Summary
Beskrevet er en protokoll for utvikling av en målgruppe indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) befolkning i små korn avlinger med bruk av etanol methanesulfonate (EMS) som en arvestoffskadelig. Også gitt er en protokoll for mutasjon deteksjon ved hjelp av cel-1-analysen.
Abstract
Målretting indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) er et kraftig omvendt genetikk verktøy som inkluderer kjemiske mutagenese og deteksjon av sekvens variasjon i mål gener. TILLING er et svært verdifullt funksjonelt Genomics verktøy for gen validering, spesielt i små korn der transformasjon-baserte tilnærminger holder alvorlige begrensninger. Å utvikle en robust mutagenized befolkning er nøkkelen til å bestemme effektiviteten av en TILLING-basert gen validerings studie. En TILLING befolkning med en lav samlet mutasjon frekvens indikerer at en uhensiktsmessig stor befolkning må undersøkes for å finne ønskede mutasjoner, mens en høy arvestoffskadelig konsentrasjon fører til høy dødelighet i befolkningen, noe som fører til en utilstrekkelig antall mutagenized individer. Når en effektiv befolkning er utviklet, er det flere måter å oppdage mutasjoner i et gen av interesse, og valg av plattform avhenger av eksperimentell skala og tilgjengelighet av ressurser. Cel-1-analysen og agarose gel-basert tilnærming for mutant identifisering er praktisk, reproduserbar og en mindre ressurs intensiv plattform. Det er en fordel i at det er enkelt, krever ingen beregningsorientert kunnskap, og det er spesielt egnet for validering av et lite antall gener med grunnleggende laboratorieutstyr. I denne artikkelen er beskrevet metodene for utvikling av en god TILLING befolkning, inkludert utarbeidelse av dosering kurve, mutagenese og vedlikehold av mutant befolkningen, og screening av mutant befolkningen ved hjelp av PCR-baserte cel-1 analysen .
Introduction
Point mutasjoner i genomer kan tjene mange nyttige formål for forskere. Avhengig av deres natur og plassering, kan disse mutasjoner brukes til å tildele funksjoner til gener eller til og med forskjellige domener av proteiner av interesse. På den annen side, som en kilde til romanen genetisk variasjon, kan nyttige mutasjoner velges for ønskede egenskaper ved hjelp av bestemmelse av fenotype skjermer og videre brukt i avling forbedring. TILLING er et kraftig omvendt genetikk verktøy som inkluderer kjemisk mutagenese og deteksjon av sekvens variasjon i målet genet. Først utviklet i Arabidopsis1 og Drosophilia melanogaster2, TILLING populasjoner har blitt utviklet og benyttet i mange små korn avlinger som hexaploid brød hvete (Triticum aestivum)3, Bygg (Hordeum vulgare)4, Tetraploid durum hvete (t. dicoccoides durum)5, diploid hvete (t. monococcum)6 og "D" Genova stamfar av hvete Aegilops tauschii7 . Disse ressursene har blitt brukt til å validere rollene til gener i regulering abiotiske og biotiske stress toleranse8, regulere blomstrende tid9, og utvikle ernæringsmessig overlegen avling varianter5.
TILLING, sammen med bruk av alkylating mutagent agenter som etanol methanesulfonate (EMS), natrium Natriumazid, N-metyl-N-nitrosourea (MNU), og methyl methanesulfonate (MMS), har fordeler fremfor andre omvendt genetikk verktøy av flere grunner. Først, mutagenese kan gjennomføres på praktisk talt alle arter eller variasjon av anlegget10 og er uavhengig av transformasjon flaskehalsen, som er spesielt utfordrende i tilfelle av små korn11. For det andre, i tillegg til å generere knockout mutasjoner som kan fås ved andre gen validering tilnærminger, en rekke missense og skjøting mutasjoner kan bli indusert, som kan skjelne funksjoner av individuelle domener av proteiner av interesse12. Videre genererer TILLING en udødelig samling av mutasjoner i hele Genova; Dermed kan en enkelt befolkning brukes til funksjonell validering av flere gener. I motsetning til dette genererer andre omvendt genetikk verktøy ressurser som er spesifikke for bare genet under studie13. Nyttige mutasjoner identifisert gjennom TILLING kan distribueres til avl formål og er ikke underlagt regulering, i motsetning til genredigering, hvis ikke-transgene klassifisering er fortsatt usikkert i mange land. Dette blir spesielt relevant for små korn som er internasjonalt omsatt14.
TILLING er en enkel og effektiv gen validerings strategi og krever at mutagenized populasjoner utvikles for å undersøke gener av interesse. Å utvikle en effektiv mutagenized befolkning er nøkkelen til å bestemme effektiviteten av en TILLING-basert gen validerings studie. En TILLING befolkning med en lav samlet mutasjon frekvens indikerer at en uhensiktsmessig stor befolkning må undersøkes for ønskede mutasjoner, mens en høy arvestoffskadelig konsentrasjon fører til høy dødelighet i befolkningen og et utilstrekkelig antall mutagenized individer. Når en god befolkning er utviklet, er det flere måter å oppdage mutasjoner i genene av interesse, og valg av plattform avhenger av eksperimentell skala og tilgjengelighet av ressurser. Hele Genova sekvensering og exome sekvensering har blitt brukt til å karakterisere alle mutasjoner i TILLING populasjoner i planter med små genomer15,16. Exome sekvensering av to TILLING populasjoner har blitt utført i brød og durum hvete og er tilgjengelig for allmennheten for å identifisere ønskelig mutasjoner og bestilling mutant linjer av interesse17. Det er en stor offentlig ressurs i form av tilgjengelighet av ønskelige mutasjoner; i gen valideringsstudier bør imidlertid den ville-type-linjen ha kandidat genet av interesse. Beklageligvis, det er en fremdeles bekostning-uoverkommelige å orden exome av det hel TILLING befolkning for det omvendte genetikk-basert godkjenningen av et par kandidaten gener inne en annen miljøet. Amplicon sekvensering og cel-1-baserte analyser har vært brukt i å oppdage mutasjoner i målrettede populasjoner i hvete, og cel-1 analysene er enklere, krever ingen beregningsorientert kunnskap, og er spesielt egnet for validering av et lite antall gener med grunnleggende laboratorieutstyr6,18.
I denne artikkelen er beskrevet metoder for utvikling av en god TILLING befolkning, inkludert utarbeidelse av dosering kurve, mutagenese og vedlikehold av mutant befolkningen, og screening av mutant befolkningen ved hjelp av PCR-baserte cel-1 analysen . Denne protokollen har allerede blitt implementert med suksess i å utvikle og utnytte mutagenized bestander av Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, bygg, Aegilops tauchii7, og flere Andre. Inkludert er eksplisitte detaljer om disse metodene sammen med nyttige tips som vil hjelpe forskere utvikle TILLING populasjoner, ved hjelp av EMS som en arvestoffskadelig i noen små korn anlegg av valget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av dosering kurve for effektiv mutagenese
- Sug 100 frø med genotype av interesse i 6 250 mL glass flasker (100 i hver kolbe) som inneholder 50 mL destillert vann. Rist på 100 RPM for 8 timer ved romtemperatur (RT) for absorpsjon av frøene.
- I en avtrekks hette kan du forberede 50 mL på 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% og 1,2% (w/v) etanol methanesulfonate (EMS) løsning ved å oppløse 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 og 0,498 mL EMS i destillert vann, henholdsvis.
Merk: EMS er flytende ved RT med en tetthet på 1,206 g/mL.
FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE) under håndtering av EMS. - Dekanter vannet ut av fem flasker og tilsett 50 mL EMS-løsning i hver kolbe som inneholder imbibed frø, slik at det er seks forskjellige behandlinger med 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% og 1,2% EMS-løsning. Rist flasker i 16 timer ved 75 RPM og RT.
- Dekanter EMS-løsningen og samle de behandlede frøene separat for hver behandling ved hjelp av ost klut. Deaktiver den brukte EMS-løsningen ved å legge til ett volum av EMS-inaktivere løsning (0,1 M NaOH, 20% w/v na2S2O3) for 24 timer. Også behandle forurensede kanner og pipette tips med EMS-inaktivere løsning for 24 h.
- Vask EMS-behandlede frø under rennende vann fra springen i 2 t. Transplant hvert frø enkeltvis i root trenere som inneholder potting jord.
- Dyrke planter ved 20 – 25 ° c under en 16 h lysperiode.
- Registrere data på plante overlevelse etter 15 dager med transplantasjon. Bruk følgende ligning til å beregne overlevelsesraten for hver behandling:
Merk: Hvis spire rate er lavere enn 100% i kontroller, nøyaktig overlevelse i alle behandlingene skal beregnes etter trekke antall frø som ikke spire i kontrollene. En overlevelsesrate på 40% – 60% er ønskelig for effektiv mutagenese. Det kan være nødvendig å utføre en ny runde med dosering optimalisering med en modifisert konsentrasjon i henhold til overlevelse av de behandlede frøene til å oppnå den ønskelige dødelighet på 40%-60%.
2. mutagenese og vedlikehold av mutant befolkning
- Sug den siste batch av minst 3 000 frø dele likt (600 frø hver) i 5 1 000 mL flasker som inneholder 300 mL destillert vann. Rist for 8 timer ved 100 RPM under RT for absorpsjon.
Merk: den endelige størrelsen på den ønskelige befolkningen vil avhenge av mutasjon frekvens og ploidy nivå av genotype, men det er tilrådelig å bruke minst 3 000 frø for hexaploids, 4 000 frø for tetraploids, og mer enn 7 000 frø for diploids. - I en avtrekks hette, klargjør du 1 500 mL av den optimaliserte løsningen for EMS-konsentrasjon i destillert vann.
- Dekanter vannet ut av flaskene og tilsett 300 ml av den optimale konsentrasjonen av EMS-løsning i hver kolbe som inneholder 600 imbibed frø. Rist flaskene i 16 timer ved 75 RPM og RT.
- Dekanter EMS og samle de behandlede frøene i ost klut. Deaktiver EMS-løsningen og behandlings beholderne med EMS-inaktivere-løsning som utført i trinn 1,4.
- Vask EMS-behandlede frø under rennende vann fra springen i 2 t. Transplant hver EMS-behandlet M1 frø individuelt i root trenere.
- Grow M1 planter (avledet fra M0 frø) ved 20-25 ° c under en 16 h lysperiode.
Merk: det kan være nødvendig å vernalize frøplanter på to blad scenen i 6 uker ved 4 ° c, hvis genotype av interesse har en vinter-type vekst vane. - La M1 plantene til selv-pollinere, og høste m2 frø separat for hver fruktbar m1 plante.
Merk: for å unngå sjansene for potensielle utavl, dekke toppene av M1 planter med pollinering poser før anthesis. - Plant en enkelt M2 frø fra hver m1 Plant for å unngå genetisk redundans.
- Samle vev fra M2 planter på to-Leaf scenen i 1,1 ml av plaget 96 godt mikrorør. Samle rundt 80 mm blad vev fra hver plante og registrere ID av hver prøve i en vev samling plan.
- Frys-tørk bladet vev ved hjelp av en lyophilizer og lagre ved-80 ° c.
- Oppretthold M2 plantene ved 20 – 25 ° c under en 16 h lysperiode.
- Record data på mutant fenotyper av M2 planter med jevne mellomrom. Den forventede fenotyper er albino, chlorina, gress skyte, spraglete, delvis fruktbare, sterile, etc.
- La M2 planter til selv-gjødsle og modne. Separat høste og bevare det M3 frø av det M2 planter (skikkelsen 1).
Merk: M frø brukes for å validere fenotype i omvendt genetikk studier. Derfor bør M være nøye katalogisert og oppbevares under kjølige og tørre forhold. Alternativt, hvis frøet må økes i feltet, kan hodet rader plantes for hver M plante, og M frø fra hver rad kan høstes og lagres separat som TILLING befolkningen ressurs.
3. cel-1-analysen for genetisk karakterisering av mutanter
- Ekstrakt DNA fra bladet vev av M2 ved hjelp av en plante DNA Extraction Kit med en DNA rensing system (se tabell over materialer) etter produsentens anbefalinger.
- Kvantifisere DNA ved hjelp av en spektrofotometer og normalisere DNA-konsentrasjonen til 25 ng/μL med nuklease vann i 96 brønn blokker.
Merk: det er viktig å sjekke kvaliteten på DNA ved å kjøre den på en gel, som lav kvalitet DNA (smurt DNA) kan føre til falske negativer i sammenslåtte prøver. - Lag 4X DNA bassenger ved å kombinere DNA fra 4 96 brønn blokker i én plate, og samtidig opprettholde rad-og Kol onne identiteten til hver prøve. Tilsett 50 μL av DNA fra hver enkelt prøve i basseng platen, slik at hver basseng plate inneholder en total 200 μL av DNA fra fire forskjellige 96 brønn blokker.
- Katalog identiteten til gruppert DNA i formatet biljard plate-Row-kolonne (f. eks pool 1 a1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
- Design Genova-spesifikke primere [a1] for genet av interesse å bruke Genova spesifikke primere (GSP) side < https://probes.pw.usda.gov/GSP > med standardinnstillinger for polyploid arter. For diploids bruk primer 3 < http://primer3.ut.ee/> for å designe primere med standardinnstillinger. Design flere primere, om nødvendig, for å dekke hele kodingen regionen av genet av interesse.
Merk: den nyeste IWGSC forsamlingen kan brukes til å skaffe sekvenser for genet av interesse for hvete ved hjelp av URGI BLAST verktøyet < https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST >. Den optimale amplicon lengden er i størrelsesklasse 800 – 1500 BP. tabell 1 viser eksempler på primere for voksaktig gener i hexaploid hvete. - Kjør en PCR for gen-spesifikk grunning på gruppert DNA som følger:
- Tilsett 5 μL av PCR-buffer, 2 μL (hver) av 4 μM forover og bakover, 0,1 μL av DNA-polymerase (se tabell over materialer), 5 μL av gruppert DNA-mal, og Øk volumet til 25 μL ved hjelp av nuklease vann.
- Bruk en berørings profil for å kjøre PCR-reaksjonen på en termisk cycler som følger: 95 ° c i 1 min, sju sykluser på 95 ° c i 1 min, 67 ° c til 60 ° c i 1 min med Temperaturreduksjon på 1 ° c per syklus og 72 ° c i 2 min , etterfulgt av 30 sykluser med 95 ° c i 1 min, 60 ° c i 1 min, 72 ° c for 2 min, og endelig forlengelse ved 72 ° c i 7 min.
Merk: over PCR profilen fungerer på hvete DNA mal for de fleste av primere designet ved hjelp av primer 3 standardinnstillinger. I tilfelle av ikke-spesifikk forsterkning, bør PCR-profilen gjøres strenge før du går videre til neste trinn.
- Generer heteroduplexes mellom ikke-samsvarende DNA ved å incubating PCR-produkter i termiske cycler ved hjelp av profilen som følger: 95 ° c i 2 min, fem sykluser på 95 ° c for 1 s, 95 ° c til 85 ° c i 1 min med Temperaturreduksjon på 2 ° c per syklus, og 60 sykluser på 85 ° c til 25 ° c 1 ° c pr. syklus.
- Tilsett 2,5 μL av hjemmelagde cel-1-endonuclease til de heteroduplexed PCR-produktene og ruge for 45 min ved 45 ° c. Avslutt cel-1-reaksjonen ved å tilsette 2,5 μL av 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Merk: cel-1-endonuclease kan trekkes ut fra fersk selleri stilker ved hjelp av protokollen utført av till et al.19 det er svært viktig å teste aktiviteten og optimal mengde cel-1-endonuclease, som kan testes ved hjelp av tidligere karakterisert mutanter eller et kommersielt tilgjengelig mutasjon deteksjons sett. - Kjør cel-1-behandlede produkter på en 3,0% agarose gel på 100 V for 2,5 h. Brønnene som inneholder mindre og unike kløyvde band (s), i tillegg til full lengde uncleaved band, vil inneholde mutant DNA prøven.
- Denconvolute mutant bassenger.
- Følg trinn 3,6, 3,7, 3,8 og 3,9 for individuelle M2 DNA-prøver utgjør de muterte bassengene identifisert i trinn 3,9.
- For å bestemme zygosity av mutanter, kjøre to PCR (som beskrevet i trinn 3,6) for individuelle M2 DNA, der den første reaksjonen inneholder 2,5 μL av M2 DNA og 2,5 μL av Wild-type DNA og den andre reaksjonen inneholder bare 5 μL av m2 DNA. Hvis mutasjonen er heterozygot, vil et ekstra kløyvde band være til stede i begge reaksjonene. På den annen side, flere kløyvde band vil bli funnet bare i den første reaksjonen hvis mutant er homozygote.
- For å identifisere arten av mutasjonen, sekvens PCR produkter av bekreftet mutanter ved hjelp av en sanger sekvensering plattform etter produsentens instruksjoner.
4. beregning av mutasjon frekvens
Merk: mutasjon frekvensen av en TILLING befolkning refererer til gjennomsnittlig fysisk avstand der en mutasjon oppstår i individer av at befolkningen. For eksempel, en mutasjon frekvens på 1/35 KB i en TILLING befolkning betyr at en gjennomsnittlig person av at befolkningen besitter 1 mutasjon per hver 35 KB i Genova.
- For å bestemme mutasjon frekvensen av en TILLING befolkning, beregne det totale antall baser vist.
- For å beregne det totale antallet baser som er vist, multipliserer du PCR-produktets størrelse med det totale antallet personer som er vist.
- Dividere det totale antall baser vist av antall unike mutasjoner observert ved hjelp av følgende ligning, som vil gi den fysiske regionen besitter 1 mutasjon i den gitte TILLING befolkningen:
Merk: for å gjøre rede for begrensningen i oppløsning på 50 BP på begge ender basert på en agarose gel-basert plattform, subtrahere 100 BP fra produktet størrelse i beregningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser dosering kurve av hexaploid brød hvete sorten Jagger, diploid hvete Triticum monococcum6, og en Genova donor av hvete Aegilops tauschii7. EMS doser for ønsket 50% overlevelse var om 0,25%, 0,6% og 0,7% for T. monococcum, AE. Tauschii, og T. aestivum, henholdsvis. Det høyere EMS toleranse av hexaploid wheat er på grunn av dens Genova bufring behandlingskapasitet. Men til tross for både å være diploid, EMS toleranse for T. monococcum var nesten halvparten av AE. tauschii. Derfor understreker disse resultatene viktigheten av å bestemme den aktuelle EMS-dosen for individuelle genotyper av interesse.
Tilstedeværelsen av lett identifiserbare fenotyper i M2 befolkning bekrefter effektiviteten av mutagenese i små korn populasjoner. Den muterte fenotyper typisk inkluderer albino, chlorina, forkrøplet, gress skyte, spraglete, tidlig/sent blomstring, delvis fruktbar og steril. Figur 3 viser noen typiske mutant fenotyper innhentet i TILLING populasjoner.
Cel-1-analysen og agarose gel-basert tilnærming for mutant identifisering er praktisk, reproduserbar og mindre ressurs intensiv plattform. Figur 4 viser en mutert identifikasjon som bruker cel-1 på agarose gel-plattformer. Det bør bemerkes at muterte DNA-baner inneholder unike mønstre av kløyvde band. Den første runden med 4X Pool screening reduserer arbeids behov, ressurser og tidsforbruk. For eksempel, som vist i figur 4a, ble ett mutant basseng identifisert av 12 grupperte prøver som representerte 48 personer ved å utføre PCR-og cel-1-analysen. Deconvolution av mutant Pools bestemt zygosity av mutasjon og bidro til å spore mutasjonen ned til individuelle prøver (figur 4b,C). Figur 3b viser påvisning av heterozygot mutasjoner i A4-bassenget, som unike, kløyvde bånd er til stede i både boks 4-A4 og Box 4-a4 + Wild-type DNA-prøver. På den andre siden har H5-bassenget inneholdt homozygote mutasjoner, som unike, kløyvde bånd er bare til stede i Box 5-H5 + Wild-type DNA-prøven.
Figur 1: skjematisk å utvikle EMS-MUTAGENIZED TILLING populasjoner i små korn avlinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: EMS dosering kurve i tre forskjellige arter av hvete inkludert Triticum aestivum, T. monococcum, og Aegilops tauschii. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mutant fenotyper (gule piler) i ulike små korn M2 TILLING populasjoner. (A) en albino mutant i et bygg m2 befolkning, (B) chlorina mutant i en Bygg m2 befolkning, (C) spraglete mutant med rosa misfarging i en AE. tauschii m2 befolkning, og (D) lav busking mutant i en T. monococcum M2 befolkning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mutant identifikasjon i 4X bassenger følgende deconvolution ved hjelp av cel-1-analysen og agarose gel-basert tilnærming. Vist er (A) mutant Pool i Lane 7 med unike kløyvde band, (B) deconvolution av heterozygot mutant pool, oppdage mutasjon i A4 utvalg av DNA Box 4 med unike kløyvde band i boks 4-A4 og Box 4-a4 + Wild-type DNA prøver , og (C) deconvolution av homozygote mutant, oppdage mutasjonen i H5-PRØVEN i DNA Box 5 med unike kløyvde bånd bare i Box 5-H5 + vill-type DNA-prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Genet | Primer navn | Primer sekvens (5 '-3 ') | Produktets størrelse |
| Waxy | Wx_AF | TCGCTCTGCATATCAATTTTGC | 1022 for alle |
| Wx_AR | GGAACTGGCAAGAAGGACTG | ||
| Waxy | Wx_BF | GCGTCGTCTCCGAGGTACAC | 870 for alle |
| Wx_BR | GTCGAAGGACGACTTGAACC | ||
| Waxy | Wx_DF | CCATGGCCGTAAGCTAGAC | 1124 for alle |
| Wx_DR | GTCGAAGGACGACTTGAACC |
Tabell 1: grunning for å forsterke voksaktig gener i hexaploid hvete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING er et svært verdifullt omvendt genetikk verktøy for gen validering, spesielt for små korn der transformasjon-baserte tilnærminger har alvorlige flaskehalser11. Utvikling av en mutagenized befolkning med høy mutasjon frekvens er en av de kritiske skritt i å gjennomføre funksjonelle Genomics studier. Det viktigste steget i utviklingen av en robust TILLING befolkning er å bestemme den optimale konsentrasjonen av EMS. Den 40%-60% overlevelse i M1 er funnet å være en god indikator på effektiviteten av EMS mutagenese i hvete og bygg4,6,18. De overlevende plantene kan gi anstendig mutasjon frekvenser å bidra til å oppdage mutasjoner i noen genet av interesse. I ris, fruktbarhet av M1 anlegget er en annen avgjørende, i tillegg til overlevelse av m1 planter, og rapporteres å variere mellom ulike genotyper20.
Hexaploid brød hvete og tetraploid durum hvete, på grunn av deres polypoidy, har homoeoalleles i hver Genova for de fleste av genene, kompensere for tap-of-funksjon av viktige gener på grunn av mutasjoner. Dette er kjent som Genova bufring. Således, polyploids kanne tolerere høyere høyder av EMS doser sammenlignet med diploids på grunn av Genova bufring21,22. Det er imidlertid kjent at toleranse for ulike diploid arter å mutagener varierer og kan være regulert av mangfold i genetisk bakgrunn. For eksempel, AE. tauschii viste en 55% overlevelse på 0,6% EMS, mens T. monococcum viste en 51% rate med 0,24% EMS; Videre, eventuelle høyere konsentrasjon i sistnevnte arter førte til overdreven plante død6,7. Vi har tidligere opplevd at selv i hexaploids, forskjellige kultivarer tolerere ulike arvestoffskadelig konsentrasjoner (data ikke vist). Videre, EMS toleranse varierer betydelig blant ulike ris genotyper20. Derfor er det sterkt anbefalt å få dosering kurver for individuelle genotype av interesse.
For å analysere effekten av mutagenese, flere typer fenotypiske mutanter bør være synlig fra frøplante scenen til modenhet av en TILLING befolkning7,23,24. Den fenotypiske mutanter til notatet inkluderer chlorina, albinos, spraglete blader, forkrøplet, bred/smale blader, lav/høy busking, tidlig/sent blomstring, delvis fruktbar og steril. Eventuelle avvik fra Wild type fenotype representerer en potensiell fenotypiske mutant.
Siden G og C er de primære mål rester av EMS-mutagenese, vil det være skjevhet i mutasjonen frekvensene av gener avhengig av GC-innholdet. En region med høyere GC-innhold vil gi en høy mutasjon-frekvens, mens en region med lavt GC-innhold vil gi lav mutasjon-frekvens. For å beregne riktig mutasjon-frekvens for en TILLING-populasjon, foreslås det derfor å oppnå et gjennomsnitt på to til tre gener med varierende GC-innhold eller normalisere graden av mutasjon til en 50% GC-innhold13.
Den cel-1-analysen og agarose gel-basert protokoll som er beskrevet her er enkle metoder som ikke krever dyre instrumentering eller kompleks analyse. Imidlertid bør det bemerkes at denne metoden er bare egnet og effektiv for mutasjon deteksjon i noen gener. For screening mutasjoner i et større sett av gener, multiplex amplicon sekvensering metoden anbefales3,24. For en detaljert protokoll på flere amplicon sekvensering metoden, kan leserne referere til Tsai et al.25 med fremskritt i sekvensering teknologi og reduserte kostnader for sekvensering, plattformer som exome fangst har vært brukt i karakteriserer mutasjoner over en hele Genova i hele hvete TILLING befolkning17. For planter med små genomer kan selv hele genomer av alle individer i den TILLING befolkning være sekvensielt15,16. Men kostnaden for screening alle mutasjoner i individer av en gitt TILLING befolkning gjør det dyrt utføre hele Genova sekvensering for en befolkning utviklet for bestemte formål. Derfor, for å utføre omvendt genetikk-basert validering for et begrenset antall kandidat gener i ethvert laboratorium med vanlig molekylærbiologi instrumentering, cel-1 baserte analyser er en anstendig metode for valg. Likevel er valg av plattform for påvisning av mutasjoner sekundært til å utvikle en TILLING befolkning harboring flere mutasjoner i hele Genova. Derfor er det mest kritiske trinnet i protokollen utvikling av en robust TILLING befolkning med en høy mutasjon frekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjekt 1016879 og Maryland Agricultural Experiment Station via MAES Grant no. 2956952.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R.
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L.
