Summary
وصف الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) هو موضوع شائع في البحوث المترجمة. يصف هذا البروتوكول فحصًا شبه تلقائي للفلورة المناعية (IF) لتوصيف PD-L1 وتعداد CTCs في عينات المرضى من سرطان الرئة غير الصغيرة (NSCLC).
Abstract
يتم إلقاء الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) المستمدة من الورم الأساسي في مجرى الدم أو الجهاز اللمفاوي. هذه الخلايا النادرة (1-10 خلايا لكل مل من الدم) تبرر سوء التكهن وترتبط بالبقاء على قيد الحياة بشكل عام أقصر في العديد من السرطانات (مثل الثدي والبروستاتا والقولون والمستقيم). حاليا، ومكافحة EpCAM المغلفة المغناطيسي حبة القائم على نظام التقاط CTC هو اختبار معيار الذهب المعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لتعداد CTCs في مجرى الدم. ويستند هذا الاختبار على استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة مع علامات المضادة للEpCAM، والتي تستهدف على وجه التحديد الخلايا السرطانية الظهارية. وقد أوضحت العديد من الدراسات أن EpCAM ليست العلامة المثلى للكشف عن رابع كلوريد الكربون. في الواقع، CTCs هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا السرطانية وقادرة على الخضوع لانتقال الظهارية إلى mesenchymal (EMT) المرتبطة الانتشار النقيلي والغزو. هذه CTCs قادرة على الحد من التعبير عن سطح الخلية علامة الظهارية EpCAM، في حين زيادة علامات mesenchymal مثل vimentin. ولمعالجة هذه العقبة التقنية، تم تطوير أساليب عزل أخرى تستند إلى الخصائص الفيزيائية للمراكز. تتيح التقنيات الميكروفلويدية اتباع نهج خالٍ من الملصقات لإثراء رابع كلوريد الكربون من عينات الدم الكاملة. تستخدم التكنولوجيا المرنة الحلزونية قوى السحب بالقصور الذاتي ودين مع التدفق المستمر في القنوات المنحنية التي يتم إنشاؤها داخل رقاقة microfluidic حلزونية. يتم فصل الخلايا على أساس الاختلافات في الحجم واللدونة بين خلايا الدم الطبيعية والخلايا السرطانية. يفصّل هذا البروتوكول الخطوات المختلفة لتوصيف التعبير المبرمج لـ ctcs عن الـ CTCs، الذي يجمع بين جهاز سائل صغير حلزوني مع مجموعة علامات الفلورة المناعية القابلة للتخصيص (IF).
Introduction
تلعب الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) دورًا حاسمًا في الاستجابة للسرطانات من خلال عملية تعرف باسم "المراقبة المناعية" للسرطان. يتم تعزيز وظائفها المضادة للورم من قبل الأجسام المضادة حاجز نقطة التفتيش المناعية مثل مثبطات CTLA-4 ومثبطات PD-1/PD-L1. في سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، العلاجات المضادة للPD-1/PD-L1 تؤدي إلى معدلات استجابة تتراوح بين 0٪ -17٪ في المرضى الذين يعانون من الأورام السلبية PD-L1 و 36٪ -100٪ في تلك التي تعبر PD-L1. تظهر الاستجابات القوية لحصار PD-1/PD-L1 الذي لوحظ في الورم الميلانيني وNSCLC من خلال الأدلة على تحسن معدل الاستجابة الإجمالي (RR)، والفوائد السريرية الدائمة، والبقاء على قيد الحياة الخالي من التقدم (PFS). حاليا، العلاجات المضادة للPD1 هي معيار الرعاية في الخط الثاني NSCLC العلاج مع nivolumab بغض النظر عن التعبير PD-L1 ومع pembrolizumab في المرضى الذين يعبرون PD-L1 ≥ 1٪. في علاج الخط الأول، ومعيار الرعاية هو pembrolizumab وحدها في المرضى الذين يعانون من NSCLC التعبير PD-L1 ≥ 50٪ ويمكن تعزيزها يحتمل أن تكون مع العلاج الكيميائي (platin ودواء دوبلت اعتمادا على النوع الفرعي الأنسجة)1،2.
ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج لإدارة المريض قابل للنقاش3، حيث أن تعبير PD-L1 في الخلايا السرطانية عن طريق الكيمياء المناعية (IHC) ربما ليس العلامة الحيوية المصاحبة الأكثر مثالية. أخرى مثل عبء طفرة الورم4 (TMB)، عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة (MSI)، و / أو ميكروبيوتا ربما تكون مثيرة للاهتمام في هذا الإعداد إما وحدها أو في تركيبة. ومن المعروف NSCLC أن تكون الأورام غير متجانسة، إما مكانيا (من موقع الورم إلى آخر واحد) أو زمنيا (من التشخيص إلى التكرار). المرضى الذين يعانون من NSCLC عادة ما تكون هشة، والخزعات الأنسجة الغازية المتكررة قد تكون مشكلة. في الواقع، يتراوح معدل إعادة خزعة في التقدم الأول من 46٪ -84٪ اعتمادا على سلسلة، وإعادة خزعة ناجحة (وهذا يعني مع التحليل النسيجي والجزيئي الكامل) يتراوح بين 33٪-75٪. وهذا يعني أن 25٪ -67٪ من المرضى لا يمكن الحصول على تحليل شامل لإعادة خزعة خلال التقدم الأول5،6،7،8.
وبالتالي فإن ظهور "الخزعات السائلة" قد ولّد حماساً كبيراً في هذا السياق الخاص، حيث أنه يمكّن من إعادة تقييم حاسمة للتغيرات الجزيئية أثناء تطور المرض من خلال فحص تعميم الحمض النووي الحر (cfDNA) المستمد من تعميم الخلايا السرطانية (CTCs). يتم تحرير هذه الخلايا الحية من الورم في مجرى الدم، حيث أنها تدور بحرية. على الرغم من عدم استخدامها بشكل روتيني، يبدو أن تحليل CTCs واعد للغاية في حالة التوصيف الجزيئي والفينوتي، والتكهن، والأهمية التنبؤية في سرطان الرئة (عنطريق DNAseq، RNAseq، ميرنا وتحليل البروتين). في الواقع، من المرجح أن تحتوي الـ CTCs على خصائص فينوتيبيك للمرض النشط بدلاً من العلامات الأولية (التي تم اكتشافها عند التشخيص). وعلاوة على ذلك، تتجاوز CTCs مشكلة عدم التجانس المكاني للأنسجة السرطانية، والتي قد تكون مشكلة حاسمة في الخزعات الصغيرة. وبالتالي، فإن تعبير PD-L1 على CTCs قد يلقي الضوء على الاختلافات المستمدة من استخدامه كعلامة بيولوجية تنبؤية باستخدام أنسجة الورم.
في الآونة الأخيرة، تم اختبار تعبير PD-L1 في CTCs من NSCLC. تقريبا جميع المرضى اختبار9 كانت PD-L1 إيجابية، مما يعقد تفسير النتيجة واستخدامها السريري. وبشكل عام، تم الكشف عن CTCs إيجابية PD-L1 في 69.4٪ من العينات من متوسط 4.5 خلايا / مل10. بعد بدء العلاج الإشعاعي، زادت نسبة CTCs إيجابية PD-L1 بشكل كبير، مما يشير إلى رفع تنظيم التعبير PD-L1 استجابة للإشعاع11. وبالتالي، يمكن استخدام تحليل CTCs PD-L1 لرصد التغيرات الديناميكية للورم والاستجابة المناعية، والتي قد تعكس الاستجابة للعلاج الكيميائي، والإشعاع، والعلاج المناعي المحتمل (IT).
وحتى الآن، تعتمد عزلة CTCs وتوصيف PD-L1 على أساليب مختلفة مثل التقاط أجهزة مكافحة الحصى المغناطيسية المغلفة بالخرز، والاختبار القائم على التخصيب، والاختبار القائم على الحجم12و13 من مركبات مكافحة الإرهاب. ومع ذلك، تم الكشف عن CTCs فقط في 45٪ -65٪ من المرضى الذين يعانون من NSCLC النقيلي، مما يحد من قدرتهم على توفير أي معلومات لأكثر من نصف المرضى NSCLC النقيلي. وبالإضافة إلى ذلك، كان عدد الـ CTC منخفضاً في معظم هذه الدراسات باستخدام النهج القائم على الحجم10. وعلاوة على ذلك، أدت هذه الطريقة إلى اختلافات مثل الكشف عن خلايا CD45 (-)/DAPI(+) مع "أنماط الأورام الخبيثة" في مجرى الدم من المتبرعين الأصحاء. وتبرز هذه الشواغل الحاجة إلى طريقة حساسة للغاية لجمع رابع كلوريد الكربون المرتبطة بالنمط الظاهري المناعي لخلايا CD45 (-) غير النمطية من الدم الكامل السليم باستخدام علامات حيوية إضافية للسرطان (أي TTF1، فيمنتين، EpCAM، وCD44) في NSCLC.
وبالتالي، قمنا بتقييم جهاز microfluidic دوامة يستخدم القصور الذاتي ودين سحب القوات لفصل الخلايا على أساس الحجم واللدونة من خلال رقاقة microfluidic. تشكيل تدفقات دوامة عميد موجودة في رقاقة microfluidic النتائج في CTCs أكبر تقع على طول الجدار الداخلي والخلايا المناعية أصغر على طول الجدار الخارجي للرقاقة. وتكتمل عملية التخصيب عن طريق سرقة الخلايا الأكبر حجما ً إلى منفذ التجميع كجزء من رابع كلوريد الكربون المخصب. هذه الطريقة حساسة ومحددة بشكل خاص (الكشف عن حوالي 1 CTC/مل من الدم كله)14 ويمكن أن تكون مرتبطة مع تحليلات الفلورة المناعية المخصصة (IF). وستمكن هذه الأدوات من وضع عتبة إيجابية للتفسير السريري. وهكذا يتم وصف سير العمل الذي يمكّن علماء الأحياء من عزل وخصائص CTCs ذات النمط المناعي المناعي بمعدل عال من الانتعاش والخصوصية. يصف البروتوكول الاستخدام الأمثل للجهاز الميكروفلويديك اللولبي لجمع CTCs، والاختبارات IF الأمثل التي يمكن تخصيصها وفقا لنوع السرطان، واستخدام البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر لقياس وتحليل صور الخلايا لأداء شبه تلقائي حساب الخلايا وفقا لتلطيخ الفلورسنت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ تعدد الإرسال المجهر اعتمادا على عدد من مرشحات الفلورسنت / علامات المتاحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد جُمعت العينات في المستقبل في إطار مجموعة "سيركان" (CIRCAN'CIRculating CANcer) المتمركزة في مستشفى جامعة ليون بعد موافقة خطية من المريض. تم دمج هذه الدراسة في مجموعة CIRCAN_ALL. تم الاعتراف بالدراسة CIRCAN_ALL على أنها غير تدخلية من قبل حزب الشعب الكمبودي جنوب شرق الرابع بتاريخ 04/11/2015 تحت المرجع L15-188. تم الاعتراف بنسخة معدلة على أنها غير تدخلية في 20/09/2016 تحت المرجع L16-160. تم الإعلان عن دراسة CIRCAN_ALL لمراسل تكنولوجيا المعلومات والحرية في دار الضيافة المدنية في ليون في 01/12/2015، تحت المرجع 15-131. تم جمع الدم عندما لاحظ الأطباء أقرب مؤشر على تطور الورم.
ملاحظة: استخدم جميع الكواشف والمواد الموضحة في جدول المواد مع شروط التخزين الخاصة بإعداد العينات قبل التحليلية واختبار الفلورة المناعية. استبدال الكواشف و /أو تعديل شروط التخزين يمكن أن يؤدي إلى أداء اختبار دون المستوى الأمثل.
1. إزالة التلوث من دوامة الجهاز microfluidic
ملاحظة: إزالة التلوث من الجهاز السوائل الدقيقة دوامة هو شرط لإزالة جميع الخلفية المناعية المتولدة من تلوث البكتيريا، واستكشاف النُشُم السَّمَّم ة الكتك، وتكون قادرة على تمييزها عن الخلايا المناعية الطبيعية. تم تحسين البروتوكول لعينات الدم التي تم جمعها في K2أنابيب EDTA في غضون 6 ساعة بعد أخذ عينات الدم وإثراء باستخدام الجهاز الميكروفلويديك دوامة في ظروف نظيفة. استخدام هذا الفحص لأنواع أخرى من العينات (السوائل البيولوجية الأخرى) قد تتطلب تحسين إضافية. وينبغي أن يتم هذا البروتوكول لإزالة التلوث مرة واحدة في الأسبوع.
- إعداد الكواشف
- إعداد المخزن المؤقت للتخفيف
- تعقيم 20 مل من الكاشف المضافة مخفف باستخدام فلتر حقنة 0.22 م وإضافة مباشرة إلى 1 لتر من 1Xالفوسفات العازلة المالحة (PBS) درجة فائقة نقية (جدول المواد).
- تعقيم الكواشف والقش المدخلات
- تعقيم المخزن المؤقت لـ RBC lysis والمخزن المؤقت لإعادة التعليق (RSB; جدول المواد) باستخدام فلتر حقنة 0.22 م ومخزون في أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 مل جديد لكل حل.
- تعقيم القش المدخلات عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة1 ساعة في كاشف التنظيف لجميع الأغراض (جدول المواد). نقل القش إلى عامل التنظيفالقائم على التبييض (جدول المواد) وحضانة في RT لمدة 1 ساعة.
- شطف القش المدخلات مرتين مع PBS معقمة لمدة ساعة واحدة لكل وتخزينالقش المدخلات معقمة في كيس معقمة جراحيا (جدول المواد).
- إعداد المخزن المؤقت للتخفيف
- تطهير الجهاز الميكروفلويدسي اللولبي
- التطهير باستخدام كاشف التنظيف لجميع الأغراض
- افصل غطاء الزجاجة المخفف عن منفذ مخفف الجهاز اللولبي microfluidic عن طريق فك المسمار البني. تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية، نقل ما يصل إلى 250مل من الكاشف التنظيف لجميع الأغراض (جدول المواد) في زجاجة فارغة جديدة.
- المسمار غطاء زجاجة مخفف والقش إلى زجاجة من 250 مل تنظيف الكاشف لجميع الأغراض تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية. إرفاق هذه الزجاجة إلى ميناء مخفف من الجهاز microfluidic دوامة عن طريق الشد مرة أخرى المسمار البني.
- نقل ما يصل إلى 100 مل من التبييض (1٪ التركيز النهائي؛ جدول المواد) إلى حاوية النفايات الموردة في مجموعة تشغيل (الشكل1A).
- تحميل القش إدخال معقمة جديدة على الجهازmicrofluidic دوامة (جدول المواد) في منفذ الإدخال. قم بتحميل أنبوب طرد مركزي جديد بـ 50 مل في منفذ الإدخال. تحميل أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة في منفذ الإخراج.
- المضي قدما في رئيس الجهاز microfluidic دوامة عن طريق النقر على رئيس الوزراء على الجهاز microfluidic دوامة (3 دقائق). قم بإزالة أنبوب الإدخال بعد اكتمال القسط الرئيسي.
- نقل ما يصل إلى 15 مل من كاشف التنظيف لجميع الأغراض إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة مع ماصة المصلية تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية وإرفاق الأنبوب إلى منفذ الإدخال من الجهاز microfluidic دوامة.
- قبل بدء التشغيل، تحقق من أن الحل خال من الفقاعات المفرطة. إذا كانت الفقاعات موجودة، إزالتها عن طريق الطموح البطيء مع ماصة.
- تحميل رقاقة microfluidic إزالة التلوث في الجهاز microfluidic دوامة. تشغيل برنامج 3 على الجهاز الميكروفلويديك دوامة عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة).
ملاحظة: البرنامج 3 من الجهاز الميكروفلويديك دوامة تمكن من الإثراء السريع للناقلات المقطعية في 31 دقيقة. - استمر في خطوة تنظيف الجهاز الميكروفلويديك اللولبي باستخدام الحجم المتبقي من كاشف التنظيف لجميع الأغراض في أنبوب الإدخال.
- تجاهل أنبوب الإدخال بعد الانتهاء من خطوة التنظيف، تاركاً وراءه قش الإدخال.
- إزالة التلوث باستخدام عامل التنظيف القائم على التبييض
- افصل غطاء زجاجة الكاشف للتنظيف لجميع الأغراض عن منفذ مخفف الجهاز اللولبي microfluidic عن طريق فك المسمار البني. تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية، نقل ما يصل إلى 250 مل من عامل التنظيف القائم على التبييض (جدولالمواد)في زجاجة فارغة جديدة (الشكل1A).
- المسمار غطاء زجاجة الكاشف التنظيف لجميع الأغراض والقش إلى زجاجة تحتوي على عامل التنظيف القائم على التبييض تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية. إرفاق هذه الزجاجة إلى ميناء مخفف من الجهاز microfluidic دوامة عن طريق الشد مرة أخرى المسمار البني.
- نقل ما يصل إلى 15 مل من عامل التنظيف القائم على التبييض إلى أنبوب إدخال أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة باستخدام ماصة المصلية تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية. تحميل 50 مل موقف إدخال أنبوب الطرد المركزي. قم بتحميل أنبوب فارغ في موضع الإخراج.
- قبل معالجة تشغيل، تحقق من أن العينة خالية من فقاعات المفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات عن طريق aspirating لهم ببطء مع ماصة.
- تشغيل البرنامج 3 عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة). بعد التشغيل، انتقل مباشرة إلى خطوة التنظيف باستخدام الحجم المتبقي من عامل التنظيف القائم على التبييض في أنبوب الإدخال.
- تجاهل أنابيب الإدخال والإخراج.
- شطف الجهاز الميكروفلويديك دوامة.
- افصل غطاء زجاجة عامل التنظيف القائم على التبييض عن منفذ مخفف الجهاز اللولبي microfluidic عن طريق فك المسمار البني. تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية، نقل القش من زجاجة تحتوي على عامل التنظيف القائم على التبييض إلى زجاجة جديدة تحتوي على العازلة مخفف. المسمار زجاجة إلى الجهاز microfluidic دوامة.
- نقل ما يصل إلى 15 ملمن المياه المعقمة (جدول المواد) إلى أنبوب جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي أنبوب الإدخال باستخدام ماصة المصلية تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية. تحميل 50 مل موقف إدخال أنبوب الطرد المركزي. قم بتحميل أنبوب فارغ في موضع الإخراج.
- قبل معالجة تشغيل، تحقق من أن العينة خالية من فقاعات المفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات عن طريق aspirating لهم ببطء مع ماصة.
- تشغيل البرنامج 3 عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة). بعد تشغيل، انتقل مباشرة إلى خطوة التنظيف باستخدام الحجم المتبقي من المياه المعقمة في أنبوب الإدخال.
- تجاهل أنابيب الإدخال والإخراج.
- التطهير باستخدام كاشف التنظيف لجميع الأغراض
2. صيانة للحفاظ على دوامة Microfluidic جهاز خالية من البكتيريا
ملاحظة: يجب أن تتم الصيانة الروتينية في نهاية اليوم خلال خطوة التنظيف الأخيرة.
- نقل ما يصل إلى 7 مل من عامل التنظيف القائم على التبييض في أنبوب الطرد المركزي الجديد 50 مل باستخدام ماصة المصلية تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية. المسمار أنبوب التنظيف القائم على التبييض في ميناء الإدخال من الجهاز microfluidic دوامة.
- قبل معالجة تشغيل نظيفة، تحقق من أن عينة الإدخال خالية من فقاعات المفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات عن طريق aspirating لهم ببطء مع ماصة.
- تشغيل نظيفة على الجهاز microfluidic دوامة.
3. الإثراء قبل التحليلية من CTC من عينات دم المريض
- جمع 7.5 مل من الدم في أنبوب K2EDTA والحفاظ على تحت التحريض لطيف لتجنب ترسيب الخلايا وتخثر. عملية في غضون 6 ساعة.
ملاحظة: إذا تم جمع الدم في أنبوب جمع الدم الحمض النووي خالية من الخلايا التي تحتوي على المواد الحافظة، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى المعالجة. تأكد من أن عينة الدم المخزن المؤقت للتحليل RBC و المخزن المؤقت RBS في RT قبل المتابعة مع خطوة التخصيب. - نقل ما يصل إلى 7.5 مل من الدم كله إلى أنبوب جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي أنبوب الإدخال باستخدام ماصة المصلية تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية.
- الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 10 دقائق في RT. جمع جزء البلازما مع ماصة دون إزعاج معطف برتقالي. استبدال كسر البلازما عن طريق إضافة حجم مكافئ مباشرة من PBS تصل إلى 7.5 مل.
- إضافة بلطف RBC lysisالعازلة (جدول المواد) إلى عينة الدم إلى حجم نهائي من 30 مل (لأنبوب K2EDTA) أو 37.5 مل (لأنبوب جمع الدم الحمض النووي خالية من الخلايا). يعكس بلطف أنبوب جمع الدم 10x وحضانة لمدة 10 دقائق في RT.
ملاحظة: عينة الدم يتحول أحمر أغمق أثناء تحليل RBC. إذا لم يتم ملاحظة أي تغيير (من الأحمر الداكن وغير شفاف) بعد 10 دقائق، عكس بلطف أنبوب 3X وترك للوقوف لمدة 5 دقائق أخرى كحد أقصى. لا تترك العينة في المخزن المؤقت تحليل RBC لأكثر من 15 دقيقة لأنه يمكن أن يعرض للخطر جودة العينة وأداء الفحص. - طرد مركزي عينة الدم lysed في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في RT، مع الفرامل الطرد المركزي على (أو أعلى سرعة التباطؤ). استخدم ماصة باستور أو ماصة مصلية لإزالة الـ supernatant برفق حتى يصل الحجم إلى علامة 4-5 مل. ثم، استخدم نصائح micropipette المصفاة لإزالة supernatant المتبقية.
- باستخدام P1000 micropipette مع طرف تصفيتها، إضافة 1.0 مل من RSB إلى جدار أنبوب إدخال أنبوب الطرد المركزي 50 مل. لتجنب إدخال فقاعات في المزيج، إعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا حتى عينة متجانسة.
- إضافة إضافية 3 مل من RSB إلى جدار أنبوب إدخال أنبوب الطرد المركزي 50 مل (إجمالي حجم 4 مل). تجنب إدخال فقاعات في المزيج. امزج تعليق الخلية برفق عن طريق الأنابيب برفق صعودا وهبوطا.
ملاحظة: في حالة عدم القدرة على قطع كتل الخلايا (التي يتم تعريفها بكونها مرئية أو حجب طرف الماصة)، قم بتصفية العينة من خلال مصفاة خلية بمقدار 40 ميكرومتر لإزالة أي كتل. إضافة 150 درجة مئوية من RSB إلى العينة للتعويض عن فقدان مستوى الصوت من التصفية. لاحظ أن هذا الأسلوب هو أن تستخدم لماما وفقط عند ملاحظة كتل كبيرة. - قبل الشروع في خطوة الإثراء، تحقق من أن العينة خالية من فقاعات مفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات والحرص على عدم تجاهل أي عينة. إذا كانت فقاعات صغيرة موجودة، لا يلزم إزالتها.
- معالجة العينة على الجهاز الميكروفلويديك دوامة.
4. إثراء CTCs من الدم المريض كله مع الجهاز الميكروفلويديك دوامة
- تحميل رقاقة microfluidic دوامة جديدة. قم بتحميل أنبوبي طرد مركزي فارغين بمساحة 50 مل في منافذ الإدخال والإخراج.
- تشغيل رئيس الوزراء عن طريق النقر على رئيس على الجهاز microfluidic دوامة (3 دقيقة). قم بإزالة أنابيب الإدخال والإخراج واحمّل العينة التي سيتم معالجتها في منفذ الإدخال.
- تحميل أنبوب مخروطي واضح 15 مل في منفذ الإخراج لجمع CTCs المخصب. تشغيل البرنامج 3 عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة).
- تفريغ أنبوب الإخراج والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة (التسارع: 9؛ التباطؤ: 5). مع ماصة المصلية 5 مل، وإزالة توقف supernatant عند علامة 2 مل على أنبوب مخروطي 15 مل. مع micropipette، إزالة supernatant وقف في 100 علامة ميكرول على أنبوب مخروطي 15 مل. معالجة العينة المخصب مباشرة لتلطيخ الفلورة المناعية.
5. تلطيخ الفلورة المناعية
- تعداد على شريحة غرفة مع شبكة من نوع مقياس الهيموكيمتر عدد الخلايا لكل مل. تخفيف العينة المخصب مع 0.2٪ المضادةللربط الحل (جدول المواد) إلى تركيز يصل إلى 100،000 خلية / 100 درجة مئوية لكل سيتوسبين.
- ترطيب محيط غرفة العينة باستخدامالقطن (جدول المواد) مع 50 درجة مئوية من 0.2٪ الحل المضادة للربط. وضع بوليزين الزجاج الشريحة في غرفة عينة وإغلاق.
- معطف طرف مع 0.2٪ المضادة للربط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 3X. إعادة تعليق العينة المخصب ونقل حل الخلية في غرفة العينة. الطرد المركزي معجهاز طرد مركزي مخصص (جدول المواد) في 400 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق (تسارع منخفضة).
- وضع عازل السيليكون حول منطقة الترسيب. اسمحوا الجافة الزجاج الشريحة تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية لمدة 2 دقيقة.
- إعداد حل التثبيت عن طريق تخفيف 1 مل من 16٪ بارافورماليدهايد (PFA) مع 3 مل من PBS المعقمة. إضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت (4٪ PFA) لكل عينة وحضانة في RT لمدة 10 دقيقة.
تحذير: استخدام PFA تحت مجلس الوزراء السلامة الكيميائية لمنع الاستنشاق. - إعداد محلول التشبع عن طريق تخفيف المصل البقري الجنيني (FBS) في 5٪، مستقبلات Fc (FcR) حجب الكاشف في 5٪،وألبومالمصل البقري (BSA) في 1٪ في PBS معقمة (جدول المواد). إضافة 100 درجة مئوية من محلول التشبع لكل عينة وحضانة لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة محلول التشبع.
- إضافة 100 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة لكل عينة (CD45 الأجسام المضادة 1/20; بانكالأجسام المضادة 1/500؛ PD-L1 الأجسام المضادة 1/200؛ Qsp التشبع الحل 100درجة مئوية) (جدول المواد). ضع شريحة بوليسين الزجاجية في طبق بيتري مقاس 100 مم × 15 مم. ترطيب ورقة ماصة مع 2 مل من الماء المعقم وإغلاق طبق بيتري مع الغطاء. ضعها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها وحمّلها من الضوء.
- إزالة مزيج الأجسام المضادة وتنفيذ 3 يغسل مع 200 درجة مئوية من PBS احتضان كل غسل لمدة 2 دقيقة. دع العينة تجف لمدة 5 دقائق ونحميها من الضوء. وضع 10 درجة مئويةمن حل تصاعد (جدول المواد) في مجال الترسيب وغطاء مع غطاء المجهر دون جعل فقاعة. ختم غطاء مع طلاء الأظافر.
6. الحصول على الصور المناعية مع المجهر الفلورسنت على التوالي والبرمجيات المرتبطة بها
- استخدام المجهر الفلورسنت على التوالي مع منصة X / Y الآلية. استخدم هدفًا 20 x لالتقاط صور TIFF RGB 8 بت في أربع قنوات تتوافق مع صبغ الحمض النووي (4'، 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI])، صبغ PanCK (الفلورسين إيزوثيوسيانات [FITC)،PD-L1 dye (CY3)، وصبغ CD45 (CY5). قم بتشغيل مصباح الزئبق قبل 15 دقيقة من الاستخدام، وتكيف المجهر والبرامج المرتبطة به مع التصوير شبه الآلي.
- ضع الشريحة الزجاجية على المنصة.
- في قائمة الاكتساب، حدد القنوات الأربع وحمّل وقت التعرض (DAPI: 15 مللي ثانية، FITC [PanCK]: 500 مللي ثانية؛ CY3 [PD-L1]: 800 مللي ثانية; CY5 [CD45]: 1,000 مللي ثانية). قم بتعريف التجانبات للمسح الضوئي. انقر فوق التجانبات. في التجربة المتقدمة، حدد المنطقة للمسح الضوئي.
- ضبط التركيز على الشاشة. انقر فوق بدء التجربة.
- تصدير ملفات TIF من كل قناة وتسمية ملف الصورة مع هذه المعلومات على وجه التحديد: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (على سبيل المثال، Sample1_TR1_c1m01). صبغ الاسم على النحو التالي: قناة DAPI هو c1، قناة FITC هو c2، قناة CY3 هو c3، وقناة CY5 هو c4.
7. تحليل الصور المناعية مع برنامج تحليل الصور
- تحميل وتثبيت برنامج تحليل الصور مجانا من موقع معهد واسع. قبول كافة الافتراضية أثناء التثبيت. افتح برنامج تحليل الصور وانقر فوق ملف | خط أنابيب من الملف | تحليل_4channels_CTC.cppipe.
ملاحظة: يقوم خط الأنابيب بتحويل صور ألوان RGB إلى تدرج رمادي، ويزيل القطع الأثرية عن طريق تنعيم الصور باستخدام عامل تصفية متوسط، ويحدد النوى والسيتوبلازم، ويحدد كثافة الفلورة لكل قناة، ويصدرها إلى ملف excel. - إفلات الملفات في قائمة الملفات. تحديث بيانات التعريف لتجميع الملفات حسب التجانبات.
ملاحظة: يتم تحديد كافة الإرشادات لتجميع الصور في البرنامج. ظهرت ملفات الاسم في الوحدة النمطية NamesAndTypes ويتم تجميع الملفات وفقا لعدد البلاط والقناة لكل عينات. - انقر فوق عرض إعدادات الإخراج وتحديد إخراج افتراضي صحيح. انقر فوق تحليل الصور. افتح ملف جدول البيانات المطابق لمعلمات measure_intensity.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الشرط المسبق الأول هو الحصول على مجموعات غير ملوثة (خالية من العوامل المعدية) من مركبات الكربون الكلورية فلورية لزراعة الأنسجة وتجنب الخلفية IF ولدت. ومكّن بروتوكول إزالة التلوث من تنظيف جميع الأنابيب والمضخات، وأدى إلى جمع ناقلات الأمراض الكهربائية والكهربائية بمعدل استرداد جيد دون تلوث بكتيري. تمت مقارنة العينات المخصب دون ومع سير العمل بروتوكول إزالة التلوث من الجهاز microfluidic دوامة. للتحقق من صحة بروتوكول إزالة التلوث، تم استخدام خط الخلية A549 في غياب الدم كله وإثرى مباشرة باستخدام الجهاز الميكروفلويديك دوامة. دون بروتوكول إزالة التلوث الأمثل، لوحظ تلوث بكتيري مرتفع في زراعة الأنسجة من خط الخلايا A549 المخصب بعد 24 ساعة فقط، مما تسبب في الوفاة والتغيرات السيتومورفولوجية في الخلايا الأوكارية (الشكل1ب).
وعلى النقيض من ذلك، بعد بروتوكول التنظيف، تم الحصول على خلايا A549 الحية من خلال النمو في ثقافة 2D بعد 10 ساعة من زراعة الأنسجة وإزالة وسائل الإعلام وفي ظروف 3D (الشكل1B)، وكذلك عينات المريض (الشكل1C). يتم تحديد لجنة مكافحة الإرهاب المحتملة مع الصليب الأحمر (الشكل1ج).
يلخص الشكل 2 سير العمل الكامل للنماذج الظاهرية المناعية للمركبات المقطعية المخصبة من الدم كله. وهو يتألف من أربع خطوات رئيسية: أخذ عينات الدم بالكامل، وإثراء رابع كلوريد الكربون، والفحص المناعي (IF)، وتحليل الصور باستخدام البرمجيات. في السابق، تم معالجة معدل الانتعاش من الجهاز microfluidic دوامة14. باستخدام الفلورسنت تقليد CTCs (mCTC)، تم تحديد معدل الانتعاش هذا في 1.3 CTCs/mL الدم كله14.
وركز العمل الحالي على تهيئة الظروف المثلى لتحليل IFللمركبات الكربونية المركزة المثراة والتصور في المراحل النهائية (الشكل 2). أولا، لاختبار خصوصية الأجسام المضادة PD-L1، تم استخدام خطين الخلية: (1) PC3 عالية إيجابية PD-L1 خط الخلية و (2) SW620 منخفضة إيجابية PD-L1 خط الخلية. ثم تم إثراء الخلايا مع الجهاز الميكروفلويديك دوامة وتحليلها من قبل IF. كانت جميع الخلايا ملطخة بعلامة الورم المضادة للبانك، وعلامة خلايا الدم البيضاء المضادة للقرص CD45، ومكافحة PD-L1 (مفيدة في سرطان الرئة)، وDAPI (الصبغة النووية). تم تحديد خلايا الدم البيضاء على أنها إيجابية لDAPI وCD45، في حين تم تحديد الخلايا السرطانية على أنها إيجابية لDAPI وPanCK وسلبية لCD45. تم تلوين خط الخلية PC3 عالية PD-L1 إيجابية لPD-L1، في حين تم الكشف عن تعبير PD-L1 أقل في خط الخلية منخفض PD-L1.
ثم تمت مقارنة ما يلي: (1) اختبار تلطيخ السائل IF السائل، '2' تلطيخ CTCs المودعة مباشرة على الشرائح المغلفة بوليليسين، و (3) إذا تلطيخ CTCs بعد السيتوسبين على الشرائح المغلفة بوليليسين. ولوحظ بوضوح أن معدل استرداد الناقلات التجارية يتوقف على نوع البروتوكول المستخدم (الشكل3ألف). في السائل IF تلطيخ الاختبار، وكان معدل الانتعاش فقط 10٪ لعدد من mCTC ارتفعت كان أدنى. هذا المعدل المنخفض للشفاء يمثل مشكلة بالنسبة لمعظم المرضى الذين يعانون من NSCLC النقيلي، كما أنه يحد بشكل كبير من قدرة هذه الاختبارات لعزل عدد قليل من CTCs وتوفير المعلومات phenotypic. أما القسمان الثاني والثالث الموصوفان (الترسيب المباشر لـ mCTC أو CTC على الشرائح المغلفة بالبوليليسين بدون السيتوزين ومعه) فقد تجاوزت معدلات الاسترداد بشكل منهجي 60% (الشكل3ألف).
الشكل 3 B يظهر الصور التمثيلية من هذه الاختبارات IF باستخدام عينات الدم كله من نفس المريض، إما باستخدام السائل IF تلطيخ الاختبار أو IF اختبار تلطيخ على الشرائح المغلفة بوليليسين مع السيتوسبين. وكان تعداد النوى مختلفا ً بوضوح بين التجارب اثنين (الشكل3B). وقد وفرت تلطيخ DAPI النووي تعداد الخلايا الإجمالية في العينة، ومكّن تلطيخ العلامات الحيوية من تسليط الضوء على الخلايا الخضراء الإيجابية من PanCK، والبرتقالي في الخلايا الإيجابية PD-L1، والأحمر في الخلايا البيضاء المتبقية CD45 (الشكل3 B).
بعد ذلك، لتمييز خلايا الدم البيضاء من الخلايا السرطانية، يجب تصور شكل النواة، لأنها مميزة من نوع الخلية. الشكل 3 C يوضح الخطوط العريضة للنوى التي هي ضبابية ومورفولوجيا غير عادية في غياب الخطوة السيتوسبين. وبالتالي، فإن البروتوكول الأمثل يتضمن الغزل السيّد للمركبات المقطعية المثرى على الشرائح المغلفة بالبوليليسين، متبوعًا بتثبيت paraformaldehyde (PFA) بنسبة 4%، للحفاظ على الشرائح قبل تلطيخ IF. وكان هذا البروتوكول الأمثل معدلات الاسترداد مماثلة لترسب mCTC مباشرة على الشرائح المغلفة بوليليسين (الشكل3A)،حتى عندما أضيفعدد قليل جدا من الخلايا. منذ هذه الخطوة الإضافية تمكين الحفاظ على مورفولوجيا النووية (الشكل3C)،تم تحديد المحببات مع نوى متعددة الفصوص، فضلا عن الخلايا السرطانية (وصفت مع الصليب الأحمر في النواة) مع النووية التشوهات، وأنماط الأورام الخبيثة، وحجم أكبر مقارنة مع خلايا الدم البيضاء.
بعد التحسين من بروتوكول IF، تم إجراء دليل على مفهوم باستخدام الدم كله من المرضى النقيلي. وقد جُمعت العينات في المستقبل في إطار المجموعة الروتينية لـ CIRCAN التي تتخذ من مستشفى جامعة ليون مقراً لها. عادة ما يتم جمع الدم عندما لاحظ الأطباء أقرب مؤشر على تطور الورم. تم تأكيد جميع حالات الورم من الناحية النسيجية أو الخلوية على عينات خزعة FFPE أثناء التشخيص الأولي. وفي هذا النُهُل، أجرى المحققون الذين لم يتمكنوا من الوصول إلى البيانات السريرية أو المعرفة المسبقة بها، تحليلات مراكز مكافحة الإرهاب عند التقدم المحرز. وقد سبق أن نشرت الاعتبارات التفصيلية السابقة للتحليل15.
في الشكل 4والجدول 1والجدول 2،يتم عرض نتائج مختلفة من عينات المرضى. يمثل ملف تعريف CD45(+) وPanCK(-) وPD-L1(-) الخلايا المناعية. وقد تبين أن العدد المتبقي من خلايا الدم البيضاء متغير بقوة ويعتمد على عينة الدم بأكملها. وكان النطاق في هذه المجموعة التجريبية الصغيرة 648-11000 خلايا CD45 (+) بيضاء (الشكل5A). وبناء على ذلك، أُدرج تعداد للخلايا المجمعة، بعد إثراء رابع من هذه الخلايا، لضبط الكثافة الخلوية في منطقة السيتوسبين بكثافة 000 100 خلية/سيتوسبين (انظر الفرع 6). وقد مكّن ذلك من أداء العديد من السيتوسبينات لكل مريض وتحسين الملاحظة المجهرية للتعداد اليدوي واستخدام خط أنابيب برامج تحليل الصور.
في الشكل 4ألف- Cوالجدول 1والجدول 2،يتم الإبلاغ عن حالات نموذجية كانت فيها أعداد خلايا الدم البيضاء المتبقية مختلفة للغاية:
'1' الملف الشخصي الأول هو CD45(-) وPanCK(+) وPD-L1(+) الواردة في الشكل 4ألف. في كثير من الأحيان حجم الخلايا متفوقة على 13 ميكرومتر في القطر ومورفولوجيا النواة غير منتظمة، مما يمثل نمط النحيم السيتومورفولوجي. ومن المرجح أن يتألف هؤلاء السكان من لجنة مكافحة الإرهاب.
'2' والملف الشخصي الثاني هو CD45 (-) وPanCK (-) وPD-L1(+). وكما ذُكر من قبل، لا تعبر جميع مراكز مكافحة الإرهاب عن العلامة الأحيائية لـ PanCK (الشكل4ألف).
'3' والملف الشخصي الثالث هو CD45 (-) وPanCK(+) وPD-L1(-). وكما ذُكر من قبل، لا تعبر جميع مراكز مكافحة الإرهاب عن العلامة الأحيائية PD-L1.
'4' والملف الرابع هو CD45(+) وPanCK(+) وPD-L1(+) الواردة في الشكل 4باء. وهو يمثل الخلايا المناعية المنشطة غير النمطية في الدم المريض كله. وقد تم وصف هذه المجموعة في العديد من المنشورات16و17و18 وتمثل حوالي 5% من مجموع الخلايا بعد الإثراء. وقد يزيد وجود هذه المجموعة من معدل الـ CTCs الإيجابية الزائفة في عينة إذا كانت شدة إشارة CD45 منخفضة جداً ولم يتم حفظ مورفولوجيا النواة بشكل جيد. وهذا يسلط الضوء بقوة على الحاجة إلى تنفيذ تلطيخ العلامات الحيوية الورمية التكميلية، مثل Vimentin و / أو Epcam في هذا الفحص المناعي.
'5' وأخيراً، يتضمن التشكيل الجانبي الأخير الخلايا غير المسماة CD45 (-) وPanCK(-) وPD-L1(-)، التي تم إبرازها في الشكل 4جيم. غالباً ما تظهر النواة في هذه النواة أنماط الأورام الخبيثة السيتومورفولوجية، والحجم يزيد على 13 ميكرومتر في القطر. النسبة المئوية لهذه الخلايا في العينات متغيرة للغاية وفقا للدم المريض كله. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى استخدام العلامات الحيوية الورمية التكميلية لتأكيد النمط الورمي لهذه الخلايا الفرعية السكان.
وفي الجدول 1 والجدول 2، أُبلغ عن عدد الخلايا التي تضم 16 عينة من مرضى متقدمة في مجال النِشِيِّة. تم تصنيف الخلايا وفقا للتعبير عن المؤشرات الحيوية. ولوحظ تباين كبير في التجمعات السكانية الفرعية التي تم الحصول عليها. كما ذكرت بالفعل في الدراسات المستقلة، تم العثور على CD45 (-)، PanCK (+)، وPD-L1(+) التشكيلات الجانبية في معظم العينات. ومع ذلك، وبما أن عدد سكان لجنة مكافحة الإرهاب غير متجانس إلى حد كبير، فإن عينات المرضى تحتوي أيضاً على CD45 (-) وPanCK(-) وPD-L1(+) من السكان الفرعيين وCD45(-) وPanCK(+) وPD-L1 (-) السكان الفرعيين. كان مستوى خلايا الدم البيضاء المتبقية متغيرًا جدًا بين العينات التي تم تحليلها.
ولتيسير تعداد الخلايا، تم إنشاء خط أنابيب تجريبي باستخدام برنامج تحليل الصور لإجراء تحليل آلي للصور المناعية. ويرد وصف سير العمل في الشكل 5. في هذه الحالة، من المهم الحصول على صور عالية الجودة من الفلورة المناعية من حيث التباين وشدة الفلورة. اعتماداً على قدرة حساب الكتلة من الأجهزة، يمكن تطبيق خط أنابيب تحليل الصورة على الصورة المدمجة كاملة من السيتوسبين أو على منطقة تمثيلية من السيتوسبين.
هنا، استنادا إلى المجهر، مسح شبه الآلي للسيتوسبين (X / Y؛ التركيز Z غير المدرجة) المنطقة التي تم إنشاؤها 150-200 الصور المدمجة. يمكن دمج هذه الصور معًا وتحليلها مباشرة باستخدام خط أنابيب تحليل الصور. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء يستهلك موارد المجموعات وحسابها، وهو قيد هام على استخدامه الروتيني في المختبرات. لذلك، استنادا إلى الخبرة السابقة في مجال أمراض الدم الخلوية، تقرر تحليل المناطق التمثيلية لكل عينة بعد التحقق تحت المجهر من أن توزيع الخلايا كان متجانسا على كامل منطقة السيتوسبين. ثم، تم مسح 25٪ من المساحة الإجمالية للسيتوسبين (حوالي 40 البلاط) مع المجهر الإزهار لتوليد 40 × 4 صور مستقلة. تم تقسيم الملف المدمج حسب القنوات، وتم إنشاء ملفات الصور تلقائيًا باستخدام برنامج المجهر (انظر القسم 7؛ الشكل 5 A. تم استيراد هذه الملفات إلى خط أنابيب تحليل الصورة لتحليلها وفقا للمعلمات الموصوفة (انظر القسم 8; الشكل 5 A).
في الشكل 5B، حددنا يدويا صورة تمثيلية تعرض أربعة CTCs [CD45 (-) و PanCK (+) و PD-L1(+)] بين 77 خلية مناعية [CD45(+) وPanCK(-) و PD-L1(-)]. الشكل 5 يوضح B كيفية تحديد برنامج تحليل الصور وتعداد عدد الخلايا استناداً إلى تلطيخ DAPI. كما يوضح كيفية حساب برنامج تحليل الصور للكائنات الثانوية. وأخيراً، تم الإبلاغ عن كثافة الفلورة لكل قناة فلورسنت لجميع الكائنات المبلغ عنها في الصور.
تم حساب الخلفية وتمثيلها بواسطة الخلايا السالبة الموجودة في العينة. على سبيل المثال، الخلايا المناعية غير المنشطة لديها كثافة الفلورة منخفضة وتمكين قياس خلفية PanCK وPD-L1 تلطيخ. واعتبرت إشارة الفلورسنت إيجابية إذا تجاوزت شدة الفلورة تلك الخلفية بمقدار الضعف (استناداً إلى تحليل أربع عينات مستقلة من المرضى). وفيما يتعلق بتلطيخ CD45، حيث أن مستوى التعبير عن CD45 متغير للغاية في التجمعات السكانية الفرعية لخلايا الدم البيضاء، تم تعيين عتبة الإيجابية في أدنى مستوى ممكن. وقد استند إلى تحليل صور 10 دم كامل سليم ملطخ بالأجسام المضادة CD45. وأظهر التحليل التجريبي (العدد = 4) التوافق بين التعداد اليدوي وتعدادبرامج تحليل الصور (الجدول 2). يتم تحديد كل خلية على السيتوسبين من خلال برنامج تحليل الصور وتمكن علماء الأحياء من تتبع الخلية وتأكيد النتائج يدويا، إذا لزم الأمر.
الشكل 1 نظرة عامة على سير العمل لإزالة التلوث من: دوامة جهاز ميكروفلويديك الصك. (أ) ثلاث خطوات رئيسية مدرجة في عملية إزالة التلوث (انظر البروتوكول)، توضح توطين مدخلات الصك ونواتجه. (ب) صور تمثيلية لإثراء خط الخلية A549 قبل وبعد إزالة التلوث من الأداة. يظهر تأثير وجود عامل معدي على صلاحية ومورفولوجيا الخلايا التي تم جمعها. في وجود البكتيريا، تم تعديل مورفولوجيا الخلايا وصلاحيتها. شريط مقياس = 20 درجة مئوية (C) ثقافة الخلايا ثلاثية الدمن لعينات المرضى المخصب من سرطان الرئة والبروستاتا والثدي. الصليب الأحمر يتوافق مع الخلايا غير النمطية. شريط مقياس = 20 درجة.
الشكل 2 نظرة عامة على سير العمل من تحليل الفلورة المناعية من أخذ عينات الدم كله لتحليل الصور الفلورية. وتظهر الخطوات الرئيسية على النحو التالي: جمع الدم للدم كله، وجمع CTC مع جهاز microfluidic دوامة، اختبار الفلورة المناعية، وبرنامج تحليل الصور. وكان الدافع وراء اختيار العلامة الحيوية من خلال تحديد أفضل لمختلف مجموعات الخلايا التي يمكن ملاحظتها على الشريحة السيتوسبين (CD45 للخلايا المناعية، PanCK وPD-L1 لخلايا سرطان الرئة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 معدل استرداد ثلاثة بروتوكولات تلطيخ مستقلة: (أ) مقارنة بين معدل استرداد mCTCs من تلطيخ السائل، وتلطيخ مباشرة من الخلايا المودعة على الشرائح المغلفة بوليليسين، وتلطيخ الخلية بعد السيتوسبين على الشرائح المغلفة بوليليسين. (ب) الصور التمثيلية لعينات المرضى التي تتم معالجتها بواسطة بروتوكول IF السائل وبروتوكول تلطيخ المناعة المباشر مع السيتوسبينستيب. كانت ملطخة الخلايا مع CD45 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ HI30) اليكسا فلور 647; PanCK الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ AE1 /AE3) اليكسا فلور 488; 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندل (DAPI). شريط مقياس = 20درجة مئوية (C) الصور التمثيلية من DAPI تلطيخ من إثراء الخلية مع وبدون خطوة سيتوسبين. وقد تم عرض مورفولوجيا وحجم النوى باستخدام تلطيخ DAPI. الصليب الأحمر يسلط الضوء على الخلايا مع تشوهات في النواة في الصورة اليمنى. في الصورة اليسرى، تكون الصورة ضبابية، لأن الخلايا ليست في نفس المستوى (x-و y-و z-axes). شريط مقياس = 10 درجة.
الشكل 4 تعريف ملفات تعريفالخلايا. (أ) صور تمثيلية للمرضى الذين يعانون من ملامح مختلفة لـ CTC. يتم عرض قنوات الفلورة بشكل منفصل. يتم عرض الصور المدمجة على اليسار. هم ملطخة CD45 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ HI30) اليكسا فلور 647; PanCK الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ AE1 /AE3) اليكسا فلور 488; PDL-1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ 29E2A3) phycoerythrin; 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندال (DAPI); تشير الأسهم إلى خلايا غير نمطية. (ب) صور تمثيلية لتلطيخ المناعة لعينتين من المرضى مع ملامح خلايا الدم البيضاء غير النمطية. كانت ملطخة الخلايا مع CD45 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ HI30) اليكسا فلور 647; PanCK الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ AE1 /AE3) اليكسا فلور 488; PDL-1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (استنساخ 29E2A3) phycoerythrin; 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندل (DAPI). الصورة يسلط الضوء على وجود الخلايا المناعية ملطخة CD45 (+)، PanCK (+)، وPD-L1 (+). (C) الصورة يسلط الضوء على وجود الخلايا غير المسماة (CD45 (-)، PanCK (-)، وPD-L1 (-). شريط مقياس = 10 درجة.
الشكل 5 نظرة عامة على تحليل الصور الفلورية. (أ) يتم وصف الخطوات الرئيسية: المسح المجهري، وتقسيم القناة وفقا للفلورة، واستيراد الملفات إلى برنامج تحليل الصور. (B) وصف الخطوات الثلاث المختلفة لسير العمل لبرنامج تحليل الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: التعداد اليدوي لإثراء خلايا المريض. تعداد الخلايا استناداً إلى تلطيخ DAPI. تعداد الكائنات الأخرى استناداً إلى FITC، PE و CY5 تلطيخ.
الجدول 2: برنامج تحليل الصور تعداد إثراء الخلايا المريضة . تعداد الخلايا استناداً إلى تلطيخ DAPI. تعداد الكائنات الأخرى استناداً إلى FITC، PE و CY5 تلطيخ. مقارنة بين تعداد البرامج اليدوية وتحليل الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أثيرت نقطتان رئيسيتان في هذه الدراسة، الأولى فيما يتعلق بأداء سير العمل لنقله إلى التطبيقات السريرية، والثانية تتعلق بانخفاض الذاتية لتحليل صور الفلورة التي تم الحصول عليها.
تم تحديد سير عمل أداء ومحسن لتعداد CTC في البداية باستخدام فحص IF للتخصيص بعد إثراء الخلية عن طريق نظام microfluidic خالية من علامات CTC (جهاز ميكروفلويديك حلزوني). باستخدام سير العمل هذا، أكدت دراسة تجريبية أن جميع العينات من المرضى NSCLC النقيلي تحتوي على خلايا غير نمطية، والتي كانت جميع CD45 (-). ويمكن بدلا من ذلك أن تكون وصفت مع PanCK و / أو PD-L1 المؤشرات الحيوية؛ ومع ذلك، فإنها يمكن أيضا أن تكون سلبية تماما لجميع المؤشرات الحيوية التي تم اختبارها [CD45 (-)،PanCK (-)، وPD-L1 (-) كما لوحظ في عينة S19 (الجدول 2)]. وهذا يبرز بقوة الحاجة إلى علامات بيولوجية إضافية للمجموعات الفرعية للجنة مكافحة الإرهاب في النماذج الظاهرية. وبناء على ذلك، اقتُرح إضافة علامات بيولوجية الظهارية- mesenchymal مثل EpCAM، وفيمنتين، ون-كديرين؛ علامات الخلايا الجذعية السرطان بما في ذلك CD44 و CD133; وعلامات الورم محددة بما في ذلك TTF1 لسرطان الغدة الدرقية في الرئة.
في الدراسة التجريبية، كان نطاق الخلية غير النمطية [40; >400] من 3.5 مل من الدم كله. بالنسبة لـ 80% من عينات المريض، كان عدد الخلايا غير النمطية أكثر من 50. في الواقع، في الخلوية19،20،21 عينة من إندو الشعب الهوائية الترا سونيك دليل عبر التطلعات إبرة الشعب الهوائية أو الأشعة المقطعية الموجهة عبر الصدر ثقوب ، تحليل PD-L1 هو مناسبة في معظم العينات ، ولكن عتبة ≥ 100 يتم قبول الخلايا السرطانية عادة لإنتاج تفسير إحصائي وسريري للقيمة. ومع ذلك ، في حالة معينة من CTCs الدم ، تجدر الإشارة إلى أن مسألة عدم تجانس الورم المكاني يتم تجاوزها على النقيض من عينات الورم الصغيرة في الموقع.
وكانت النقطة الثانية هي تجنب تأثير المعالج على تحليل صور الفلورة المناعية. وهكذا تم إعداد برنامج تحليل الصور الفلورية لتوحيد تعداد الخلايا وتوفير البيانات الإحصائية لهذه العينات. وقد أبرزت هذه العملية الآلية الحاجة إلى مجموعات حسابية قوية لتحليل جميع الخلايا الواردة في نفس العينة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون نوعية تلطيخ IF في نفس المستوى (لتجنب استخدام أنظمة البؤر)، ويجب معايرة كثافة الخلايا على السيتوسبين لتمكين برنامج تحليل الصورة من التعرف على جميع الخلايا بشكل منفصل على الشريحة. وأخيراً، لم يتم التحقق من صحة النتائج فيما يتعلق بالنتائج السريرية في مجموعة من المرضى، ولكن ينبغي معالجة هذه النقطة في دراسة مخصصة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جان فيليب أوريل وكاثرين ويكي لي هم من موظفي شركة Biolidics التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل بمنح بحثية من أسترازينيكا (لندن، المملكة المتحدة)، وشركة بوليديكس (سنغافورة)، ورابطة مكافحة السرطان (سون ولوار، فرنسا). ويشكر المؤلفان شركتي أسترازينيكا وبيوليليكس على دعمهما المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
