Summary
Karakteriseringen av cirkulerande tumörceller (CTCs) är ett populärt ämne i translationell forskning. Detta protokoll beskriver en semi-automatisk immunofluorescensanalys (IF) för PD-L1 karakterisering och uppräkning av CTCs i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) patientprover.
Abstract
Cirkulerande tumörceller (CTCs) som härrör från den primära tumören är utgjutelse i blodomloppet eller lymfsystemet. Dessa sällsynta celler (1 − 10 celler per mL blod) motiverar en dålig prognos och är korrelerade med kortare total överlevnad i flera cancerformer (t. ex. bröst, prostata och kolorektal). För närvarande är anti-EpCAM-belagda magnetisk pärla-baserade CTC fånga system Gold standardtest godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) för uppräkning CTCs i blodet. Detta test är baserat på användningen av magnetiska pärlor belagda med anti-EpCAM markörer, som specifikt riktar epitelcancer celler. Många studier har visat att EpCAM inte är den optimala markören för CTC-detektering. I själva verket är CTCs en heterogen subpopulation av cancerceller och kan genomgå en epitelial-till-mesenkymala övergång (EMT) i samband med metastaserande proliferation och invasion. Dessa CTCs kan minska uttrycket av cellytan epitelial markör EpCAM, samtidigt öka mesenkymala markörer såsom vimentin. För att ta itu med detta tekniska hinder har andra isoleringsmetoder som baserar sig på CTCs fysikaliska egenskaper utvecklats. Microfluidic Technologies möjliggör en etikettfri metod för CTC-berikning från hela blodprov. Spiralen mikroflödessystem tekniken använder tröghets-och Dean dragkrafter med kontinuerligt flöde i böjda kanaler som genereras inom en spiral mikroflödessystem chip. Cellerna separeras baserat på skillnader i storlek och plasticitet mellan normala blodkroppar och tumorala celler. Detta protokoll beskriver de olika stegen för att karakterisera det programmerade Death-ligand 1 (PD-L1) uttrycket av CTCs, som kombinerar en spiral mikrofluidisk enhet med anpassningsbar immunofluorescensmarkör (om).
Introduction
Tumörantigen-specifika cytotoxiska T-lymfocyter (CTLs) spelar en avgörande roll i svaret på cancer genom en process som kallas cancer "immun övervakning". Deras anti-tumör funktioner förstärks av immun kontrollpunkt blockad antikroppar såsom CTLA-4-hämmare och PD-1/PD-L1-hämmare. I icke-småcellig lungcancer (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 terapier resultera i responsfrekvenser som sträcker sig från 0%-17% hos patienter med PD-L1-negativa tumörer och 36%-100% i de som uttrycker PD-L1. De robusta svaren på PD-1/PD-L1-blockad som observerats i melanom och NSCLC visas genom tecken på förbättrad total responsfrekvens (RR), varaktiga kliniska fördelar och progressionsfri överlevnad (PFS). För närvarande, anti-PD1 behandlingar är standard av vård i andra linjens NSCLC behandling med nivolumab oavsett PD-L1 uttryck och med pembrolizumab hos patienter som uttrycker PD-L1 ≥ 1%. I första linjens behandling är standard av vård pembrolizumab ensamt hos patienter med NSCLC som uttrycker PD-L1 ≥ 50% och kan potentiellt förstärkas med kemoterapi (Platin och Doublet läkemedel beroende på histologisk subtyp)1,2.
Emellertid, en sådan inställning till patienthantering är diskutabel3, eftersom PD-L1 uttryck i tumörceller av immunohistokemi (IHC) är förmodligen inte den mest idealiska följeslagare biomarker. Andra såsom tumör mutation börda4 (TMB), mikrosatelliten instabilitet (MSI), och/eller bakterieflora är möjligen intressant i denna inställning antingen ensam eller i kombination. NSCLC är kända för att vara heterogena tumörer, antingen rumsligt (från en tumör webbplats till en annan) eller temporalt (från diagnos till upprepning). Patienter med NSCLC är vanligtvis bräckliga, och iterativa invasiva vävnadbiopsier kan vara ett problem. Faktiskt, re-biopsi kurs vid första progression varierar från 46%-84% beroende på serie, och framgångsrik re-biopsi (vilket innebär med histologisk och full molekylär analys) varierar från 33%-75%. Detta innebär att 25%-67% av patienterna inte kan få en omfattande re-biopsi analys under första progression5,6,7,8.
Tillkomsten av "flytande biopsier" har därmed genererat stor entusiasm i denna särskilda inställning, eftersom det möjliggör avgörande omvärdering av molekylära förändringar under sjukdomsprogression genom att undersöka cirkulerande fritt DNA (cfDNA) som härrör från cirkulerande tumörceller (CTCs). Dessa levande celler släpps från tumören in i blodomloppet, där de cirkulerar fritt. Även om det inte rutinmässigt används, analysen av CTCs verkar vara mycket lovande när det gäller molekylär och fenotypisk karakterisering, prognos, och prediktiv betydelse i lungcancer (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna och proteinanalys). I själva verket, CTCs sannolikt Harbor fenotypiska egenskaper hos den aktiva sjukdomen snarare än de initiala markörer (upptäcks på vävnadbiopsier vid diagnos). Dessutom, CTCs kringgå problemet med rumslig heterogenitet av tumörvävnad, som kan vara en viktig fråga i små biopsier. Följaktligen kan PD-L1-uttryck på CTCs potentiellt belysa de avvikelser som härrör från dess användning som en prediktiv biomarkör med hjälp av tumör vävnad.
Nyligen har PD-L1-uttrycket testats i CTCs av NSCLC. Nästan alla av de patienter som testades9 var PD-L1-positiva, vilket komplierar tolkningen av resultatet och dess kliniska användning. Totalt sett upptäcktes PD-L1-positiva CTCs i 69,4% av proverna från ett genomsnitt av 4,5 celler/mL10. Efter initiering av strålbehandling ökade andelen PD-L1-positiva CTCs signifikant, vilket indikerar uppreglering av PD-L1-uttryck som svar på strålning11. Därför, PD-L1 CTCs analys kan användas för att övervaka dynamiska förändringar av tumören och immunsvar, som kan återspegla svaret på kemoterapi, strålning, och sannolikt immunterapi (IT) behandlingar.
Till datum, ctcs isolering och PD-L1 karakterisering förlita sig på olika metoder såsom anti-EpCAM-belagda magnetisk pärla-baserade CTC fånga, berikande-fri baserad analys, och storleksbaserade12,13 CTC Capture analyser. CTCs upptäcktes dock endast hos 45%-65% av patienterna med metastaserad NSCLC, vilket begränsade deras förmåga att tillhandahålla information för mer än hälften av metastaserande NSCLC-patienter. Dessutom var CTC-antalet låg i de flesta av dessa studier med hjälp av storleks-baserad metod10. Dessutom har denna metod lett till avvikelser såsom detektion av CD45 (-)/DAPI (+) celler med "cytomorphological mönster av malignitet" i blodet hos friska donatorer. Dessa farhågor belyser behovet av en mycket känslig metod för CTC insamling i samband med immun-fenotypning av atypiska CD45 (-) celler från friska helblod med hjälp av ytterligare cancer biomarkörer (i.e., TTF1, Vimentin, EpCAM, och CD44) i NSCLC.
Därför utvärderade vi en spiral mikroflödessystem enhet som använder tröghets-och Dean dragkrafter för att separera celler baserat på storlek och plasticitet genom ett mikroflödessystem chip. Bildandet av Dean Vortex flödar i mikroflödessystem chip resulterar i större ctcs ligger längs den inre väggen och mindre immunceller längs den yttre väggen av chip. Anrikningsprocessen slutförs genom att de större cellerna häverteffekt i insamlings uttaget som den anrikade CTC-fraktionen. Denna metod är särskilt känslig och specifik (detektion av cirka 1 CTC/mL helblod)14 och kan associeras med anpassade immunofluorescensanalyser (IF). Dessa verktyg kommer att möjliggöra inrättandet av ett positivt tröskelvärde för klinisk tolkning. Ett arbetsflöde beskrivs således som gör det möjligt för biologer att isolera och immunophenotyp CTCs med en hög hastighet av återhämtning och specificitet. Protokollet beskriver optimal användning av spiral mikroflödessystem enheten för att samla ctcs, den optimerade om analyser som kan anpassas efter cancertyp, och användning av fri öppen källkod för att mäta och analysera cell bilder för att utföra en halvautomatisk mikroorganismer av cellerna enligt fluorescerande färgning. Dessutom kan Mikroskop Multiplexing utföras beroende på antalet fluorescerande filter/markörer tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proverna samlades in prospektivt inom ramen för den CIRCAN ("cirkulerande CANcer") kohort baserad på Lyon universitetssjukhus efter patientens skriftliga medgivande. Denna studie integrerades i CIRCAN_ALL-kohorten. Studien CIRCAN_ALL erkändes som icke-interventionell av CPP South-East IV daterad 04/11/2015 under referens L15-188. En ändrad version erkändes som icke-interventionell på 20/09/2016 med hänvisning L16-160. Den CIRCAN_ALL studien förklarades till det och frihet korrespondent av Hospices Civils de Lyon på 01/12/2015, under hänvisa till 15-131. Blod insamling utfördes när läkare observerade den tidigaste indikationen av tumörprogression.
Anmärkning: Använd alla reagenser och material som beskrivs i tabell över material med respektive Förvaringsanvisningar för pre-analytisk provberedning och immunofluorescenstest. Att ersätta reagenser och/eller modifiera lagringsförhållanden kan resultera i suboptimala analys prestanda.
1. dekontaminering av Spiralmikrofluidisk apparat
Anmärkning: Dekontaminering av spiralen mikroflödessystem enheten är ett krav att ta bort alla immunofluorescensbakgrund som genereras från bakterier förorening, utforska cytomorphology av ctcs, och kunna skilja dem från normala immunceller. Protokollet är optimerat för blodprov som samlats i K2EDTA-rör inom 6 timmar efter blodprovstagning och berikats med spiralmikrofluidiska enheten under rena förhållanden. Användning av denna analys för andra typer av prover (andra biologiska vätskor) kan kräva ytterligare optimering. Detta protokoll för sanering bör göras en gång per vecka.
- Beredning av reagenser
- Beredning av spädningsvätskan buffert
- Sterilisera 20 mL spädningsvätska additiv reagens med ett 0,22 μm spruta filter och tillsätt direkt till 1 L 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS) Ultra-ren sort (tabell över material).
- Sterilisering av reagenser och inmatnings halm
- Sterilisera RBC lysis buffert och resuspension buffert (RSB; Tabell över material) med hjälp av ett 0,22 μm sprutfilter och lager i en ny 50 mL konisk tub för varje lösning.
- Sterilisera input halm genom inkuberande vid rumstemperatur (RT) för 1 h i universalrengöringsmedel (tabell över material). Överför halm till blekmedel-baserade rengöringsmedel (tabell över material) och inkubera vid RT för 1 h.
- Skölj ingången halm två gånger med steril PBS för 1 h vardera och förvara steriliserad input halm i en kirurgiskt steril påse (tabell över material).
- Beredning av spädningsvätskan buffert
- Dekontaminera spiralmikrofluidiska enheten
- Desinfektion med universalrengöringsreagens
- Koppla loss spädnings flaskans lock från spädnings porten på spiralmikrofluidiska enheten genom att skruva loss den bruna skruven. Under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp, överför upp till 250 mL allrengöringsmedel rengörings reagens (tabell över material) till en ny tom flaska.
- Skruva fast spädnings flaskans lock och halm på flaskan med 250 mL universalreagens för rengöring under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp. Sätt fast denna flaska på spiral mikroflödessystem-enhetens spädnings port genom att skruva tillbaka den bruna skruven.
- Överför upp till 100 mL blekmedel (1% slutkoncentration; Tabell över material) avfallsbehållaren som levereras i Run-satsen (figur 1a).
- Ladda en ny steril ingång halm på spiral mikroflödessystem enhet (tabell över material) i ingångsporten. Fyll på ett nytt 50 mL centrifugerör i ingångsporten. Ladda ett nytt 50 mL centrifugerör i utgångsporten.
- Fortsätt till Prime The spiral mikroflödessystem Device genom att klicka på Prime på spiral mikroflödessystem Device (3 min). Ta bort inmatningsröret efter att Prime har slutförts.
- Överför upp till 15 mL universalreagens till ett nytt 50 mL centrifugeringsrör med en serologisk pipett under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp och fäst röret i ingångsporten på spiralmikrofluidiska anordningen.
- Innan du påbörjar körningen, kontrollera att lösningen är fri från överdriven bubblor. Om det finns bubblor, ta bort dem genom långsam aspiration med en pipett.
- Ladda en dekontaminering mikrofluidic chip i spiral mikroflödessystem enhet. Kör ett program 3 på spiral mikroflödessystem enheten genom att klicka på Kör och välja programmet 3 (31 min).
Anmärkning: programmet 3 av spiral mikroflödessystem enheten möjliggör en snabb anrikning av ctcs i 31 min. - Fortsätt med spiral mikroflödessystem enhetens rengöringssteg med den återstående volymen av universalrengöringsmedel i inmatningsröret.
- Kassera inmatningsröret efter rengöring steg är klar, lämnar bakom ingången halm.
- Sanering med det blekmedel baserade rengöringsmedlet
- Koppla bort all-purpose rengöringsreagens flasklocket från spädningsvätskan i spiral mikroflödessystem-enheten genom att skruva loss den bruna skruven. Under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp, överför upp till 250 mL av det blekmedel baserade rengöringsmedlet (tabell över material) i en ny tom flaska (figur 1a).
- Skruva den allrengöringsmedel rengöring reagens flasklocket och halm till flaskan som innehåller blekmedel-baserade rengöringsmedel under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp. Sätt fast denna flaska på spiral mikroflödessystem-enhetens spädnings port genom att skruva tillbaka den bruna skruven.
- Överför upp till 15 mL av det blekmedel baserade rengöringsmedlet till ett nytt 50 mL centrifugeringrör med en serologisk pipett under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp. Ladda 50 mL Centrifugera röret inmatnings position. Fyll på ett tomt rör i utmatningsläge.
- Innan du bearbetar körningen, kontrollera att provet är fritt från alltför stora bubblor och om någon är närvarande, ta bort bubblorna genom att aspirera dem långsamt med en pipett.
- Kör program 3 genom att klicka på Kör och välja program 3 (31 min). Efter körningen, Fortsätt direkt till rengörings steget med hjälp av den återstående volymen blekmedel-baserade rengöringsmedel i inmatningsröret.
- Kassera in-och utgångs rören.
- Skölj spiralmikrofluidic enheten.
- Koppla bort blekmedel-baserade rengöringsmedel flasklocket från spädningsvätskan porten på spiralmikrofluidic enheten genom att skruva loss den bruna skruven. Under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp, överför sugröret från flaskan som innehåller det blekmedel baserade rengöringsmedlet till den nya flaskan som innehåller spädningsvätskan. Skruva flaskan på spiral mikroflödessystem-enheten.
- Överför upp till 15 mL steriliserat vatten (tabell över material) till ett nytt 50 ml centrifugeringsrör med en serologisk pipett under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp. Ladda 50 mL Centrifugera röret inmatnings position. Fyll på ett tomt rör i utmatningsläge.
- Innan du bearbetar körningen, kontrollera att provet är fritt från alltför stora bubblor och om någon är närvarande, ta bort bubblorna genom att aspirera dem långsamt med en pipett.
- Kör program 3 genom att klicka på Kör och välja program 3 (31 min). Efter körningen, Fortsätt direkt till rengörings steget med hjälp av den återstående volymen av steriliserat vatten i inmatningsröret.
- Kassera in-och utgångs rören.
- Desinfektion med universalrengöringsreagens
2. underhåll för att hålla Spiralmikrofluidiska enheten bakteriefria
Anmärkning: Det rutinmässiga underhållet ska göras i slutet av dagen under det sista rengörings steget.
- Överför upp till 7 mL av det blekmedel baserade rengöringsmedlet till det nya 50 mL centrifugeringsröret med hjälp av en serologisk pipett under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp. Skruva på blekmedel-baserade rengörings röret i ingångsporten på spiral mikroflödessystem enheten.
- Innan du bearbetar Clean Run, kontrollera att ingångs provet är fritt från alltför stora bubblor och om det finns några finns, ta bort bubblorna genom att aspirera dem långsamt med en pipett.
- Kör Clean på spiral mikroflödessystem enheten.
3. pre-analytisk anrikning av CTC från patient blodprov
- Samla 7,5 ml blod i K2EDTA röret och hålla under mild agitation för att undvika cell sedimentering och koagulering. Process inom 6 timmar.
Anmärkning: Om blodet samlas i ett cellfritt insamlings rör med DNA-blod som innehåller konserveringsmedel, förvara vid 4 ° c fram till bearbetningen. Kontrollera att blodprovet, RBC-lysbufferten och RBS-bufferten är vid RT innan du fortsätter med anriknings steget. - Överför upp till 7,5 mL helblod till ett nytt 50 mL centrifugeringsrör i inmatningsröret med hjälp av en serologisk pipett under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp.
- Centrifugera vid 1 600 x g i 10 minuter vid RT. samla upp plasma fraktionen med en pipett utan att störa Buffy Coat. Byt ut plasma fraktionen genom att tillföra direkt motsvarande volym PBS upp till 7,5 mL.
- Tillsätt försiktigt RBC-lysbufferten (tabell över material) till blodprov till en slutlig volym på 30 ml (för ett K2EDTA-rör) eller 37,5 ml (för ett CELLFRITT insamlings rör för DNA-blod). Vänd försiktigt blod uppsamlings röret 10X och inkubera i 10 minuter vid RT.
Anmärkning: Blodprovet blir mörkare rött under RBC Lys. Om ingen förändring (från mörkt röd och ogenomskinlig) observeras efter 10 min, försiktigt Invertera röret 3x och låt stå för en annan 5 min max. Lämna inte provet i RBC lysis buffert för mer än 15 min eftersom det kan äventyra provet kvalitet och assay prestanda. - Centrifugera det lyserade blodprovet med 500 x g i 10 minuter vid RT, med Centrifugera bromsar (eller högsta retardation). Använd en Pastavpipett eller serologisk pipett för att försiktigt ta bort supernatanten tills volymen når 4-5 mL-märket. Använd sedan filtrerade micropipett tips för att ta bort återstående supernatanten.
- Med hjälp av en P1000 micropipett med en filtrerad spets, tillsätt 1,0 mL RSB till väggen i 50 mL Centrifugera röret inmatningsröret. För att undvika att införa bubblor i blandningen, Omsuspendera cellpelleten genom att försiktigt Pipettera upp och ner tills provet är homogent.
- Tillsätt ytterligare 3 mL RSB till väggen i 50 mL Centrifugera Tube input Tube (total Volume 4 mL). Undvik att introducera bubblor i mixen. Blanda försiktigt cellsuspensionen genom att försiktigt Pipettera upp och ner.
Anmärkning: I den osannolika händelsen att regelbunden pipettering inte kan bryta ner cell klumpar (definieras genom att vara synlig eller blockera pipettspetsen), filtrera provet genom en cell SIL på 40 μm för att ta bort klumpar. Lägg till 150 μL av RSB i provet för att kompensera för volymförlust från filtrering. Observera att denna metod ska användas sparsamt och endast när stora klumpar observeras. - Innan du fortsätter till anriknings steget, kontrollera att provet är fritt från alltför stora bubblor och om något finns, ta bort bubblorna och var noga med att inte kassera något prov. Om små bubblor är närvarande, är deras avlägsnande inte krävs.
- Bearbeta provet på spiral mikroflödessystem enheten.
4. anrikning av CTCs från patientens helblod med Spiralmikrofluidiska enheten
- Ladda ett nytt spiral mikroflödessystem chip. Fyll på två tomma 50 mL centrifugrör i ingångs-och utgångs portarna.
- Kör ett Prime genom att klicka på Prime på spiral mikroflödessystem Device (3 min). Ta bort in-och utmatnings rören och ladda provet som ska bearbetas i ingångsporten.
- Ladda ett klart 15 mL koniskt rör i utgångsporten för att samla upp berikad CTCs. kör program 3 genom att klicka på Kör och välja program 3 (31 min).
- Lossa utmatnings röret och centrifugera vid 500 x g i 10 min (acceleration: 9; retardation: 5). med en 5 ml serologiska pipett, avlägsna supernatanten stoppa vid 2 ml-märket på den koniska 15 ml röret. Med en mikropipett, avlägsna supernatanten och stanna vid 100 μL märke på det koniska 15 mL röret. Bearbeta det berikade provet direkt för färgning av immunofluorescensteknik.
5. färgning av immunofluorescensteknik
- Räkna upp på en kamrar bild med en hemocytometer-typ rutnät antalet celler per ml. Späd det berikade provet med 0,2% anti-bindande lösning (tabell över material) till en koncentration som når 100 000 celler/100 μl per cytospin.
- Fukta prov kammarens kontur med hjälp av bomull (tabell över material) med 50 μL av 0,2% anti-bindande lösning. Placera en polylysine glas-Slide i provet kammaren och Stäng.
- Täck en spets med 0,2% antibindnings lösning genom att Pipettera upp och ner 3x. Omsuspendera det berikade provet och överför cell lösningen till provkammaren. Centrifugera med en särskild centrifug (tabell över material) vid 400 rpm under 4 min (accelerations låg).
- Placera en kisel isolator runt deponerings området. Låt torka glas-Slide under ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp för 2 min.
- Bered fixeringslösningen genom att späda 1 mL 16% PARAFORMALDEHYD (PFA) med 3 mL steril PBS. Tillsätt 100 μL Fixeringslösning (4% PFA) per prov och inkubera vid RT under 10 min. ta bort fixeringslösningen och utför tre tvättar med 200 μL PBS och inkubera vid RT för 2 min.
Försiktighet: Använd PFA under ett kemiskt säkerhetsskåp för att förhindra inandning. - Bered mättnadslösningen genom att späda fetalt bovint serum (FBS) till 5%, FC-receptorn (FcR) blockerande reagens vid 5%, och bovint serumalbumin (BSA) vid 1% i steril PBS (tabell över material). Tillsätt 100 μL mättnadslösning per prov och inkubera i 30 minuter vid RT. ta bort mättnadslösning.
- Tillsätt 100 μL antikropps lösning per prov (CD45 antikropp 1/20; PanCK antikropp 1/500; PD-L1-antikropp 1/200; QSP-mättnadslösning 100 μL) (tabell över material). Placera polylysin glas-Slide i en 100 mm x 15 mm petriskål. Fukta ett absorberande papper med 2 mL sterilt vatten och Stäng petriskål med locket. Placera vid 4 ° c över natten och skydda mot ljuset.
- Ta bort antikropps blandningen och utför 3 tvättar med 200 μL PBS-inkuberande varje tvätt i 2 min. Låt provet torka i 5 min och skydda det mot ljuset. Placera 10 μL monteringslösning (tabell över material) i området för deposition och täck med ett Mikroskop täckglas utan att göra en bubbla. Försegla täckslip med nagellack.
6. förvärv av Immunofluorescerande bilder med raka fluorescerande Mikroskop och tillhörande programvara
- Använd en rak fluorescerande Mikroskop med en X/Y motoriserad plattform. Använd en 20x målsättning att ta 8-bitars RGB TIFF-bilder i fyra kanaler som motsvarar DNA Dye (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), PanCK Dye (fluorescein isotiocyanat [FITC]), PD-L1 Dye (CY3), och CD45 Dye (CY5). Slå på Mercury LAMP 15 min före användning, och anpassa Mikroskop och tillhörande programvara till semi-automatiserad shoot.
- Placera glas bilden på bryggan.
- I anskaffnings menyn definierar du de fyra kanalerna och ställer in exponeringstiden (DAPI: 15 MS, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 MS; CY5 [CD45]: 1 000 MS). Definiera panelerna som ska genomsökas. Klicka på brickor. I Avancerat experimentdefinierar du det område som ska genomsökas.
- Justera fokus på skärmen. Klicka på Starta experiment.
- Exportera TIF-filer för varje kanal och specifikt namnge bildfilen med denna information: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. tif (t. ex. Sample1_TR1_c1m01). Namn Dye enligt följande: den DAPI kanal är C1, FITC kanal är C2, CY3 kanal är C3, och CY5 kanal är C4.
7. analys av Immunofluorescerande bilder med Bildanalysprogram
- Ladda ner och installera gratis bildanalysprogram vara från Broad Institute webbplats. Acceptera alla standardinställningar under installationen. Öppna bildanalysprogram och klicka på Arkiv | Pipeline från fil | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
Anmärkning: Pipelinen omvandlar RGB-färgbilder till gråskala, tar bort artefakter genom att jämna ut bilder med ett median filter, identifierar kärnor och cytoplasma, kvantifierar fluorescensintensiteter för varje kanal och exporterar dem till en Excel-fil. - Släpp filer i fillistan. Uppdatera metadata för att gruppera filerna efter paneler.
Anmärkning: Alla instruktioner för att gruppera bilder anges i programvaran. Namnfiler dök upp i Namesandtypes modul och filer grupperas enligt numret på kakel och kanal per prover. - Klicka på Visa utdatainställningar och ange en korrekt Standardutbild. Klicka på analysera bilder. Öppna kalkylbladsfilen som motsvarar measure_intensity parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den första förutsättningen var att erhålla okontaminerade (smittfria) samlingar av CTCs för vävnadsodling och undvika om bakgrunden genereras. Sanering protokollet aktiverat rengöring av alla rör och pumpar, och det resulterade i insamling av CTCs med en bra återvinningsgrad utan bakteriell kontaminering. De anrikade proverna jämfördes utan och med dekontamineringsprotokollets arbetsflöde för spiral mikroflödessystem-enheten. För att validera dekontamineringsprotokollet användes A549-celllinjen i frånvaro av helblod och berikades direkt med spiralmikrofluidic-enheten. Utan det optimerade dekontamineringsprotokollet observerades hög bakteriell kontamination i vävnads kulturen av anrikad A549 cellinjer efter endast 24 h, vilket orsakade döden och cytomorphological förändringar i eukaryota celler (figur 1B).
Efter renings protokollet erhölls däremot levande A549 celler genom odling i 2D-kultur efter 10 timmar vävnadsodling och medie borttagning och i 3D-förhållanden (figur 1B) samt patientprover (figur 1C). Den potentiella CTC identifieras med ett rött kors (figur 1C).
Figur 2 recapitulates hela arbetsflödet för immunofluorescensfenotypning av anrikade ctcs från helblod. Den består av fyra stora steg: hela blodprovstagning, CTC-berikning, immunofluorescenstest (IF) och bildanalys med hjälp av programvara. Tidigare har återvinningsgraden för spiralmikrofluidic-enheten åtgärdats14. Med hjälp av fluorescerande imitera CTCs (mCTC) fastställdes denna återvinningsgrad vid 1,3 CTCs/mL helblod14.
Det nuvarande arbetet fokuserade på att skapa optimala förutsättningar för om analys av anrikade CTCs och nedströms visualisering (figur 2). För det första, för att testa specificiteten hos PD-L1-antikroppen, användes två cellinjer: (1) PC3 hög-positiv-PD-L1-cellinjer och (2) SW620 låg-positiv-PD-L1-celllinje. Cellerna var sedan berikade med spiral mikroflödessystem enheten och analyseras av IF. Alla celler färgas med tumören anti-PanCK markör, vita blodkroppar anti-CD45 markör, anti-PD-L1 (användbart i lungcancer), och DAPI (nukleär färgämne). Vita blodkroppar identifierades som positiva för DAPI och CD45, medan cancerceller identifierades som positiva för DAPI och PanCK och negativa för CD45. Den PC3 hög-PD-L1-positiva cellinjer var positivt färgade för PD-L1, medan ett lägre PD-L1 uttryck upptäcktes i SW620 låg-PD-L1-negativ cell linje.
Därefter jämfördes följande: (i) vätska om infärgnings analys, (II) färgning av CTCs direkt deponeras på polylysin-belagda diabilder, och (III) om färgning av CTCs efter cytospin på polylysine-belagda diabilder. Det konstaterades tydligt att återvinningsgraden för CTCs berodde på vilken typ av protokoll som användes (figur 3a). I vätskan om infärgnings analysen var återvinningsgraden endast 10% för antalet spetsiga mCTC var den lägsta. Denna låga återvinningsgrad utgör en fråga för de flesta patienter med metastaserad NSCLC, eftersom det signifikant begränsar förmågan hos dessa tester för att isolera de få CTCs och ge fenotypisk information. Det andra och tredje avsnittet som beskrevs (direkt avsättning av mCTC eller CTC på polylysinbelagda glidbanor utan och med cytopsin) hade systematiskt återvinningsgrad som översteg 60% (figur 3a).
Figur 3 B visar representativa bilder av dessa om analyser med hjälp av helblod prov från samma patient, antingen med hjälp av vätskan om färgning analys eller om färgning assay på polylysine-belagda diabilder med cytospin. Uppräkningen av kärnor var klart annorlunda mellan de två analyserna (figur 3B). Den nukleära DAPI-färgning under förutsättning att uppräkning av totala celler i provet, och biomarkör färgning aktiverat highlighting av de gröna PanCK-positiva celler, orange i PD-L1-positiva celler, och rött i CD45 kvarvarande vita blodkroppar (figur 3 B).
Nästa, att cytologiskt skilja vita blodkroppar från tumorala celler, formen på kärnan måste visualiseras, eftersom det är kännetecknande för celltypen. Figur 3 C visar konturerna av kärr som är suddiga och morfologi som är ovanligt i avsaknad av cytospin steg. Det optimerade protokollet inkluderade således cytospinning av anrikat CTCs på polylysin-belagda diabilder följt av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fixering, för att bevara bilderna före om färgning. Detta optimerade protokoll hade liknande återvinningsgrad som avsättning av mCTC direkt på polylysinbelagda diabilder (figur 3a), även när mycket få celler lades till. Eftersom detta ytterligare steg möjliggör bevarande av nukleär morfologi (figur 3C), identifierades granulocyter med deras flerflikade kärnor, liksom tumorala celler (märkta med ett rött kors i kärnan) med deras nukleära missbildningar, malignitet mönster, och större storlek jämfört med vita blodkroppar.
Efter optimering av IF-protokollet genomfördes ett proof-of-Concept med hjälp av helblod från metastaserande patienter. Proverna samlades in prospektivt inom ramen för den CIRCAN-rutinkohort som var baserad på Lyons universitetssjukhus. Blod insamling utfördes vanligtvis när läkare observerade den tidigaste indikationen av tumörprogression. Alla tumör fall var histologiskt eller cytologiskt bekräftade på FFPE biopsi prover under den första diagnosen. Här utfördes CTCs-analyser vid progression av utredare som inte hade tillgång till eller förkunskaper i kliniska data. Detaljerade för analytiska överväganden har tidigare publicerats15.
I figur 4, tabell 1och tabell 2presenteras olika fynd från patientprover. Profilen CD45 (+), PanCK (-), PD-L1 (-) representerar immuncellerna. Resträkningen av vita blodkroppar visade sig vara starkt varierande och beroende av hela blodprovet. Intervallet i denna lilla pilot kohort var 648-11000 vita CD45 (+) celler (figur 5A). Omedelbart efter CTC-berikning inkluderades därför en uppräkning av de insamlade cellerna för att justera CELLTÄTHETEN på cytospinområdet med en densitet av 100 000 celler/cytospin (se avsnitt 6). Detta möjliggjorde prestanda för flera cytospins per patient och optimering av mikroskopisk observation för manuell uppräkning och användning av bildanalysprogram vara pipeline.
I figur 4A-C, tabell 1och tabell 2rapporteras typiska fall där kvarvarande antal vita blodkroppar var mycket olika:
i) den första profilen är CD45 (-), PanCK (+) och PD-L1 (+) som presenteras i figur 4A . Ofta storleken på cellerna är överlägsen 13 μm i diameter och kärnan morfologi är oregelbunden, som representerar ett cytomorphological mönster av malignitet. Denna population är sannolikt sammansatt av CTC.
II) den andra profilen är CD45 (-), PanCK (-) och PD-L1 (+). Som redan rapporterats, inte alla ctcs uttrycka panck biomarkör (figur 4A).
III) den tredje profilen är CD45 (-), PanCK (+) och PD-L1 (-). Som redan rapporterats uttrycker inte alla CTCs PD-L1-biomarker.
IV) den fjärde profilen är CD45 (+), PanCK (+) och PD-L1 (+) som presenteras i figur 4B. Det representerar de atypiska aktiverade immuncellerna i patientens helblod. Denna population har beskrivits i flera publikationer16,17,18 och representerar cirka 5% av de totala cellerna efter berikning. Närvaron av denna population kan öka frekvensen av falskt positiva CTCs i ett prov om intensiteten av CD45 signalen är för låg och morfologin av kärnan inte är väl bevarad. Detta belyser starkt behovet av att utföra kompletterande tumoral färgning av biomarkörer, såsom Vimentin och/eller EpCAM i denna immunofluorescenstest.
(v) Slutligen, den sista profilen innehåller omärkta celler CD45 (-), PanCK (-), och PD-L1 (-), markerat i figur 4C. Kärnan i denna population visar ofta cytomorphological mönster av malignitet, och storleken är över 13 μm i diameter. Andelen av dessa celler i proverna varierar mycket beroende på patientens helblod. Detta belyser behovet av att använda kompletterande tumoral biomarkörer för att bekräfta det tumoraliska mönstret av denna cell sub-population.
I tabell 1 och tabell 2 rapporterades cell räkningen på 16 prover från avancerade metastaserande NSCLC-patienter. Cellerna klassificerades enligt uttrycket av biomarkörer. Hög variabilitet observerades i de subpopulationer som erhållits. Som redan rapporterats i oberoende studier, CD45 (-), PanCK (+), och PD-L1 (+) profiler hittades i de flesta prover. Eftersom CTC-populationen är mycket heterogen patientproverna innehöll också CD45 (-), PanCK (-), och PD-L1 (+)-subpopulationer, under populationerna CD45 (-), PanCK (+) och PD-L1 (-) och omärkta celler CD45 (-), PanCK (-) och PD-L1 (-) underpopulationer. Nivån på kvarvarande vita blodkroppar var mycket varierande bland analyserade prover.
För att underlätta cell uppräkning inrättades en pilotpipeline med hjälp av bildanalys programmet för en automatiserad analys av immunofluorescensbilderna. Arbetsflödet beskrivs i figur 5. I detta fall är det viktigt att förvärva högkvalitativa immunofluorescensbilder i form av kontrast och fluorescensintensitet. Beroende på kapaciteten för kluster beräkning av maskinvaran, kan bilden analyspipeline appliceras på den kompletta sammanslagna bilden av cytospin eller på ett representativt område av cytospin.
Här, baserat på mikroskopet, en semi-automatiserad genomsökning av cytospin (X/Y; Z fokus ingår inte) område genererade 150-200 sammanslagna bilder. Dessa avbildningar kan slås samman och direkt analyseras med hjälp av bildanalys pipeline. Detta förfarande är dock tids-och beräkningskluster resurskrävande, en viktig begränsning för dess rutinmässig användning i laboratorier. Därför, baserat på tidigare erfarenhet inom cellulär hematologi, beslutades det att analysera representativa områden av varje prov efter att ha kontrollerat under ett Mikroskop att fördelningen av celler var homogen på hela området av cytospin. Sedan, 25% av den totala arealen av cytospin (runt 40 plattor) skannades med blomställning Mikroskop för att generera 40 x 4 oberoende bilder. Den sammanslagna filen delades av kanaler och bildfiler genererades automatiskt med Mikroskop programvaran (se avsnitt 7; Figur 5 A). dessa filer importerades till en bildanalys pipeline för analys enligt de beskrivna parametrarna (se avsnitt 8; Figur 5 A).
I figur 5B, identifierade vi manuellt en representativ bild som visar fyra ctcs [CD45 (-), panck (+), och PD-L1 (+)] bland 77 immunceller [CD45 (+), panck (-), och PD-L1 (-)]. Figur 5 B illustrerar hur bildanalys programmet identifierade och räknade upp antalet celler baserat på DAPI-färgning. Den illustrerar också hur bildanalysprogram varan räknade de sekundära objekten. Slutligen rapporterades fluorescensintensiteter för varje fluorescerande kanal för alla objekt som rapporteras i bilderna.
Bakgrunden beräknades och representeras av de negativa celler som finns i provet. Till exempel har de icke-aktiverade immuncellerna låg fluorescensintensitet och möjliggjort mätning av bakgrunden till PanCK-och PD-L1-färgning. Den fluorescerande signalen ansågs positiv om fluorescensintensiteten översteg den i bakgrunden med två gånger (baserat på analysen av fyra oberoende patientprover). När det gäller CD45 färgning, eftersom uttrycksnivån för CD45 är mycket varierande i de vita blodkropparna subpopulationer, tröskeln för positivitet var inställd så låg som möjligt. Det baserades på analysen av bilder av 10 friska helblod färgade med CD45 antikropp. Pilot analysen (n = 4) visade konkordans mellan manuell uppräkning och bildanalysprogram uppräkning (tabell 2). Varje cell på cytospin identifieras av bildanalysprogram och gör det möjligt för biologer att spåra cellen och manuellt bekräfta resultaten, om det behövs.
Figur 1 : Översikt över arbetsflödet för sanering av spiral mikroflödessystem enhet instrumentet. A) tre viktiga steg som ingår i dekontamineringsprocessen (se protokollet) och som illustrerar lokaliseringen av instrumentets in-och utgångar. Brepresentativa bilder av A549 cellinsberikning före och efter dekontaminering av instrumentet. Effekterna av förekomsten av ett smittämne på livskraft och morfologi av insamlade celler visas. I närvaro av bakterier, cellmorfologi och lönsamhet ändrades. Skalstapel = 20 μm. (C) 3D-cellkultur av berikade patientprover av lung-, prostata-och bröstcancer. Röda korset motsvarar atypiska celler. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Översikt över arbetsflödet av immunofluorescensanalys från helblod provtagning till analys av fluorescensbilder. De stora stegen visas på följande sätt: blod insamling för helblod, CTC-insamling med spiral mikrofluidisk enhet, immunofluorescenstest och bildanalysprogram vara. Valet av biomarkör drevs av bättre identifiering av olika populationer av celler observerbara på cytospin Slide (CD45 för immunceller, PanCK och PD-L1 för lungcancerceller). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Återvinningsgrad av tre oberoende färgprotokoll. A) jämförelse av återvinningsgraden för mCTCs från vätske färgning, direkt färgning av celler som satts in på polylysinbelagda glidbanor och cell färgning efter cytospin på polylysinbelagda glas. Brepresentativa bilder av patientprover som behandlats med vätska om protokollet och det direkta immun Färgnings protokollet med cytospinstep. Celler färgas med CD45 monoklonal antikropp (klon HI30) Alexa fluor 647; PanCK monoklonal antikropp (klon AE1/AE3) Alexa fluor 488; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Skalstapel = 20 μm. (C) representativa bilder av DAPI-färgning av cellberikning med och utan cytospinsteget. Morfologin och storleken på atomkärnor visades med DAPI-färgning. Röda korset belyser celler med avvikelser i kärnan i den högra bilden. I den vänstra bilden är bilden suddig, eftersom cellerna inte är på samma nivå (x-, y-och z-axlar). Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Identifiering av cell profiler. A) representativa bilder av patienter med olika CTC-profiler. Fluorescenskanalerna presenteras separat. De sammanslagna bilderna visas till vänster. De färgas med CD45 monoklonal antikropp (klon HI30) Alexa fluor 647; PanCK monoklonal antikropp (klon AE1/AE3) Alexa fluor 488; PDL-1 monoklonal antikropp (klon 29E2A3) phycoerythrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); pilar pekar mot atypiska celler. Brepresentativa bilder av immunofärgning av två patientprover med atypiska vita blod cells profiler. Celler färgas med CD45 monoklonal antikropp (klon HI30) Alexa fluor 647; PanCK monoklonal antikropp (klon AE1/AE3) Alexa fluor 488; PDL-1 monoklonal antikropp (klon 29E2A3) phycoerythrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Bilden belyser närvaron av immunceller färgade med CD45 (+), PanCK (+), och PD-L1 (+). (C) bilden belyser närvaron av omärkta celler (CD45 (-), panck (-) och PD-L1 (-). Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Översikt över analys av fluorescerande bilder. (A) de viktigaste stegen beskrivs: mikroskopi skanning, kanalen delas enligt fluorescens, och import av filer till bildanalysprogram. (B) Beskrivning av de tre olika stegen för arbetsflödet i bildanalysprogram varan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: manuell uppräkning av patient cell berikning. Uppräkning av celler baserade på DAPI-färgning. Uppräkning av andra objekt baserade på FITC, PE och CY5 färgning.
Tabell 2: Bildanalysprogram vara uppräkning av patient cells berikning . Uppräkning av celler baserade på DAPI-färgning. Uppräkning av andra objekt baserade på FITC, PE och CY5 färgning. Jämförelse av manuell räkning och bildanalysprogram vara uppräkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två viktiga punkter togs upp i den aktuella studien, den första med avseende på utförandet av arbetsflödet för dess överföring till kliniska tillämpningar, och den andra om minskningen av subjektivitet för analys av fluorescensbilder som erhållits.
Ett högpresterande och optimerat arbetsflöde för CTC-uppräkning bestämdes initialt med hjälp av anpassningsbar IF-analys efter cell berikning via ett CTC-etikettfritt mikroflödessystem-system (spiral mikroflödessystem Device). Med hjälp av detta arbetsflöde bekräftade en pilotstudie att alla prover från metastaserande NSCLC-patienter innehöll atypiska celler, vilka alla var CD45 (-). De kan alternativt märkas med PanCK och/eller PD-L1-Biomarkers. de kan dock också vara helt negativa för alla testade biomarkörer [CD45 (-), PanCK (-) och PD-L1 (-) som observerats i S19-provet (tabell 2)]. Detta belyser starkt behovet av ytterligare biomarkörer för fenotypning av CTC-underpopulationer. Följaktligen har det föreslagits att lägga till epitelial-mesenkymala biomarkörer såsom EpCAM, Vimentin, och N-cadherin; markörer för cancer stamceller, inklusive CD44 och CD133; och specifika tumörmarkörer inklusive TTF1 för lung adenocarcinom.
I pilotstudien var utbudet av atypisk cell [40; > 400] från 3,5 mL helblod. För 80% av patientproverna var den atypiska cell räkningen över 50. Faktum är att i cytologiska19,20,21 prover från endo bronkial Ultra Sonic guide trans bronkial nål aspiration eller CT-guidad trans-Thoracic punkteringar, PD-L1 analys är lämplig i de flesta av prover, men en tröskel på ≥ 100 tumörceller är allmänt erkänt att producera en statistisk och klinisk tolkning av värdet. Men i det särskilda fallet av blod CTCs, det bör noteras att frågan om rumsliga tumör heterogenitet kringgås i motsats till små på plats tumörprover.
Den andra punkten var att undvika effekten av hanteraren för analys av immunofluorescensbilder. Bildanalysprogram vara av fluorescerande bilder har därför inrättats för att standardisera cell uppräkning och tillhandahålla statistiska data för dessa prover. Den här automatiserade processen betonade behovet av kraftfulla beräkningskluster för analys av alla celler som ingår i samma prov. Dessutom måste kvaliteten på om färgning måste vara i samma plan (för att undvika användning av konfokalsystem), och densiteten av celler på cytospin skall kalibreras för att möjliggöra bildanalysprogram vara för att känna igen alla celler separat på bilden. Slutligen, resultaten validerades inte avseende kliniska resultat i en kohort av patienter, men denna punkt bör behandlas i en annan dedikerad studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jean-Philippe Aurel och Kathryn Weiqi Li är anställda av Biolidics företag som producerar instrument som används i denna artikel. De andra författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsbidrag från AstraZeneca (London, Förenade kungariket), Biolidics (Singapore) och Ligue contre le cancer (Saone et Loire, Frankrike). Författarna tackar AstraZeneca och Biolidics företag för deras ekonomiska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
