Summary
La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
Abstract
Le cellule tumorali circolanti (CTC) derivate dal tumore primario vengono versate nel flusso sanguigno o nel sistema linfatico. Queste cellule rare (1,10 cellule per mL di sangue) giustificano una prognosi infamabile e sono correlate con una sopravvivenza complessiva più breve in diversi tipi di cancro (ad esempio, seno, prostata e colorettale). Attualmente, il sistema di cattura CTC basato su perline magnetico anti-EpCAM è il test standard d'oro approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per enumerare i CTC nel flusso sanguigno. Questo test si basa sull'uso di perline magnetiche rivestite con marcatori anti-EpCAM, che colpiscono specificamente le cellule tumorali epiteliali. Molti studi hanno dimostrato che epCAM non è il marcatore ottimale per il rilevamento CTC. Infatti, i CTC sono una sottopopolazione eterogenea di cellule tumorali e sono in grado di subire una transizione epiteliale-mesenferica (EMT) associata alla proliferazione metastatica e all'invasione. Questi CTC sono in grado di ridurre l'espressione del marcatore epiteliale della superficie cellulare EpCAM, aumentando al contempo marcatori mesenchymici come la vimentina. Per affrontare questo ostacolo tecnico, sono stati sviluppati altri metodi di isolamento basati sulle proprietà fisiche dei CTC. Le tecnologie microfluidiche consentono un approccio privo di etichette all'arricchimento del CTC da campioni di sangue intero. La tecnologia microfluidica a spirale utilizza le forze di trascinamento inerziali e Decano con flusso continuo in canali curvi generati all'interno di un chip microfluidico a spirale. Le cellule sono separate in base alle differenze di dimensioni e plasticità tra le cellule del sangue normali e le cellule tumorali. Questo protocollo descrive in dettaglio i diversi passaggi per caratterizzare l'espressione programmata death-ligand 1 (PD-L1) dei CTC, combinando un dispositivo microfluidico a spirale con set di marcatori immunofluorescenza (IF) personalizzabili.
Introduction
I TL (TL) specifici dell'antigene tumorale svolgono un ruolo cruciale nella risposta ai tumori attraverso un processo noto come "sorveglianza immunitaria" del cancro. Le loro funzioni antitumorali sono potenziate da anticorpi di blocco del checkpoint immunitario come gli inibitori ctLA-4 e gli inibitori PD-1/PD-L1. Nel cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), le terapie anti-PD-1/PD-L1 si traducono in tassi di risposta che vanno dallo 0%-17% nei pazienti con tumori PD-L1-negativi e 36%-100% in quelli che esprimono PD-L1. Le risposte robuste al blocco PD-1/PD-L1 osservate nel melanoma e nel NSCLC sono mostrate da prove di un miglioramento del tasso di risposta globale (RR), dei benefici clinici duraturi e della sopravvivenza senza progressione (PFS). Attualmente, i trattamenti anti-PD1 sono lo standard di cura nel trattamento NSCLC di seconda linea con nivolumab indipendentemente dall'espressione PD-L1 e con pembrolizumab in pazienti che esprimono PD-L1 1%. Nel trattamento di prima linea, standard di cura è pembrolizumab da solo in pazienti con NSCLC che esprimono PD-L1 -50% e può essere potenzialmente migliorato con la chemioterapia (platin e doublet drug a seconda del sottotipo istologico)1,2.
Tuttavia, un tale approccio alla gestione del paziente è discutibile3, poiché l'espressione PD-L1 nelle cellule tumorali per immunohistochimica (IHC) probabilmente non è il biomarcatore compagno più ideale. Altri come il carico di mutazione tumorale4 (TMB), l'instabilità dei microsatelliti (MSI) e/o il microbiota sono probabilmente interessanti in questo ambiente da soli o in combinazione. NSCLC sono noti per essere tumori eterogenei, sia spazialmente (da un sito tumorale a un altro) o temporalmente (dalla diagnosi alla ricorrenza). I pazienti con NSCLC sono solitamente fragili e le biopsie iterative dei tessuti possono essere un problema. Infatti, il tasso di ri-biopsia alla prima progressione varia dal 46%-84% a seconda della serie, e la ri-biopsia di successo (che significa con analisi molecolare istologica e completa) varia dal 33%-75%. Ciò significa che il 25%-67% dei pazienti non può ricevere un'analisi di ribio completa durante la prima progressione5,6,7,8.
L'avvento delle "biopsie liquide" ha quindi generato un notevole entusiasmo in questo particolare contesto, in quanto consente una rivalutazione cruciale delle alterazioni molecolari durante la progressione della malattia esaminando il DNA libero circolante (cfDNA) derivato dalla circolazione cellule tumorali (CTC). Queste cellule vive vengono rilasciate dal tumore nel flusso sanguigno, dove circolano liberamente. Sebbene non venga utilizzata regolarmente, l'analisi dei CTC sembra essere molto promettente nel caso della caratterizzazione molecolare e fenotipica, della prognosi e del significato predittivo nel cancro del polmone(tramite DNAseq, RNAseq, miRNA e analisi delle proteine). Infatti, le CTC probabilmente ospitano caratteristiche fenotipiche della malattia attiva piuttosto che i marcatori iniziali (rilevati sulle biopsie dei tessuti alla diagnosi). Inoltre, i CTC bypassano il problema dell'eterogeneità spaziale del tessuto tumorale, che può essere un problema cruciale nelle piccole biopsie. Di conseguenza, l'espressione PD-L1 sui CTC può potenzialmente far luce sulle discrepanze derivate dal suo uso come biomarcatore predittivo utilizzando il tessuto tumorale.
Recentemente, l'espressione PD-L1 è stata testata nei CTC di NSCLC. Quasi tutti i pazienti testati9 erano PD-L1 positivo, complicando l'interpretazione del risultato e il suo uso clinico. Complessivamente, sono stati rilevati CTC PD-L1 positivi nel 69,4% dei campioni da una media di 4,5 cellule/mL10. Dopo l'inizio della radioterapia, la percentuale di CTC PD-L1-positivi è aumentata in modo significativo, indicando l'upregolazione dell'espressione PD-L1 in risposta alle radiazioni11. Di conseguenza, l'analisi dei CTC PD-L1 può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti dinamici del tumore e della risposta immunitaria, che possono riflettere la risposta alla chemioterapia, alle radiazioni e ai probabili trattamenti di immunoterapia (IT).
Ad oggi, l'isolamento CTCs e la caratterizzazione PD-L1 si basano su vari metodi come l'acquisizione CTC basatasu perline magnetiche anti-EpCAM, l'analisi basata sull'arricchimento e i saggi di acquisizione 12,13 CTC basati sulle dimensioni. Tuttavia, le CTC sono state rilevate solo nel 45%-65% dei pazienti con NSCLC metastatico, limitando così la loro capacità di fornire informazioni per più della metà dei pazienti con NSCLC metastatico. Inoltre, il numero di CTC era basso nella maggior parte di questi studi utilizzando l'approccio basato sulle dimensioni10. Inoltre, questo metodo ha portato a discrepanze come la rilevazione di cellule CD45(-)/DAPI() con "modelli citomorfologici di malignità" nel flusso sanguigno di donatori sani. Queste preoccupazioni evidenziano la necessità di un metodo altamente sensibile di raccolta CTC associato con immuno-fenotyping di cellule atipiche CD45 (-) da sangue intero sano utilizzando ulteriori biomarcatori del cancro (cioè, TTF1, Vimentin, EpCAM, e CD44) in NSCLC.
Di conseguenza, abbiamo valutato un dispositivo microfluidico a spirale che utilizza forze di trascinamento inerziali e Decano per separare le cellule in base alle dimensioni e alla plasticità attraverso un chip microfluidico. La formazione del vortice Dean scorre presente nel chip microfluidico si traduce in CTC più grandi situati lungo la parete interna e cellule immunitarie più piccole lungo la parete esterna del chip. Il processo di arricchimento si completa sifonando le cellule più grandi nella presa di raccolta come frazione CTC arricchita. Questo metodo è particolarmente sensibile e specifico (rilevamento di circa 1 CTC/mL di sangue intero)14 e può essere associato ad analisi di immunofluorescenza personalizzate (IF). Questi strumenti consentiranno di stabilire una soglia positiva per l'interpretazione clinica. Viene quindi descritto un flusso di lavoro che consente ai biologi di isolare e i CTC immunofenotipi con un alto tasso di recupero e specificità. Il protocollo descrive l'uso ottimale del dispositivo microfluidico a spirale per raccogliere CTC, i saggi IF ottimizzati che possono essere personalizzati in base al tipo di cancro e l'uso di software open source gratuito per la misurazione e l'analisi delle immagini cellulari per eseguire un numerazione delle cellule in base alla colorazione fluorescente. Inoltre, il multiplexing al microscopio può essere effettuato a seconda del numero di filtri/marcatori fluorescenti disponibili.
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Protocol
I campioni sono stati raccolti prospetticamente nell'ambito della coorte CIRCAN ("CIRculating CANcer") con sede presso l'Ospedale Universitario di Lione in seguito al consenso scritto del paziente. Questo studio è stato integrato nella coorte CIRCAN_ALL. Lo studio CIRCAN_ALL è stato riconosciuto come non interventistico dal CPP South-East IV datato 04/11/2015 con il riferimento L15-188. Una versione modificata è stata riconosciuta come non interventista il 20/09/2016 sotto il riferimento L16-160. Lo studio CIRCAN_ALL è stato dichiarato al corrispondente IT e alla libertà dell'Hospice civils de Lyon il 01/12/2015, con il riferimento 15-131. La raccolta del sangue è stata eseguita quando i medici hanno osservato la prima indicazione di progressione del tumore.
NOT: Utilizzare tutti i reagenti e i materiali descritti nella Tabella dei Materiali con le rispettive condizioni di conservazione per la preparazione pre-analitica del campione e il test dell'immunofluorescenza. La sostituzione dei reagenti e/o la modifica delle condizioni di archiviazione potrebbe comportare prestazioni di analisi non ottimali.
1. Decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale
NOT: La decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale è un requisito per rimuovere tutto lo sfondo di immunofluorescenza generato dalla contaminazione batterica, esplorare la citomorfologia dei CTC ed essere in grado di differenziarli dalle normali cellule immunitarie. Il protocollo è ottimizzato per i campioni di sangue raccolti in tubi K2EDTA entro 6 h dopo il campionamento del sangue e arricchito utilizzando il dispositivo microfluidico a spirale in condizioni pulite. L'utilizzo di questo test per altri tipi di campioni (altri fluidi biologici) può richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Questo protocollo di decontaminazione deve essere eseguito una volta alla settimana.
- Preparazione dei reagenti
- Preparazione del buffer diluente
- Sterilizzare 20 mL di reagente additivo diluente utilizzando un filtro di siringa 0,22 m e aggiungere direttamente a 1 L di 1x fosfato buffer salina (PBS) di grado ultra-puro (Tabella dei materiali).
- Sterilizzazione dei reagenti e della paglia di ingresso
- Sterilizzare il buffer di lisi RBC e il buffer di sospensione (RSB; Tabella dei materiali) utilizzando un filtro di siringa da 0,22 m e stoccate in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 mL per ogni soluzione.
- Sterilizzare la paglia di ingresso incubando a temperatura ambiente (RT) per 1 h nel reagente di pulizia per tutti gli usi (Tabella dei materiali). Trasferire la cannuccia all'addetto alla pulizia a base di candeggina (Tabella dei materiali) e incubare a RT per 1 ora.
- Sciacquare la cannuccia di ingresso due volte con PBS sterile per 1 h ciascuno e conservare la cannuccia di ingresso sterilizzata in un sacchetto chirurgicamente sterile (Tabella dei materiali).
- Preparazione del buffer diluente
- Decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale
- Disinfezione con il reagente di pulizia per tutti gli scopi
- Scollegare il tappo della bottiglia diluente dalla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale svitando la vite marrone. Sotto un armadietto di sicurezza microbiologico, trasferire fino a 250 mL di reagente di pulizia per tutti gli scopi (Tabella dei materiali) in una nuova bottiglia vuota.
- Svitare il tappo di bottiglia diluente e la paglia alla bottiglia di 250 mL di reagente di pulizia per tutti gli usi sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Attaccare questa bottiglia alla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale avvitando indietro la vite marrone.
- Trasferire fino a 100 mL di candeggina (1% di concentrazione finale; Tabella dei materiali) al contenitore dei rifiuti fornito nel kit di esecuzione (Figura 1A).
- Caricare una nuova cannuccia di ingresso sterile sul dispositivo microfluidico a spirale (Tabella dei materiali) nella porta di ingresso. Caricare un nuovo tubo di centrifuga di 50 mL nella porta di ingresso. Caricare un nuovo tubo di centrifuga di 50 mL nella porta di uscita.
- Procedere per innescare il dispositivo microfluidico a spirale facendo clic su Prime sul dispositivo microfluidico a spirale (3 min). Rimuovere il tubo di ingresso dopo il completamento del primo.
- Trasferire fino a 15 mL di reagente per la pulizia per tutti gli scopi in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL con una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico e collegare il tubo alla porta di ingresso del dispositivo microfluidico a spirale.
- Prima di iniziare la corsa, verificare che la soluzione sia priva di bolle eccessive. Se sono presenti bolle, rimuoverle per aspirazione lenta con una pipetta.
- Caricare un chip microfluidico di decontaminazione nel dispositivo microfluidico a spirale. Eseguire un programma 3 sul dispositivo microfluidico a spirale facendo clic su Esegui e selezionando il programma 3 (31 min).
NOTA: il programma 3 del dispositivo microfluidico a spirale consente un rapido arricchimento dei CTC in 31 min. - Continuare con la fase di pulizia del dispositivo microfluidico a spirale utilizzando il volume rimanente del reagente di pulizia per tutti gli scopi nel tubo di ingresso.
- Eliminare il tubo di ingresso dopo il completamento della fase di pulizia, lasciando dietro di sé la cannuccia di ingresso.
- Decontaminazione con l'agente di pulizia a base di candeggina
- Scollegare il tappo della bottiglia di riagiscamento per la pulizia per tutti gli usi dalla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale svitando la vite marrone. Sotto un armadietto di sicurezza microbiologico, trasferire fino a 250 mL di cleaning agent a base di candeggina (Tabella dei materiali) in una nuova bottiglia vuota ( Figura1A).
- Allestire il tappo della bottiglia di risanamento per la pulizia per tutti gli usi e la paglia alla bottiglia contenente l'agente di pulizia a base di candeggina sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Attaccare questa bottiglia alla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale avvitando indietro la vite marrone.
- Trasferire fino a 15 mL di saldatore a base di candeggina in un nuovo tubo di ingresso centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Caricare la posizione di ingresso del tubo di centrifugatura da 50 mL. Caricare un tubo vuoto nella posizione di uscita.
- Prima di elaborare la corsa, verificare che il campione sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle aspirandole lentamente con una pipetta.
- Eseguire il programma 3 facendo clic su Esegui e selezionando il programma 3 (31 min). Dopo la corsa, procedere direttamente alla fase di pulizia utilizzando il volume rimanente dell'agente di pulizia a base di candeggina nel tubo di ingresso.
- Eliminare i tubi di ingresso e di uscita.
- Risciacquare il dispositivo microfluidico a spirale.
- Scollegare il tappo della bottiglia dell'agente di pulizia a candeggina dalla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale svitando la vite marrone. Sotto un armadietto di sicurezza microbiologico, trasferire la paglia dalla bottiglia contenente l'agente di pulizia a base di candeggina alla nuova bottiglia contenente il tampone diluente. Svitare la bottiglia al dispositivo microfluidico a spirale.
- Trasferire fino a 15 mL di acqua sterilizzata (Tabella dei materiali) in un nuovo tubo di ingresso centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Caricare la posizione di ingresso del tubo di centrifugatura da 50 mL. Caricare un tubo vuoto nella posizione di uscita.
- Prima di elaborare la corsa, verificare che il campione sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle aspirandole lentamente con una pipetta.
- Eseguire il programma 3 facendo clic su Esegui e selezionando il programma 3 (31 min). Dopo la corsa, procedere direttamente alla fase di pulizia utilizzando il volume rimanente di acqua sterilizzata nel tubo di ingresso.
- Eliminare i tubi di ingresso e di uscita.
- Disinfezione con il reagente di pulizia per tutti gli scopi
2. Manutenzione per mantenere la spirale microfluidica dispositivo batteri-free
NOT: La manutenzione di routine deve essere eseguita alla fine della giornata durante l'ultima fase di pulizia.
- Trasferire fino a 7 mL di saldatore a base di candeggina nel nuovo tubo centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Al vite il tubo di pulizia a base di candeggina nella porta di ingresso del dispositivo microfluidico a spirale.
- Prima di elaborare la corsa pulita, verificare che il campione di ingresso sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle aspirandole lentamente con una pipetta.
- Eseguire il pulito sul dispositivo microfluidico a spirale.
3. Arricchimento pre-analitico del CTC da campioni di sangue del paziente
- Raccogliere 7,5 mL di sangue nel tubo K2EDTA e tenere sotto agitazione delicata per evitare la sedimentazione cellulare e la coagulazione. Processo entro 6 ore.
NOT: Se il sangue viene raccolto in un tubo di raccolta del sangue del DNA privo di cellule contenente conservanti, conservare a 4 gradi centigradi fino all'elaborazione. Assicurarsi che il campione di sangue, il buffer di lisi RBC e il buffer RBS siano in RT prima di procedere con la fase di arricchimento. - Trasferire fino a 7,5 mL di sangue intero in un nuovo tubo di ingresso per centrifugare da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico.
- Centrifuga a 1.600 x g per 10 min a RT. Raccogliere la frazione di plasma con una pipetta senza disturbare il cappotto buffy. Sostituire la frazione plasma con l'aggiunta di volume direttamente equivalente di PBS fino a 7,5 mL.
- Aggiungere delicatamente il buffer di lisi RBC (Tabella dei materiali) al campione di sangue a un volume finale di 30 mL (per un tubo K2EDTA) o 37,5 mL (per un tubo di raccolta del sangue di DNA privo di cellule). Invertire delicatamente il tubo di raccolta del sangue 10x e incubare per 10 min a RT.
NOT: Il campione di sangue diventa rosso più scuro durante la lisi RBC. Se non si osserva alcun cambiamento (dal rosso scuro e opaco) dopo 10 min, invertire delicatamente il tubo 3x e lasciare riposare per altri 5 min massimo. Non lasciare il campione nel buffer di lisi RBC per più di 15 min perché può compromettere la qualità del campione e le prestazioni di analisi. - Centrifugare il campione di sangue lisminato a 500 x g per 10 min a RT, con freni centrifugati (o velocità di decelerazione più alta). Utilizzare una pipetta Pasteur o una pipetta sierologica per rimuovere delicatamente il supernatante fino a quando il volume non raggiunge il segno di 4-5 mL. Quindi, utilizzare punte micropipette filtrate per rimuovere il rimanente super-natante.
- Utilizzando una micropipetta P1000 con una punta filtrata, aggiungere 1,0 mL di RSB alla parete del tubo di ingresso della centrifuga da 50 mL. Per evitare di introdurre bolle nel mix, risospendere il pellet cellulare pipetting su e giù fino a quando il campione è omogeneo.
- Aggiungere altri 3 mL di RSB alla parete del tubo di ingresso della centrifuga 50 mL (volume totale 4 mL). Evitare di introdurre bolle nel mix. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare pipettando su e giù.
NOT: Nell'improbabile caso in cui la pipettatura regolare non sia in grado di abbattere i grumi delle cellule (definiti dalla visibilità o dal blocco della punta della pipetta), filtrare il campione attraverso un colino a 40 celle per rimuovere eventuali grumi. Aggiungere 150 L di RSB al campione per compensare la perdita di volume dovuta al filtraggio. Si noti che questo metodo deve essere utilizzato con parsimonia e solo quando si osservano grumi di grandi dimensioni. - Prima di procedere alla fase di arricchimento, verificare che il campione sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle e fare attenzione a non scartare alcun campione. Se sono presenti piccole bolle, la loro rimozione non è necessaria.
- Elaborare il campione sul dispositivo microfluidico a spirale.
4. Arricchimento dei CTC dal sangue intero del paziente con il dispositivo microfluidico a spirale
- Caricare un nuovo chip microfluidico a spirale. Caricare due tubi di centrifuga vuoti da 50 mL nelle porte di ingresso e di uscita.
- Eseguire un numero primo facendo clic su Prime sul dispositivo microfluidico a spirale (3 min). Rimuovere i tubi di ingresso e di uscita e caricare il campione da elaborare nella porta di ingresso.
- Caricare un tubo conico da 15 mL chiaro nella porta di uscita per raccogliere CTC arricchiti.
- Scaricare il tubo di uscita e centrifugare a 500 x g per 10 min (accelerazione: 9; decelerazione: 5). Con una pipetta sierologica da 5 mL, rimuovere l'arresto supernatale al punto 2 mL sul tubo conico 15 mL. Con una micropipetta, rimuovere il supernatante fermandosi a 100. Elaborare direttamente il campione arricchito per l'colorazione dell'immunofluorescenza.
5. Immunofluorescenza Colorazione
- Enumerare su una diapositiva a camera con una griglia di tipo emocitometro il numero di celle per mL. Diluire il campione arricchito con una soluzione anti-rilegatura dello 0,2% (Tabella dei materiali) a una concentrazione che raggiunge le 100.000 cellule/100 l per citospin.
- Inumidire il contorno della camera campione utilizzando cotone (Table of Materials) con una soluzione anti-legante di 50 -L dello 0,2%. Mettere uno scivolo di vetro di polisina nella camera campione e chiudere.
- Coprire una punta con una soluzione anti-legante dello 0,2% pipettando su e giù 3x. Risospendere il campione arricchito e trasferire la soluzione cellulare nella camera campione. Centrifuga con una centrifuga dedicata (Tabella dei materiali) a 400 rpm per 4 min (accelerazione bassa).
- Posizionare un isolatore di silicio intorno all'area di deposizione. Lasciare asciugare il vetrine di vetro sotto un armadietto di sicurezza microbiologico per 2 min.
- Preparare la soluzione di fissazione diluindo 1 mL di 16% paraformaldeide (PFA) con 3 mL di PBS sterile. Aggiungere 100 l di soluzione di fissazione (4% PFA) per campione e incubare a RT per 10 min. Rimuovere la soluzione di fissaggio ed eseguire tre lavature con 200 l di PBS e incubare a RT ciascuno per 2 min.
ATTENZIONE: Utilizzare pFA sotto un armadietto di sicurezza chimica per prevenire l'inalazione. - Preparare la soluzione di saturazione diluindo il siero bovino fetale (FBS) al 5%, il reagente di blocco del recettore Fc (FcR) al 5% e l'albumina del siero bovino (BSA) all'1% in PBS sterile (Tabella dei materiali). Aggiungere 100 l di soluzione di saturazione per campione e incubare per 30 min a RT. Rimuovere la soluzione di saturazione.
- Aggiungere 100 l di soluzione anticorpale per campione (anticorpo CD45 1/20; Anticorpo PanCK 1/500; PD-L1 anticorpo 1/200; Soluzione di saturazione Qsp 100 - L) (Tabella dei materiali). Collocare la vetrata di polisina in una parabola Petri da 100 mm x 15 mm. Inumidire una carta assorbente con 2 mL di acqua sterile e chiudere la piastra Petri con il coperchio. Collocare a 4 gradi centigradi e proteggere dalla luce.
- Rimuovere la miscela di anticorpi ed eseguire 3 lavaggi con 200 l di PBS incubando ogni lavaggio per 2 min. Lasciare asciugare il campione per 5 min e proteggerlo dalla luce. Collocare 10 - L di soluzione di montaggio (Table of Materials) nell'area di deposizione e coprire con un coperchio del microscopio senza fare una bolla. Sigillare la coverslip con smalto.
6. Acquisizione di immagini immunofluorescenti con microscopio fluorescente lineare e software associato
- Utilizzare un microscopio fluorescente dritto con una piattaforma motorizzata X/Y. Utilizzare un obiettivo di 20 volte per scattare immagini tiff RGB a 8 bit in quattro canali corrispondenti a coloranti DNA (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), tintura PanCK (fluorescein isothiocyanate [FITC]), tintura PD-L1 (CY3) e colorante CD45 (CY5). Accendere la lampada al mercurio 15 min prima dell'uso e adattare il microscopio e il software associato alle riprese semi-automate.
- Posizionare lo scivolo in vetro sulla piattaforma.
- Nel menu acquisizione, definire i quattro canali e impostare il tempo di esposizione (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1.000 ms). Definire le tessere da scansionare. Fare clic su Riquadri. In Esperimento avanzato, definire l'area da scansionare.
- Regolare la messa a fuoco sullo schermo. Fare clic su Avvia esperimento.
- Esportare i file TIF di ogni canale e denominare in modo specifico il file di immagine con queste informazioni: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (ad esempio, Sample1_TR1_c1m01). Nome dye come segue: il canale DAPI è c1, canale FITC è c2, canale CY3 è c3 e canale CY5 è c4.
7. Analisi delle immagini immunofluorescenti con il software di analisi delle immagini
- Scaricare e installare il software di analisi delle immagini gratuito dal sito Web Broad Institute. Accettare tutte le impostazioni predefinite durante l'installazione. Aprire il software di analisi delle immagini e fare clic su File Pipeline da file Analysis_4channels_CTC.cppipe.
NOT: La pipeline converte le immagini a colori RGB in scala di grigi, rimuove gli artefatti levigando le immagini con un filtro mediano, identifica i nuclei e il citoplasma, quantifica le intensità di fluorescenza di ogni canale e le esporta in un file Excel. - Eliminare i file nell'elenco dei file. Aggiornare i metadati per raggruppare i file in base ai riquadri.
NOT: Tutte le istruzioni per raggruppare le immagini sono specificate nel software. I file dei nomi visualizzati nel modulo NamesAndTypes e i file vengono raggruppati in base al numero di riquadri e canali per esempi. - Fare clic su Visualizza impostazioni output e specificare un output predefinito corretto. Fare clic su Analizza immagini. Aprire il file del foglio di calcolo corrispondente ai parametri measure_intensity.
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Representative Results
Il primo prerequisito era quello di ottenere raccolte incontaminate (senza agenti infettive) di CTC per la coltura dei tessuti ed evitare il background IF generato. Il protocollo di decontaminazione ha permesso la pulizia di tutti i tubi e pompe, e ha portato alla raccolta di CTC con un buon tasso di recupero senza contaminazione batterica. I campioni arricchiti sono stati confrontati senza e con il flusso di lavoro del protocollo di decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale. Per convalidare il protocollo di decontaminazione, la linea cellulare A549 è stata utilizzata in assenza di sangue intero e arricchita direttamente utilizzando il dispositivo microfluidico a spirale. Senza il protocollo di decontaminazione ottimizzato, è stata osservata un'elevata contaminazione batterica nella coltura tissutale della linea cellulare A549 arricchita dopo solo 24 ore, che ha causato la morte e i cambiamenti citomorfologici nelle cellule eucariotiche (Figura 1B).
Al contrario, dopo il protocollo di pulizia, le cellule A549 viventi sono state ottenute crescendo in coltura 2D dopo 10 h di coltura tissutale e rimozione dei supporti e in condizioni 3D (Figura 1B), così come campioni di pazienti (Figura 1C). I potenziali CTC sono identificati con una croce rossa (Figura 1C).
La figura 2 riassume il flusso di lavoro completo per la fenotipizzazione dell'immunofluorescenza dei CTC arricchiti da tutto il sangue. È composto da quattro passaggi principali: campionamento del sangue intero, arricchimento CTC, analisi dell'immunofluorescenza (IF) e analisi delle immagini utilizzando il software. In precedenza, il tasso di recupero del dispositivo microfluidico a spirale è stato affrontato14. Utilizzando ctC mimatolariflui (mCTC), questo tasso di recupero è stato stabilito a 1,3 CTC/mL di sangue intero14.
Il lavoro attuale si è concentrato sull'impostazione delle condizioni ottimali per l'analisi IF dei CTC arricchiti e della visualizzazione a valle (Figura2). In primo luogo, per testare la specificità dell'anticorpo PD-L1, sono state utilizzate due linee cellulari: (1) linea cellulare ad alto positivo-PD-L1 PC3 e (2) linea cellulare low-positive-PD-L1. Le cellule sono state poi arricchite con il dispositivo microfluidico a spirale e analizzate dalla IF. Tutte le cellule sono state macchiate con il marcatore tumorale anti-PanCK, marcatore anti-CD45 dei globuli bianchi, anti-PD-L1 (utile nel cancro del polmone), e DAPI (colorante nucleare). I globuli bianchi sono stati identificati come positivi per DAPI e CD45, mentre le cellule tumorali sono state identificate come positive per DAPI e PanCK e negative per CD45. La linea cellulare PC3 high-PD-L1-positive è stata macchiata positivamente per PD-L1, mentre è stata rilevata un'espressione PD-L1 inferiore nella linea cellulare SW620 low-PD-L1-negative.
Quindi, sono stati confrontati i seguenti: l'espressione di colorazione SE liquida (i) , (ii) colorazione delle CTC depositate direttamente su vetrini rivestiti in polilisina e (iii) colorazione IF dei CTC dopo citospin su vetrini rivestiti di polilisina. È stato chiaramente osservato che il tasso di recupero delle CTC dipendeva dal tipo di protocollo utilizzato (Figura 3A). Nel saggio di colorazione SE liquido, il tasso di recupero era solo il 10% per il numero di mCTC chiodati era il più basso. Questo basso tasso di recupero presenta un problema per la maggior parte dei pazienti con NSCLC metastatico, in quanto limita significativamente la capacità di questi test di isolare i pochi CTC e fornire informazioni fenotipiche. La seconda e la terza sezione descritte (deposizione diretta di mCTC o CTC su vetrini rivestiti in polilisina senza e con citopsina) avevano sistematicamente tassi di recupero superiori al 60% (Figura 3A).
Figura 3 B mostra immagini rappresentative di questi saggi IF utilizzando campioni interi di sangue dello stesso paziente, utilizzando l'analisi di colorazione SE liquida o l'analisi di colorazione IF su vetrini rivestiti di polilisina con citospin. L'enumerazione dei nuclei era chiaramente diversa tra i due saggi (Figura 3B). La colorazione DAPI nucleare ha fornito l'enumerazione delle cellule totali nel campione e la colorazione del biomarcatore ha permesso di evidenziare il verde delle cellule PanCK-positive, arancione nelle cellule PD-L1-positive e rosso nelle celle bianche residue CD45 (Figura3 B).
Successivamente, per differenziare citologicamente i globuli bianchi dalle cellule tumorali, la forma del nucleo deve essere visualizzata, poiché è caratteristica del tipo di cellula. Figura 3 C dimostra i contorni dei nuclei sfocati e morfologia che è insolito in assenza del passo citospino. Il protocollo ottimizzato includeva quindi il citostratura di CTC arricchiti su vetrini rivestiti in polilisina, seguiti dalla fissazione del 4% di paraformaldeide (PFA), per la conservazione dei vetrini prima della colorazione IF. Questo protocollo ottimizzato aveva tassi di recupero simili a quelli della deposizione di mCTC direttamente su diapositive rivestite in polilisina (Figura 3A), anche quando sono state aggiunte pochissime celle. Poiché questo ulteriore passo consente la conservazione della morfologia nucleare (Figura 3C), i granulociti sono stati identificati con i loro nuclei multi-lobed, così come le cellule tumorali (etichettate con una croce rossa nel nucleo) con il loro nucleare anomalie, modelli di malignità e dimensioni maggiori rispetto ai globuli bianchi.
Dopo l'ottimizzazione del protocollo IF, è stato condotto un proof-of-concept utilizzando tutto il sangue da pazienti metastatici. I campioni sono stati raccolti prospetticamente nell'ambito della coorte di routine CIRCAN con sede presso l'Ospedale Universitario di Lione. La raccolta del sangue è stata di solito eseguita quando i medici hanno osservato la prima indicazione di progressione del tumore. Tutti i casi di tumore sono stati istologicamente o citologicamente confermati sui campioni di biopsia FFPE durante la diagnosi iniziale. In questo caso, le analisi CTC in fase di progressione sono state eseguite da ricercatori che non hanno avuto accesso o conoscenze preliminari dei dati clinici. Sono state pubblicate in precedenza15considerazioni preanalitiche dettagliate.
Nella Figura 4, tabella 1e Tabella 2, sono presentati diversi risultati da campioni di pazienti. Il profilo CD45('), PanCK(-), PD-L1(-) rappresenta le cellule immunitarie. Il conteggio residuo dei globuli bianchi è stato indicato per essere fortemente variabile e dipendente dall'intero campione di sangue. L'intervallo in questa piccola coorte pilota era di 648-11.000 cellule bianche CD45 (-minuscole) (Figura 5A). Di conseguenza, immediatamente dopo l'arricchimento del CTC, è stata inclusa un'enumerazione delle cellule raccolte per regolare la densità cellulare sull'area del citospin ad una densità di 100.000 cellule/citospin (vedi sezione 6). Ciò ha permesso di ottenere prestazioni di diversi citospin per paziente e l'ottimizzazione dell'osservazione microscopica per l'enumerazione manuale e l'uso della pipeline software di analisi delle immagini.
Nella figura 4A-C, tabella 1e tabella 2, sono riportati casi tipici in cui i conteggi dei globuli bianchi residui erano molto diversi:
(i) Il primo profilo è il CD45(-), il PanCK e il PD-L1, presentati nella Figura 4A . Spesso la dimensione delle cellule è superiore a 13 m di diametro e la morfologia del nucleo è irregolare, rappresentando un modello citomorfologico di malignità. Questa popolazione è probabilmente composta da CTC.
(ii) Il secondo profilo è IL CD45(-), il PanCK(-), e il PD-L1().'). Come già riportato, non tutti i CTC esprimono il biomarcatore PanCK (Figura 4A).
(iii) Il terzo profilo è il CD45(-), il PanCK e il PD-L1(-). Come già riportato, non tutti i CTC esprimono il biomarcatore PD-L1.
(iv) Il quarto profilo è il CD45, il PanCK e il PD-L1, presentati nella Figura 4B. Rappresenta le cellule immunitarie atipiche attivate nel sangue intero del paziente. Questa popolazione è stata descritta in diverse pubblicazioni16,17,18 e rappresenta circa il 5% delle cellule totali dopo l'arricchimento. La presenza di questa popolazione può aumentare il tasso di falsi CTC positivi in un campione se l'intensità del segnale CD45 è troppo bassa e la morfologia del nucleo non è ben conservata. Ciò evidenzia fortemente la necessità di effettuare una colorazione complementare dei biomarcatori tumorali, come Vimentin e/o Epcam in questo test di immunofluorescenza.
(v) Infine, l'ultimo profilo include le celle senza etichetta CD45(-), PanCK(-)e PD-L1(-), evidenziate nella Figura 4C. Il nucleo in questa popolazione mostra spesso modelli citomorfologici di malignità, e la dimensione è di oltre 13 m di diametro. La percentuale di queste cellule nei campioni è altamente variabile in base al sangue intero del paziente. Questo mette in evidenza la necessità di utilizzare biomarcatori tumorali complementari per confermare il modello tumorale di questa sottopopolazione cellulare.
Nella Tabella 1 e nella Tabella 2, il numero di cellule di 16 campioni è stato riportato da pazienti NSCLC metastatici avanzati. Le cellule sono state classificate in base all'espressione dei biomarcatori. Alta variabilità è stata osservata nelle sottopopolazioni ottenute. Come già riportato negli studi indipendenti, nella maggior parte dei campioni sono stati trovati i profili CD45(-), PanCK() e PD-L1. Tuttavia, poiché la popolazione CTC è altamente eterogenea, i campioni di pazienti contenevano anche CD45(, PanCK(-)) e PD-L1() sottopopolazioni, le sottopopolazioni CD45(-), PanCK() e PD-L1(-) e le cellule senza etichetta CD45(-), PanCK e PD-L1 (-), sottopopolazioni. Il livello dei globuli bianchi residui era altamente variabile tra i campioni analizzati.
Per facilitare l'enumerazione cellulare, è stata istituita una pipeline pilota utilizzando il software di analisi delle immagini per un'analisi automatizzata delle immagini di immunofluorescenza. Il flusso di lavoro è descritto nella Figura 5. In questo caso, è importante acquisire immagini di immunofluorescenza di alta qualità in termini di contrasto e intensità di fluorescenza. A seconda della capacità di calcolo del cluster dell'hardware, la pipeline di analisi delle immagini può essere applicata all'immagine risultante e fusa del citospin o in un'area rappresentativa del citospin.
Qui, in base al microscopio, una scansione semi-automatica dell'area citospin (X/Y; la messa a fuoco z non è inclusa) ha generato 150-200 immagini unite. Queste immagini possono essere unite e analizzate direttamente utilizzando la pipeline di analisi delle immagini. Tuttavia, questa procedura è basata su risorse di tempo e di calcolo, una limitazione importante per il suo uso di routine nei laboratori. Pertanto, sulla base di precedenti esperienze nel campo dell'ematologia cellulare, si è deciso di analizzare le aree rappresentative di ogni campione dopo aver verificato al microscopio che la distribuzione delle cellule era omogenea su tutta l'area del citospin. Quindi, il 25% dell'area totale del citospin (circa 40 piastrelle) è stato scansionato con il microscopio a florescenza per generare 40 x 4 immagini indipendenti. Il file unito è stato diviso per canali, e file di immagine sono stati generati automaticamente con il software al microscopio (vedi sezione 7; Figura 5 A). Questi file sono stati importati in una pipeline di analisi delle immagini per l'analisi in base ai parametri descritti (vedere la sezione 8; Figura 5 A).
Nella Figura 5B, è stata identificata manualmente un'immagine rappresentativa che mostra quattro CCT [CD45(-), PanCK( ) e PD-L1( ) tra 77 celle immunitarie [CD45('), PanCK e PD-L1(-)]. Figura 5 B illustra come il software di analisi delle immagini ha identificato ed enumerato il numero di celle in base alla colorazione DAPI. Viene inoltre illustrato il modo in cui il software di analisi delle immagini ha contato gli oggetti secondari. Infine, sono state riportate intensità di fluorescenza per ogni canale fluorescente per tutti gli oggetti riportati nelle immagini.
Lo sfondo è stato calcolato e rappresentato dalle celle negative presenti nel campione. Ad esempio, le cellule immunitarie non attivate hanno bassa intensità di fluorescenza e hanno permesso la misurazione dello sfondo della colorazione PanCK e PD-L1. Il segnale fluorescente è stato ritenuto positivo se l'intensità della fluorescenza superava quella dello sfondo di due volte (basata sull'analisi di quattro campioni di pazienti indipendenti). Per quanto riguarda la colorazione CD45, poiché il livello di espressione di CD45 è altamente variabile nelle sottopopolazioni dei globuli bianchi, la soglia di positività è stata fissata il più basso possibile. Si basava sull'analisi di immagini di 10 sangue intero sano macchiato con l'anticorpo CD45. L'analisi pilota (n n - 4) ha mostrato la concordanza tra l'enumerazione manuale e l'enumerazione del software di analisi delle immagini (tabella 2). Ogni cella sul citospin è identificata da un software di analisi delle immagini e consente ai biologi di tracciare la cellula e confermare manualmente i risultati, se necessario.
Figura 1 : Panoramica del flusso di lavoro per la decontaminazione dispositivo microfluidico a spirale strumento. (A) Tre fasi principali incluse nel processo di decontaminazione (cfr. protocollo), che illustrano la localizzazione dell'input e delle uscite dello strumento. (B) Immagini rappresentative dell'arricchimento della linea cellulare A549 prima e dopo la decontaminazione dello strumento. Viene mostrato l'impatto della presenza di un agente infettivo sulla vitalità e la morfologia delle cellule raccolte. In presenza di batteri, la morfologia cellulare e la vitalità sono state modificate. Barra di scala - 20 colture cellulari 3Ddicampioni arricchiti di cancro al polmone, alla prostata e al seno. La croce rossa corrisponde alle cellule atipiche. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Panoramica del flusso di lavoro dell'analisi dell'immunofluorescenza dal campionamento del sangue intero all'analisi delle immagini della fluorescenza. I passaggi principali sono mostrati come segue: raccolta del sangue per il sangue intero, raccolta CTC con dispositivo microfluidico a spirale, analisi immunofluorescenza e software di analisi delle immagini. La scelta del biomarcatore è stata guidata da una migliore identificazione delle varie popolazioni di cellule osservabili sul vetrino citospin (CD45 per le cellule immunitarie, PanCK e PD-L1 per le cellule tumorali polmonari). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : tasso di recupero di tre protocolli di colorazione indipendenti. (A) Confronto del tasso di recupero delle MCT dalle macchie liquide, della colorazione diretta delle cellule depositate su vetrini rivestiti in polilisina e della colorazione cellulare dopo la citogira su vetrini rivestiti in polilisina. (B) Immagini rappresentative dei campioni di pazienti elaborati dal protocollo SE liquido e dal protocollo di immunostaining diretto con il citospinstep. Le cellule sono state macchiate con anticorpo monoclonale CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647; Anticorpo monoclonale PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Barra di scala - 20 m. (C) Immagini rappresentative della colorazione DAPI dell'arricchimento cellulare con e senza il gradino citospin. La morfologia e le dimensioni dei nuclei sono state mostrate utilizzando la colorazione DAPI. La croce rossa evidenzia le cellule con anomalie nel nucleo nell'immagine a destra. Nell'immagine a sinistra, l'immagine è sfocata, poiché le celle non sono allo stesso livello (asse x, y e z). Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Identificazione dei profili di cella. (A) Immagini rappresentative di pazienti con diversi profili CTC. I canali di fluorescenza sono presentati separatamente. Le immagini unite vengono visualizzate a sinistra. Essi sono macchiati con CD45 anticorpo monoclonale (clone HI30) Alexa Fluor 647; Anticorpo monoclonale PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; DeDA-1 phycoerythrin PDL-1; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); le frecce puntano a celle atipiche. (B) Immagini rappresentative dell'immunostaining di due campioni di pazienti con profili atipici dei globuli bianchi. Le cellule sono state macchiate con anticorpo monoclonale CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647; Anticorpo monoclonale PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; DeDA-1 phycoerythrin PDL-1; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). L'immagine evidenzia la presenza di cellule immunitarie macchiate con CD45( , PanCK () e PD-L1). (C) L'immagine evidenzia la presenza di celle senza etichetta (CD45(-), PanCK(-)) e PD-L1(-). Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Panoramica dell'analisi delle immagini fluorescenti. (A) Vengono descritti i passaggi principali: la scansione microscopia, il canale diviso in base alla fluorescenza e l'importazione di file nel software di analisi delle immagini. (B) Descrizione dei tre diversi passaggi per il flusso di lavoro del software di analisi delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Enumerazione manuale dell'arricchimento delle cellule del paziente. Enumerazione delle cellule in base alla colorazione DAPI. Enumerazione di altri oggetti basati sulla colorazione FITC, PE e CY5.
Tabella 2: Software di analisi delle immagini enumerazione dell'arricchimento delle cellule del paziente . Enumerazione delle cellule in base alla colorazione DAPI. Enumerazione di altri oggetti basati sulla colorazione FITC, PE e CY5. Confronto tra conteggio manuale e enumerazione software di analisi delle immagini.
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Discussion
Nel presente studio sono stati sollevati due punti principali, il primo per quanto riguarda l'esecuzione del flusso di lavoro per il suo trasferimento ad applicazioni cliniche e il secondo relativo alla diminuzione della soggettività per l'analisi delle immagini a fluorescenza ottenute.
Un flusso di lavoro performante e ottimizzato per l'enumerazione CTC è stato inizialmente determinato utilizzando un saggio IF personalizzabile dopo l'arricchimento delle celle tramite un sistema microfluidico CTC privo di etichette (dispositivo microfluidico a spirale). Utilizzando questo flusso di lavoro, uno studio pilota ha confermato che tutti i campioni di pazienti con NSCLC metastatico contenevano cellule atipiche, che erano tutte CD45(-). In alternativa possono essere etichettati con biomarcatori PanCK e/o PD-L1; tuttavia, possono anche essere completamente negativi per tutti i biomarcatori testati [CD45(-), PanCK(-), e PD-L1(-), come osservato nel campione S19 (tabella 2)]. Ciò evidenzia fortemente la necessità di ulteriori biomarcatori per la fenotipizzazione delle sottopopolazioni CTC. Di conseguenza, è stato proposto di aggiungere biomarcatori epiteliali-mesenchymal come EpCAM, Vimentin e N-Cadherin; marcatori di cellule staminali tumorali tra cui CD44 e CD133; e marcatori tumorali specifici tra cui TTF1 per adenocarcinoma polmonare.
Nello studio pilota, la gamma di cellule atipiche era [40; >400] da 3,5 mL di sangue intero. Per l'80% dei campioni di pazienti, il numero di cellule atipiche era superiore a 50. Infatti, in citologica19,20,21 campioni da Endo Bronchial Ultra Sonic Guide Trans Bronchial Needle Aspiration o CT-guidato forature trans-toraciche, l'analisi PD-L1 è adatta nella maggior parte dei campioni, ma un soglia di 100 cellule tumorali è comunemente ammesso per produrre un'interpretazione statistica e clinica del valore. Tuttavia, nel caso particolare dei CTC di sangue, va notato che il problema dell'eterogeneità del tumore spaziale viene bypassato in contrasto con piccoli campioni di tumore in loco.
Il secondo punto è stato quello di evitare l'impatto del gestore sull'analisi delle immagini di immunofluorescenza. È stato quindi creato un software di analisi delle immagini fluorescenti per standardizzare l'enumerazione cellulare e fornire dati statistici per questi campioni. Questo processo automatizzato ha evidenziato la necessità di potenti cluster di calcolo per l'analisi di tutte le celle contenute nello stesso campione. Inoltre, la qualità della colorazione IF deve essere sullo stesso piano (per evitare l'uso di sistemi confocali) e la densità delle cellule sul citospin deve essere calibrata per consentire al software di analisi delle immagini di riconoscere tutte le celle separatamente sulla diapositiva. Infine, i risultati non sono stati convalidati per quanto riguarda gli esiti clinici in una coorte di pazienti, ma questo punto dovrebbe essere affrontato in un altro studio dedicato.
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Disclosures
Jean-Philippe Aurel e Kathryn Weiqi Li sono dipendenti della società Biolidics che produce strumenti utilizzati in questo articolo. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni per la ricerca di Astra-eneca (Londra, Regno Unito), Biolidics (Singapore) e della Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Francia). Gli autori ringraziano le aziende di Astra-eneca e Biolidics per il loro sostegno finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
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