впитывания семенами.
- В дымовой капот, подготовить 50 мл 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, и 1,2% (w/v) этилметанесульфонат (EMS) решение растворения 0,167, 0,249, 0,331, 0,415, и 0,498 мл ЭМС в дистиллированной воде, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: EMS является жидким на RT с плотностью 1,206 г/мл.
ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующее индивидуальное защитное оборудование (PPE) при обращении с EMS. - Декант воды из пяти колб и добавить 50 мл раствора EMS в каждой колбе, содержащей впитанные семена так, что Есть шесть различных процедур с 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, и 1,2% EMS решение. Встряхните колбы для 16 ч при 75 об/мин и RT.
- Декант раствор EMS и собирать обработанные семена отдельно для каждой обработки с помощью сырной ткани. Инактивируйте использованное решение EMS, добавив один том раствора EMS-инактивирования (0,1 M NaOH, 20% w/v Na2S2O3) за 24 ч. Также обработайте загрязненные колбы и пипетки с помощью раствора, инактивирующие EMS, в течение 24 ч.
- Вымойте EMS обработанных семян под проточной водопроводной водой в течение 2 ч. Трансплантация каждого семени индивидуально в корневые тренажеры, содержащие почву заливки.
- Выращивайте растения при 20-25 градусах Цельсия при 16-м л.
- Запись данных о выживаемости растений после 15 дней трансплантации. Используйте следующее уравнение для расчета выживаемости для каждого лечения:
ПРИМЕЧАНИЕ: Если скорость прорастания ниже 100% в элементах управления, точные показатели выживаемости во всех лечения должны быть рассчитаны после вычитания количество семян, которые не прорастают в элементах управления. Выживаемость 40%-60% желательно для эффективного мутагенеза. Это может потребоваться для выполнения второго раунда оптимизации дозы с измененной концентрацией в зависимости от выживания обработанных семян до достижения желаемого коэффициента летальности 40%-60%.
2. Мутагенез и содержание популяции мутантов
- Замочите последнюю партию, по крайней мере 3000 семян, разделяющих поровну (600 семян каждый) в пяти 1000 мл колбы, содержащие 300 мл дистиллированной воды. Встряхните в течение 8 ч при 100 об/мин при RT для впитывания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный размер желаемой популяции будет зависеть от частоты мутации и уровня флоиди генотипа, но желательно использовать не менее 3000 семян для гексаплоидов, 4000 семян для тетраплоидов и более 7000 семян для диплоидов. - В дымящийся капот приготовьте 1500 мл оптимизированного раствора концентрации EMS в дистиллированной воде.
- Декант воды из колбы и добавить 300 мл оптимальной концентрации раствора EMS в каждой колбе, содержащей 600 впитанных семян. Встряхните колбы на 16 ч при 75 об/мин и RT.
- Декант EMS и собирать обработанные семена в сырной ткани. Инактивируйте раствор EMS и контейнеры для обработки с помощью решения, инактивируемого EMS, как это делается на этапе 1.4.
- Вымойте EMS обработанных семян под проточной водопроводной водой в течение 2 ч. Трансплантация каждого EMS-обработанных M1 семян индивидуально в корневые тренажеры.
- Выращивайте растения M1 (производные от семян M0) при 20-25 градусах Цельсия при 16-м л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребоваться для vernalize саженцы на стадии двух листьев в течение 6 недель при 4 градусах Цельсия, если генотип интереса имеет зимой типа роста привычки. - Разрешить M1 растений для самостоятельного опывания, и урожай M2 семена отдельно для каждого плодородного растения М1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать шансов потенциального перехиппинга, накройте шипы растений M1 пакетами опыления перед anthesis. - Завод одного М2 семян от каждого растения M1, чтобы избежать генетической избыточности.
- Соберите ткани из растений M2 на двухлистной стадии в 1,1 мл из мучил 96 хорошо микротруб. Соберите около 80 мм листовой ткани с каждого растения и запишите идентификатор каждого образца в плане сбора тканей.
- Заморозить-сухой ткани листьев с помощью лиофилизатора и хранить при -80 градусах Цельсия.
- Поддерживайте растения M2 при 20-25 градусах Цельсия при 16-м л.
- Запись данных о фенотипах мутантов растений M2 регулярно. Ожидаемые фенотипы альбиносы, хлорины, травянистые побеги, пестрые, частично плодородные, стерильные и т.д.
- Разрешить M2 растений для самоудобрения и созревания. Отдельно урожай и сохранить Семена M3 из M2 растений (рисунок1).
ПРИМЕЧАНИЕ: M семена используются для проверки фенотипа в обратном исследования генетики. Поэтому M следует тщательно каталогизировать и хранить в прохладных и сухих условиях. Кроме того, если семена должны быть увеличены в поле, головные ряды могут быть посажены для каждого растения M, и Семена M из каждого ряда могут быть собраны и сохранены отдельно в качестве ресурса населения TILLING.
3. Cel-1 асссидлявый для генетической характеристики мутантов
- Извлеките ДНК из листовой ткани M2 с помощью комплекта для извлечения ДНК растений с системой очистки ДНК (см. ТаблицуМатериалов) в соответствии с рекомендациями производителя.
- Количественная ДНК с помощью спектрофотометра и нормализуйте концентрацию ДНК до 25 нг/Л с нуклеазой-свободной водой в 96 колодцах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проверить качество ДНК, запустив ее на гель, так как низкокачественная ДНК (смазанная ДНК) может привести к ложным негативам в объединенных образцах. - Создайте 4x ДНК пулы, объединив ДНК из четырех 96 блоков скважины в одну пластину, сохраняя при этом ряд и столбец идентичности каждого образца. Добавьте 50 кЛ ДНК из каждого отдельного образца в бильярдную тарелку, чтобы каждая тарелка бассейна хорошо содержит в общей сложности 200 л ДНК из четырех различных 96 блоков скважин.
- Каталог итог объединенной ДНК в формате Pool Plate-Row-Column (например, пул 1 A1 и Box1A1 - Box2A1 - Box2A1 - Box3A1 - Box4A1 - Box4A1 ).
- Дизайн генома конкретных праймеров «A1» для гена, представляющих интерес, используя геном конкретных праймеров (GSP) страница lt;https://probes.pw.usda.gov/GSP gt; с настройками по умолчанию для полиплоидных видов. Для диплоидов используйте Primer 3 lt;http://primer3.ut.ee/'gt; для проектирования праймеров с использованием настроек по умолчанию. Дизайн нескольких грунтовок, если это необходимо, чтобы охватить всю область кодирования гена интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последняя сборка IWGSC может быть использована для получения последовательностей для гена, интересуемого пшеницей, используя инструмент URGI BLAST lt;https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST-gt.gt.. Оптимальная длина ампликона находится в диапазоне 800-1500 б.п. Таблица 1 показывает примеры грунтовок для восковых генов в гексаплоидной пшенице. - Выполнить ПЦР для генных грунтовков на объединенной ДНК следующим образом:
- Добавьте 5 qL буфера ПЦР, 2 qL (каждый) из 4 мкм вперед и обратные грунтовки, 0,1 л полимеразы ДНК (см. Таблица материалов), 5 зл ел объединенного шаблона ДНК, затем увеличьте объем до 25 qL с помощью безнужной воды.
- Используйте профиль касания вниз для того чтобы побежать реакция PCR на тепловом цикле следующим образом: 95 C для 1 min, 7 циклов 95 C для 1 мин, 67 C до 60 C для 1 min с понижением температуры 1 C в цикл е и 72 C для 2 мин , а затем 30 циклов 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин, 60 c в течение 1 мин, 72 C в течение 2 мин, и окончательное расширение на 72 C в течение 7 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выше пЦР профиль работает на шаблоне ДНК пшеницы для большинства грунтовок, разработанных с использованием грунтовки 3 параметров по умолчанию. В случае неспецифического усиления профиль ПЦР следует сделать строгим, прежде чем переходить к следующим шагам.
- Генерировать гетеродуплексы между несовпадением ДНК путем инкубации продуктов ПЦР в тепловом цикле с использованием профиля следующим образом: 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, пять циклов 95 градусов по Цельсию на 1 с, 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин с понижением температуры от 2 градусов по Цельсию за цикл, и 60 циклов от 85 до 25 градусов с уменьшается на 1 градус цельсия за цикл.
- Добавьте 2,5 злителк домашней эндонуклеазы Cel-1 в неоздоровую продукцию ПЦР и инкубировать в течение 45 мин при 45 градусах Цельсия. Прекратите реакцию Cel-1, добавив 2,5 л 0,5 М ЭДТА (pH 8.0).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндонуклеаза Cel-1 может быть извлечена из свежих стеблей сельдерея с помощью протокола, выполненного Till et al.19 Очень важно проверить активность и оптимальное количество эндонуклеазы Cel-1, которая может быть протестирована с использованием ранее охарактеризованных мутантов или коммерчески доступный набор обнаружения мутаций. - Запустите Cel-1 обработанных продуктов на 3,0% агарозный гель на 100 В за 2,5 ч. Скважины, содержащие меньшие и уникальные расщепленные полосы (ы), в дополнение к полнометражным дядедными полосами, будут содержать образец ДНК мутантов.
- Денконволутные бассейны-мутанты.
- Выполните шаги 3.6, 3.7, 3.8 и 3.9 для отдельных образцов ДНК M 2, составляющих пулы мутантов, идентифицированные в шаге 3.9.
- Чтобы определить zygosity мутантов, запустить два ПЦР (как описано в шаге 3.6) для отдельных M2 ДНК, в котором первая реакция содержит 2,5 злл Из M2 ДНК и 2,5 л ДНК дикого типа и вторая реакция содержит только 5 Зл М2 ДНК. Если мутация гетерозиготная, в обеих реакциях будет присутствовать дополнительная расщепляемая полоса. С другой стороны, дополнительные расщепляемые полосы будут найдены только при первой реакции, если мутант гомозигот.
- Чтобы определить характер мутации, последовательность ПЦР продуктов подтвержденных мутантов с помощью платформы секвенирования Sanger в соответствии с инструкциями производителя.
4. Расчет частоты мутаций
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота мутации популяции TILLING относится к среднему физическому расстоянию, на котором одна мутация происходит у индивидуумов этой популяции. Например, частота мутаций 1/35 кб в популяции TILLING означает, что средний человек этой популяции обладает 1 мутацией на каждые 35 кб в геноме.
- Чтобы определить частоту мутаций популяции TILLING, вычислите общее количество проверенных баз.
- Чтобы вычислить общее количество проверенных баз, умножьте размер продукта ПЦР на общее количество проверенных лиц.
- Разделите общее количество оснований, скрининговых на количество уникальных мутаций, наблюдаемых с помощью следующего уравнения, что даст физический регион, обладающий 1 мутацией в данной популяции TILLING:
ПРИМЕЧАНИЕ: Для учета ограничения в разрешении 50 bp на обоих концах на основе агарозного геля на основе платформы, вычесть 100 bp от размера продукта в расчете.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показана кривая дозировки гексаплоидного хлеба пшеницы сорт Джаггер, диплоидная пшеница Triticum monococcum6, и геном донор пшеницы Aegilops tauschii7. Дозы EMS для желаемых 50% выживаемости составили около 0,25%, 0,6% и 0,7% для T. monococcum, Ae. tauschii, и T. aestivum, соответственно. Более высокая эмсоционистская переносимость гексаплоидной пшеницы обусловлена ее буферной способностью генома. Однако, несмотря на то, что оба были диплоидными, толерантность К ЭМС T. monococcum была почти в два раза меньше, чем у Ae. tauschii. Таким образом, эти результаты подчеркивают важность определения соответствующей дозы EMS для отдельных генотипов интереса.
Наличие легко идентифицируемых фенотипов в популяции М2 подтверждает эффективность мутагенеза в небольших популяциях зерна. Фенотипы мутантов обычно включают альбиносы, хлорины, задержки, травянистые побеги, пестрые, ранние / поздние цветения, частично плодородные, и стерильные. На рисунке 3 показаны некоторые типичные фенотипы мутантов, полученные в популяциях TILLING.
Подход к идентификации мутантов на основе агарозного геля Cel-1 и агарозного геля является удобной, воспроизводимой и менее ресурсоемкой платформой. На рисунке 4 показана идентификация мутантов с помощью Cel-1 на платформах агарозного геля. Следует отметить, что полосы ДНК-мутантов содержат уникальные узоры расщепляющейся полосы. Первый раунд скрининга 4x бассейн уменьшает потребности в рабочей силе, ресурсы и время расходов. Например, как показано на рисунке 4A,один пул мутантов был идентифицирован из 12 объединенных образцов, представляющих 48 человек, выполняя ПЦР и cel-1. Деконволюция пулов мутантов определила zygosity мутации и помогла отследить мутацию до отдельных образцов(рисунок 4B,C). На рисунке 3B показано обнаружение гетерозиготных мутаций в бассейне A4, так как уникальные, расщепляемые полосы присутствуют в обоих образцах ДНК Box 4-A4 и Box 4-A4. С другой стороны, бассейн H5 содержал гомозиготные мутации, так как уникальные, расщепляемые полосы присутствуют только в образце ДНК Box 5-H5.
Рисунок 1: Схема развития ПОПУЛЯЦИй EMS-мутагенизированных TILLING в небольших зерновых культурах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: КРИвая дозировки EMS в трех различных видах пшеницы, включая Triticum aestivum, T. monococcum, и Aegilops tauschii. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: мутантные фенотипы (желтые стрелки) в различных небольших популяциях M2 TILLING. ()Мутант альбиносов в популяции ячменя M2, (B) хлорина мутант в популяции ячменя M2, (C) пестрый мутант с розовым обесцвечиванием в Ae. tauschii M2 населения, и (D) низкий руля терпя в T. monococcum Население М2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Идентификация мутантов в 4x бассейнах после деконволюции с использованием ассея Cel-1 и подхода на основе геля агарозы. Показано :A) мутант бассейн в переулок 7 с уникальными расщепляющимися полосами, (B) deconvolution гетерозиготного мутанта бассейн, обнаружение мутации в образце A4 ДНК Box 4 с уникальными расщепляется полос ы в box 4-A4 и Box 4-A4 "дикий тип ДНК образцов , и (C) деконволюция гомозиготного мутанта, обнаружение мутации в h5 образца ДНК Box 5 с уникальными расщепляющимися полосами только в box 5-H5 "дикий тип образца ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Ген | Имя праймер | Последовательность праймер (5'-3') | Размер продукта |
| Восковой | Wx-AF | ТГКККККАТТАТЦААТТТГК | 1022 г. |
| Wx-AR | GGAACTGGCAAGAAGGACTG | ||
| Восковой | Wx-BF | GCGTCGCTCCGAGATACAC | 870 |
| Wx-BR | ГТГГАГАГАГАКТАКТГААКК | ||
| Восковой | Wx-DF | CCATGGGTAAGCTAGAC | 1124 год |
| Wx-DR | ГТГГАГАГАГАКТАКТГААКК |
Таблица 1: Праймеры для усиления восковых генов в гексаплоидной пшенице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING является весьма ценным инструментом обратной генетики для проверки генов, особенно для мелких зерен, где трансформационные подходы имеют серьезные узкие места11. Развитие мутагенизированной популяции с высокой частотой мутаций является одним из важнейших этапов в проведении функциональных исследований геномики. Наиболее важным шагом в развитии надежной популяции TILLING является определение оптимальной концентрации ЭМС. 40%-60% выживаемости в M1 было установлено, что хороший показатель эффективности ЭМС мутагенеза в пшенице и ячмене4,6,18. Выжившие растения могут обеспечить достойные частоты мутаций, чтобы помочь обнаружить мутации в любом гене, представляющих интерес. В рисе плодородие растения М1 является еще одним определяющим фактором, в дополнение к выживанию растений М1, и, как сообщается, различаются между различными генотипами20.
Гексаплоидный хлеб пшеницы и тетраплоидных durum пшеницы, из-за их полипой, имеют homoeoalleles в каждом геноме для большинства генов, компенсируя потерю функции важных генов из-за мутаций. Это называется буферизированием генома. Таким образом, полиплоиды могут терпеть более высокие уровни доз ЫМС по сравнению с диплоидами из-за буферизации генома21,22. Однако известно, что переносимость различных диплоидных видов к мутагенам варьируется и может регулироваться разнообразием в генетическом происхождении. Например, Ae. tauschii показал 55% выживаемость на 0,6% EMS, в то время как T. monococcum показал 51% ставка с 0,24% EMS; кроме того, любая более высокая концентрация в последнем виде привела к чрезмерной гибели растений6,7. Ранее мы испытывали, что даже в гексаплоидах различные сорта переносят различные концентрации мутагенов (данные не показаны). Кроме того, допуск EMS значительно варьируется между различными генотипами риса20. Поэтому настоятельно рекомендуется получать дозировку кривых для индивидуального генотипа интереса.
Для того, чтобы проанализировать эффективность мутагенеза, несколько видов фенотипических мутантов должны быть видны от стадии рассады до зрелости популяции TILLING7,23,24. Фенотипические мутанты, чтобы отметить включают хлорину, альбиносы, пестрые листья, низкорослые, широкие / узкие листья, низкий / высокий пахоты, раннее / позднее цветение, частично плодородные, и стерильные. Любое отклонение от фенотипа дикого типа представляет собой потенциального фенотипического мутанта.
Поскольку G и C являются основными целевыми остатками ЭМС-мутагенеза, в частотах мутаций генов будет возникать предубеждение в зависимости от содержания GC. Регион с более высоким содержанием GC даст высокую частоту мутаций, в то время как регион с низким содержанием GC даст низкую частоту мутации. Для расчета правильной частоты мутаций популяции TILLING предлагается получить в среднем от двух до трех генов с разным содержанием GC или нормализовать скорость мутации до 50% содержания GC13.
Анализ Cel-1 и агарозный гель-протокол, описанный здесь, являются простыми методами, которые не требуют дорогостоящих приборов или сложного анализа. Однако следует отметить, что этот метод подходит только для обнаружения мутаций в нескольких генах. Для скрининга мутаций в большом наборе генов рекомендуется метод секвенирования мультиплексного ампликона3,24. Для подробного протокола по методу секвенирования множественных ампромтонов читатели могут обратиться к Tsai et al.25 С достижениями в технологии секвенирования и снижением затрат на секвенирование, платформы, такие как захват экзомы, были использованы в характеристике мутаций по всему весь геном во всей пшенице TILLING населения17. Для растений с небольшими геномами, даже целые геномы всех людей в популяции TILLING могут быть секвенированы15,16. Тем не менее, стоимость скрининга всех мутаций у людей данной популяции TILLING делает его дорогим выполнять секвенирование всего генома для популяции, разработанной для конкретных целей. Таким образом, для выполнения обратной генетики на основе проверки для ограниченного числа генов-кандидатов в любой лаборатории с регулярной молекулярной биологии приборов, Cel-1 основан анализы достойный метод выбора. Тем не менее, выбор платформы для обнаружения мутаций является вторичным по сравнению с развитием популяции TILLING, укрывающей несколько мутаций по всему геному. Поэтому наиболее важным шагом в протоколе является разработка надежной популяции TILLING с высокой частотой мутаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством сельского хозяйства США Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства, Проектом Hatch 1016879 и Мэрилендской сельскохозяйственной экспериментальной станцией через MAES Grant No 2956952.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R.
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L.
