Summary
Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.
Abstract
Primer tümörden elde edilen dolaşımdaki tümör hücreleri (CtCs) kan dolaşımına veya lenfatik sisteme dökülür. Bu nadir hücreler (mL başına kan başına 1−10 hücre) kötü bir prognoz garanti ve çeşitli kanserlerde kısa genel sağkalım ile ilişkilidir (örneğin, meme, prostat ve kolorektal). Şu anda, anti-EpCAM kaplı manyetik boncuk tabanlı CTC yakalama sistemi kan dolaşımında CTC'ler sayısaliçin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan altın standart testtir. Bu test, özellikle epitel kanseri hücrelerini hedef leyen anti-EpCAM belirteçleri ile kaplanmış manyetik boncukların kullanımına dayanmaktadır. Birçok çalışma EpCAM CTC tespiti için en uygun belirteç olmadığını gösterdi. Gerçekten de, CtCs kanser hücrelerinin heterojen bir alt popülasyon ve metastatik proliferasyon ve invazyon ile ilişkili bir epitelyal-mesenkimal geçiş (EMT) geçmesi edebiliyoruz. Bu CtCs hücre yüzeyi epitel marker EpCAM ifadesini azaltmak mümkün, vimentin gibi mezenkimal belirteçleri artırırken. Bu teknik engeli gidermek için, CTC'lerin fiziksel özelliklerine dayalı diğer izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Mikroakışkan teknolojiler, tam kan örneklerinden CTC zenginleştirme için etiketsiz bir yaklaşım sağlar. Spiral mikroakışkan teknolojisi, spiral mikroakışkan çip içinde oluşturulan kavisli kanallarda sürekli akış ile atalet ve Dean sürükleme kuvvetleri kullanır. Hücreler normal kan hücreleri ve tümöral hücreler arasındaki boyut ve plastisite farklılıklarına göre ayrılır. Bu protokol, ctcs programlanmış ölüm-ligand 1 (PD-L1) ekspresyonu karakterize etmek için farklı adımları ayrıntıları, özelleştirilebilir immünoreskence ile spiral mikroakışkan cihaz birleştirerek (IF) marker seti.
Introduction
Tümör antijene özgü sitotoksik T-lenfositler (CtLs) kanser "bağışıklık gözetimi" olarak bilinen bir süreç yoluyla kanserlere yanıt önemli bir rol oynamaktadır. Anti-tümör fonksiyonları, CTLA-4 inhibitörleri ve PD-1/PD-L1 inhibitörleri gibi immün kontrol noktası blokantikorları ile geliştirilmiştir. Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 tedavileri, PD-L1 negatif tümörlü hastalarda %0-17, PD-L1'i ifade eden hastalarda ise %36-100 arasında değişen yanıt oranlarıile sonuçlanır. Melanom ve NSCLC'de gözlenen PD-1/PD-L1 ablukasına verilen sağlam yanıtlar, genel yanıt oranının (RR), dayanıklı klinik faydalar ve progresyonsuz sağkalım (PFS) kanıtları ile gösterilmiştir. Şu anda, anti-PD1 tedavileri pd-L1 ekspresyonu ne olursa olsun nivolumab ile ikinci basamak NSCLC tedavisinde bakım standardı ve PD-L1 ≥1 ifade eden hastalarda pembrolizumab ile. Birinci basamak tedavide, pd-L1 ≥50' yi ifade eden NSCLC'li hastalarda tek başına pembrolizumab bakım standardıdır ve potansiyel olarak kemoterapi ile geliştirilebilir (histolojik alt tipe bağlı olarak platin ve doublet ilaç)1,2.
Ancak, hasta yönetimine böyle bir yaklaşım tartışmalıdır3, immünohistokimya ile tümör hücrelerinde PD-L1 ekspresyonu beri (IHC) muhtemelen en ideal eşlik biyomarker değildir. Tümör mutasyon yükü4 (TMB), mikrouydu instabilitesi (MSI) ve/veya mikrobiyota gibi diğerleri bu ortamda muhtemelen tek başına veya birlikte ilginçtir. NSCLC heterojen tümörler olduğu bilinmektedir, ya mekansal (bir tümör sitesinden diğerine) ya da zamansal (tanıdan nüksiçin). NSCLC'li hastalar genellikle kırılgandır ve yinelemeli invaziv doku biyopsileri sorun olabilir. Nitekim seriye bağlı olarak ilk progresyonda rebiyopsi oranı %46-84 arasında, başarılı re-biyopsi (histolojik ve tam moleküler analiz ile anlam) %33-75 arasında değişmektedir. Bu, hastaların %25-67'sinin ilk progresyon sırasında kapsamlı bir rebiyopsi analizi alamadığı anlamına gelir5,6,7,8.
"Sıvı biyopsiler"in ortaya çıkışı, bu ortamda önemli bir heyecan yaratmıştır, çünkü dolaşımdan elde edilen serbest DNA'yı (cfDNA) inceleyerek hastalığın ilerlemesi sırasında moleküler değişikliklerin önemli ölçüde yeniden değerlendirilmesini sağlar. tümör hücreleri (CtCs). Bu canlı hücreler tümörden kan dolaşımına salınır ve serbestçe dolaşır. Rutin olarak kullanılmamasına rağmen, akciğer kanserinde moleküler ve phenotipik karakterizasyon, prognoz ve tahmine dayalı önemi (DNAseq, RNAseq, miRNA ve protein analiziyoluyla) açısından KTK'ların analizi son derece umut verici görünmaktadır. Gerçekten de, KTK'lar büyük olasılıkla ilk belirteçler yerine aktif hastalığın hevit özellikleri barındırır (tanı da doku biyopsileri üzerinde saptanmıştır). Ayrıca, CtCs tümör dokusunun mekansal heterojenite sorunu atlamak, hangi küçük biyopsiler önemli bir sorun olabilir. Sonuç olarak, CTCs pd-L1 ekspresyonu potansiyel tümör dokusu kullanarak bir tahmine dayalı biyomarker olarak kullanımından kaynaklanan tutarsızlıklar ışık tutabilir.
Son zamanlarda, PD-L1 ekspresyonu NSCLC'nin CTC'lerinde test edilmiştir. Test edilen hastaların hemen hemen hepsi 9'u PD-L1 pozitifti, bu da sonucun yorumlanmasını ve klinik kullanımını karmaşık hale getiriyordu. Genel olarak, PD-L1-pozitif KTK'lar ortalama 4,5 hücre/mL10'danalınan örneklerin %69.4'ünde saptandı. Radyasyon tedavisinin başlamasından sonra, PD-L1-pozitif KTC'lerin oranı önemli ölçüde artarak, radyasyona yanıt olarak PD-L1 ekspresyonunun yükseltilmesine işaret eder11. Bu nedenle, PD-L1 CtCs analizi tümör ve bağışıklık yanıtı dinamik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir, hangi kemoterapi yanıtı yansıtabilir, radyasyon, ve olası immünoterapi (BT) tedaviler.
Bugüne kadar, CTCs izolasyon ve PD-L1 karakterizasyonu anti-EpCAM kaplı manyetik boncuk tabanlı CTC yakalama, zenginleştirme-ücretsiz tabanlı tahlil ve boyut tabanlı12,13 CTC yakalama tahlilleri gibi çeşitli yöntemlere dayanır. Ancak metastatik NSCLC'li hastaların sadece %45-65'inde KTK saptandı ve böylece metastatik NSCLC hastalarının yarısından fazlası için herhangi bir bilgi verme yetenekleri sınırlandı. Buna ek olarak, ctc sayısı boyut tabanlı yaklaşım10kullanarak bu çalışmaların çoğunda düşüktü. Ayrıca bu yöntem sağlıklı donörlerin kan dolaşımında "malignitenin sitomorfolojik paternleri" ile CD45(-)/DAPI(+) hücrelerinin saptanması gibi tutarsızlıklara yol açmıştır. Bu endişeler, NSCLC'de ek kanser biyobelirteçleri (yani, TTF1, Vimentin, EpCAM ve CD44) kullanarak sağlıklı tam kandan atipik CD45(-) hücrelerinin immün-fenotipleme ile ilişkili CTC toplama son derece hassas bir yöntem için ihtiyaç vurgulamak.
Sonuç olarak, bir mikroakışkan çip aracılığıyla boyut ve plastisite dayalı hücreleri ayırmak için atalet ve Dean sürükleme kuvvetleri kullanan bir spiral mikroakışkan cihaz değerlendirildi. Dekan girdabının oluşumu mikroakışkan çipte bulunan akıntılar, iç duvar boyunca bulunan daha büyük CtC'ler ve çipin dış duvarı boyunca daha küçük bağışıklık hücreleri ile sonuçlanır. Zenginleştirme işlemi, büyük hücrelerin zenginleştirilmiş CTC fraksiyonu olarak toplama çıkışına emilmesiyle tamamlanır. Bu yöntem özellikle hassas ve spesifiktir (yaklaşık 1 CTC/mL tam kan saptanması)14 ve özelleştirilmiş immünoresans (IF) analizleri ile ilişkili olabilir. Bu araçlar klinik yorumlama için olumlu bir eşik kurulmasını sağlayacaktır. Bu nedenle biyologların yüksek iyileşme hızı ve özgüllük le immünfenotip BTC'leri izole etmelerini ve immünofopoftip BtC'leri izole etmelerini sağlayan bir iş akışı tanımlanmıştır. Protokol, spiral mikroakışkan cihazın CTC'leri toplamak için optimal kullanımını, kanser türüne göre özelleştirilebilen optimize edilmiş IF testlerini ve yarı otomatik bir performans sergilemek için hücre görüntülerini ölçmek ve analiz etmek için ücretsiz açık kaynak yazılım kullanımını tanımlar. floresan boyama göre hücrelerin numeration. Buna ek olarak, mikroskop çoklama mevcut floresan filtreler / belirteçleri sayısına bağlı olarak yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Numuneler, lyon Üniversitesi Hastanesi'nde bulunan Circan ("CIRculating CANcer") kohortu çerçevesinde, hastanın yazılı onayı ile prospektif olarak toplanmıştır. Bu çalışma CIRCAN_ALL kohortuna entegre edilmiştir. CIRCAN_ALL çalışması, 04/11/2015 tarihli L15-188 referansı altında CPP Güney-Doğu IV tarafından girişimsel olmayan olarak kabul edilmiştir. Değiştirilen sürüm 20/09/2016 tarihinde L16-160 referansı altında girişimsel olmayan olarak kabul edilmiştir. CIRCAN_ALL çalışması 01/12/2015 tarihinde, 15-131 referansı altında, Hospices Civils de Lyon'un BT ve özgürlük muhabirine ilan edilebildi. Doktorlar tümörün ilerlemesinin en erken endikasyonuna dikkat edince kan toplanması yapıldı.
NOT: Analitik numune hazırlama ve immünoffloresan teşrinatı için ilgili depolama koşullarına sahip Malzemeler Tablosu'nda özetlenen tüm reaktifleri ve malzemeleri kullanın. Reaktiflerin değiştirilmesi ve/veya depolama koşullarının değiştirilmesi, optimal inden düşük bir şekilde istinat performansına neden olabilir.
1. Spiral Mikroakışkan Cihazın Dekontaminasyonu
NOT: Spiral mikroakışkan cihazın dekontaminasyonu, bakteri kontaminasyonundan kaynaklanan tüm immünfloresans arka planının çıkarılması, CtC'lerin sitomorfolojisinin araştırılması ve normal bağışıklık hücrelerinden ayırt edilebilme zorunluluğudur. Protokol,k2EDTA tüplerinde kan örneklemesi sonrasında 6 saat içinde toplanan ve spiral mikroakışkan cihaz kullanılarak temiz koşullarda zenginleştirilmiş kan örnekleri için optimize edilmiştir. Bu tahkikatın diğer numune türleri (diğer biyolojik sıvılar) için kullanılması ek optimizasyon gerektirebilir. Bu dekontaminasyon protokolü haftada bir yapılmalıdır.
- Reaktiflerin hazırlanması
- Dilüent arabelleği hazırlanması
- 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak 20 mL dilüent katkılı reaktifi sterilize edin ve doğrudan 1 X fosfattampon salin (PBS) ultra saf kalitede (Malzeme Tablosu) doğrudan ekleyin.
- Reaktiflerin sterilizasyonu ve giriş saman
- RBC lysis tampon ve resuspension tampon (RSB; Malzeme Tablosu) her çözelti için yeni bir 50 mL polipropilen konik tüp içinde 0,22 μm şırınga filtre ve stok kullanarak.
- Çok amaçlı temizlik reaktifinde (MalzemeTablosu)1 saat oda sıcaklığında (RT) kuluçkaya yatırArak giriş pipetini sterilize edin. Pipeti çamaşır suyu bazlı temizlikmaddesine (Malzeme Tablosu) aktarın ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Giriş samanını steril PBS ile iki kez 1 saat erteleyin ve steril giriş samanını cerrahiolarak steril bir torbada saklayın (Malzeme Tablosu).
- Dilüent arabelleği hazırlanması
- Spiral mikroakışkan cihazın dekontamine edilmesi
- Çok amaçlı temizleme reaktifini kullanarak dezenfeksiyon
- Kahverengi vidayı sökerek spiral mikroakışkan cihazın dilüent portundan dilüent şişe kapağını kesin. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında, 250 mL'ye kadar çokamaçlı temizlik reaktifini (Malzeme Tablosu) yeni bir boş şişeye aktarın.
- Dilüent şişe kapağını ve samanını mikrobiyolojik güvenlik kabini altında 250 mL çok amaçlı temizleme reaktifinin şişesine vidalayın. Bu şişeyi spiral mikroakışkan cihazın dilüent portuna kahverengi vidayı vidalayarak takın.
- 100 mL'ye kadar çamaşır suyu aktarımı (%1 nihai konsantrasyon; Malzeme Tablosu) çalışma kitinde verilen atık kabına (Şekil1A).
- Giriş portundaki spiral mikroakışkan cihaza (MalzemeTablosu) yeni bir steril giriş pipeti yükleyin. Giriş portuna yeni bir 50 mL santrifüj tüp yükleyin. Çıkış portuna yeni bir 50 mL santrifüj tüp yükleyin.
- Spiral mikroakışkan cihaz (3 dk) üzerinde Prime tıklayarak spiral mikroakışkan cihaz asal devam edin. Asal tamamlandıktan sonra giriş tüpünü çıkarın.
- Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet içeren yeni 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 15 mL'e kadar çok amaçlı temizleme reaktifini aktarın ve tüpü spiral mikroakışkan cihazın giriş noktasına takın.
- Çalıştırmaya başlamadan önce, çözümün aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin. Kabarcıklar varsa, bir pipet ile yavaş aspirasyon ile kaldırın.
- Spiral mikroakışkan cihaza dekontaminasyon mikroakışkan çip yükleyin. Çalıştır'a tıklayıp Program 3'ü (31 dk)seçerek spiral mikroakışkan cihazda Bir Program 3 çalıştırın.
NOT: Spiral mikroakışkan cihazın 3. - Spiral mikroakışkan cihazın temizleme adımıile giriş tüpündeki çok amaçlı temizleme reaktifinin kalan hacmini kullanarak devam edin.
- Temizleme adımı tamamlandıktan sonra giriş tüpünü atın ve giriş samanını geride bırakın.
- Çamaşır suyu bazlı temizlik maddesi kullanılarak dekontaminasyon
- Kahverengi vidayı sökerek spiral mikroakışkan cihazın dilüent portundan çok amaçlı temizleme reaktifi şişesi kapağını kesin. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında, 250 mL'ye kadarçamaşır suyu bazlı temizlik maddesi (Tablo Malzemeler) yeni bir boş şişeye (Şekil1A) aktarın.
- Çok amaçlı temizleme reaktifi şişe kapağını ve pipeti, mikrobiyolojik güvenlik kabininin altında Bleach tabanlı temizlik maddesi içeren şişeye vidalayın. Bu şişeyi spiral mikroakışkan cihazın dilüent portuna kahverengi vidayı vidalayarak takın.
- Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet kullanarak 15 mL'e kadar çamaşır suyu bazlı temizlik maddesini 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüp giriş tüpüne aktarın. 50 mL santrifüj tüp giriş pozisyonunu yükleyin. Çıkış pozisyonunda boş bir tüp yükleyin.
- Çalıştırmayı işlemeden önce, numunenin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa pipetle yavaşça azarlayarak kabarcıkları çıkarın.
- Çalıştır'a tıklayıp Program 3'ü seçerek Program 3'ü çalıştırın (31 dk. Çalıştırmadan sonra, giriş tüpündeki çamaşır suyu bazlı temizlik maddesinin kalan hacmini kullanarak doğrudan temizleme adımına geçin.
- Giriş ve çıkış tüplerini atın.
- Spiral mikroakışkan cihazı durulayın.
- Kahverengi vidayı sökerek beyazlatıcı bazlı temizlik maddesi şişe kapağını spiral mikroakışkan cihazın dilüent portundan sökün. Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında, çamaşır suyu bazlı temizlik maddesi içeren şişedeki pipeti, dilüent tamponu içeren yeni şişeye aktarın. Şişeyi spiral mikroakışkan cihaza vidalayın.
- Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojikpipet kullanarak 15 mL'e kadar steril su (Malzeme Tablosu) 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüp giriş tüpüne aktarın. 50 mL santrifüj tüp giriş pozisyonunu yükleyin. Çıkış pozisyonunda boş bir tüp yükleyin.
- Çalıştırmayı işlemeden önce, numunenin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa pipetle yavaşça azarlayarak kabarcıkları çıkarın.
- Çalıştır'a tıklayıp Program 3'ü seçerek Program 3'ü çalıştırın (31 dk. Çalıştırmadan sonra, giriş tüpünde kalan sterilize su hacmini kullanarak doğrudan temizleme basamacına geçin.
- Giriş ve çıkış tüplerini atın.
- Çok amaçlı temizleme reaktifini kullanarak dezenfeksiyon
2. Spiral Mikroakışkan Cihazı Bakterisiz Tutmak Için Bakım
NOT: Rutin bakım son temizlik adımı sırasında günün sonunda yapılmalıdır.
- Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet kullanarak 7 mL'e kadar çamaşır suyu bazlı temizlik maddesini yeni 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Spiral mikroakışkan cihazın giriş portundaki ağartıcı tabanlı temizleme tüpünü vidalayın.
- Temiz çalıştırmayı işlemeden önce, giriş örneğinin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa pipetle yavaşça azarlayarak kabarcıkları çıkarın.
- Spiral mikroakışkan cihaz üzerinde temiz çalıştırın.
3. Hasta Kan Örneklerinden CTC'nin Analitik Öncesi Zenginleşmesi
- K2EDTA tüpünde 7,5 mL kan toplayın ve hücre sedimantasyonu ve pıhtılaşmasını önlemek için nazik ajitasyon altında tutun. 6 saat içinde işlem.
NOT: Kan, koruyucu içeren hücresiz DNA kan toplama tüpünde toplanırsa, işleme alınana kadar 4 °C'de saklayın. Zenginleştirme adımına geçmeden önce kan örneğinin, RBC lysis tamponundan ve RBS tamponundan RT'de olduğundan emin olun. - Mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik pipet kullanarak 7,5 mL'e kadar tam kanın 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüp giriş tüpüne aktarın.
- RT 10 dakika için 1.600 x g centrifuge. Buffy ceket rahatsız etmeden bir pipet ile plazma fraksiyonu toplamak. Plazma fraksiyonu değiştirerek 7,5 mL'ye kadar doğrudan eşdeğer PBS hacmini ekledi.
- Kan örneğine 30 mL (K2EDTA tüpü için) veya 37,5 mL (hücresiz DNA kan toplama tüpü için) için rbc lysis tamponu (MalzemeTablosu)ekleyin. Kan toplama tüpünü 10x'i hafifçe ters çevirin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: RBC lysis sırasında kan örneği daha koyu kırmızıya döner. 10 dakika sonra (koyu kırmızı ve opaktan) herhangi bir değişiklik gözlenmezse, tüpü 3x'i hafifçe ters çevirin ve maksimum 5 dakika daha bekletin. Numune kalitesini ve test performansını tehlikeye atabileceğinden numuneyi RBC lysis arabelleğinde 15 dakikadan fazla bırakmayın. - 500 x g'de lysed kan örneğini RT'de 10 dk, santrifüj frenleri (veya en yüksek yavaşlama hızı) ile santrifüj edin. Hacim 4-5 mL işaretine ulaşana kadar süpernatantı nazikçe çıkarmak için pasteur pipetveya serolojik pipet kullanın. Daha sonra, kalan supernatant kaldırmak için filtrelenmiş mikropipet ipuçları kullanın.
- Filtrelenmiş uçlu bir P1000 mikropipet kullanarak, 50 mL santrifüj tüp giriş tüpünün duvarına 1,0 mL RSB ekleyin. Karışıma kabarcıklar girmesini önlemek için, numune homojen olana kadar yavaşça yukarı ve aşağı borulama hücre pelet yeniden askıya.
- 50 mL santrifüj tüp giriş tüpünün duvarına 3 mL rsl daha ekleyin (toplam hacim 4 mL). Karışımiçine kabarcıklar tanıtan kaçının. Yavaşça yukarı ve aşağı boru ile hücre süspansiyon karıştırın.
NOT: Düzenli pipetlemenin hücre kümelerini parçalayamayacağı (görünür olarak veya pipet ucunu engelleyerek tanımlanan) olası durumlarda, herhangi bir kümeyi çıkarmak için numuneyi 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Filtrelemeden kaynaklanan hacim kaybını telafi etmek için örneğe 150 μL RSB ekleyin. Bu yöntemin dikkatli ve yalnızca büyük kümeler gözlendiğinde kullanılacağını unutmayın. - Zenginleştirme adımına geçmeden önce, numunenin aşırı kabarcıklardan arındığını kontrol edin ve varsa kabarcıkları çıkarın ve herhangi bir numuneyi atmamaya özen verin. Küçük kabarcıklar varsa, bunların kaldırılması gerekli değildir.
- Spiral mikroakışkan cihazda numuneyi işlayın.
4. Spiral Mikroakışkan Cihaz ile Hasta Tam Kanından CTC'lerin Zenginleşmesi
- Yeni bir spiral mikroakışkan çip yükleyin. Giriş ve çıkış portlarına iki boş 50 mL santrifüj tüpü yükleyin.
- Spiral mikroakışkan cihazda (3 dk) Prime'a tıklayarak bir asal çalıştırın. Giriş ve çıkış tüplerini çıkarın ve giriş portuna işlenecek numuneyi yükleyin.
- Zenginleştirilmiş CTC'leri toplamak için çıkış portuna 15 mL'lik net bir konik tüp yükleyin. Çalıştır'a tıklayarak ve Program 3'ü seçerek Program 3'ü çalıştırın (31 dk).
- Çıkış tüpünü ve santrifüjü 500 x g'de 10 dakika (hızlanma: 9; yavaşlama: 5). 5 mL serolojik pipetle, konik 15 mL tüpüzerindeki 2 mL işaretinde süpernatant durdurmayı kaldırın. Mikropipet ile konik 15 mL tüpte 100 μL marklıkta süpernatant durdurmayı kaldırın. Zenginleştirilmiş numuneyi doğrudan immünofloresan boyama için işle.
5. İmmünofluoresan Boyama
- Hemositometre tipi ızgara ile odacıklı bir slayt üzerinde numaralandırmak mL başına hücre sayısı. Zenginleştirilmiş numuneyi %0,2 anti-bağlayıcı çözelti(Malzeme Tablosu) ile sitospin başına 100.000 hücre/100 μL'ye ulaşan bir konsantrasyona seyreltin.
- %0,2 anti-bağlayıcı çözeltiile50 μL'lik pamuk (Malzeme Tablosu) kullanarak numune haznesinin konturunu nemlendirin. Örnek haznesine bir polilizin cam kaydırağı yerleştirin ve kapatın.
- 3 x yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak %0,2 anti-bağlayıcı çözeltisi ile bir ucu katlayın. Zenginleştirilmiş numuneyi yeniden askıya alın ve hücre çözeltisini numune odasına aktarın. 4 dakika (ivme düşük) için400 rpm özel bir santrifüj (Malzeme Tablosu) ile santrifüj.
- İfade alanının etrafına bir silikon izolatör yerleştirin. 2 dakika mikrobiyolojik güvenlik kabini altında cam slayt kurulalım.
- Fiksasyon çözeltisini 1 mL %16 paraformaldehit (PFA) ile 3 mL steril PBS seyrelterek hazırlayın. Numune başına 100 μL fiksasyon çözeltisi (%4 PFA) ekleyin ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Fiksasyon çözümünü çıkarın ve 200 μL PBS ile üç yıkama yapın ve 2 dk boyunca RT'de inkübatyapın.
DİkKAT: Soluma önlemek için kimyasal güvenlik kabini altında PFA kullanın. - Fetal büyükbaş serumu (FBS) %5, Fc reseptörü (FcR) reaktifini %5 ve sığır serum albuminini (BSA) steril PBS'de %1 oranında seyrelterek doygunluk çözeltisini hazırlayın (Malzeme Tablosu). Numune başına 100 μL doygunluk çözeltisi ekleyin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Numune başına 100 μL antikor çözeltisi ekleyin (CD45 antikor 1/20; PanCK antikor 1/500; PD-L1 antikor 1/200; Qsp doygunluk çözeltisi 100 μL) (Malzeme Tablosu). Polilizin cam kaydırağı 100 mm x 15 mm Petri kabına yerleştirin. 2 mL steril su ile emici bir kağıdı nemlendirin ve Petri kabını kapakla kapatın. Bir gecede 4 °C'ye yerleştirin ve ışıktan koruyun.
- Antikor karışımını çıkarın ve 2 dakika boyunca her yıkamada 200 μL PBS ile 3 yıkama yapın. Numunenin 5 dk kurumasına izin verin ve ışıktan koruyun. Birkabarcık yapmadan bir mikroskop kapağı ile kaplayın ve 10 μL montaj çözeltisi (MalzemeTablosu)yerleştirin. Oje ile coverslip mühür.
6. Düz Floresan Mikroskobu ve İlişkili Yazılım ile İmmünofloresan Görüntülerin Edinimi
- X/Y motorlu platformlu düz floresan mikroskop kullanın. DNA boyasına karşılık gelen dört kanalda 8 bit RGB tiff görüntüleri (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), PanCK boya (floresan izotiyosiyanat [FITC]), PD-L1 boya (CY3) ve CD45 boyası (CY5) olmak üzere 20 x bir hedef kullanın. Kullanmadan önce cıva lambasını 15 dakika açın ve mikroskobu ve ilişkili yazılımı yarı otomatik çekime uyarla.
- Cam kaydırağı platforma yerleştirin.
- Edinme menüsünde, dört kanalı tanımlayın ve pozlama süresini ayarlayın (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1.000 ms). Tmak için döşemeleri tanımlayın. Kutucuklar'ıtıklatın. Gelişmişdenemede, taymak için alanı tanımlayın.
- Ekrandaki odağı ayarlayın. Denemeyi Başlat'ıtıklatın.
- Her kanalın TIF dosyalarını dışa aktarın ve özellikle bu bilgilerle resim dosyasını adlandırın: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (örn., Sample1_TR1_c1m01). Ad boyası aşağıdaki gibidir: DAPI kanalı c1, FITC kanalı c2, CY3 kanalı c3 ve CY5 kanalı c4'tur.
7. İmmünofluoresan Görüntülerin Görüntü Analiz Yazılımı ile Analizi
- Broad Institute web sitesinden ücretsiz görüntü analizi yazılımını indirin ve kurun. Yükleme sırasında tüm varsayılan kabul edin. Görüntü analizi yazılımını açın ve Dosya'yı tıklatın | Dosyadan Boru Hattı | Analysis_4channels_CTC.cppipe.
NOT: Ardışık düzen, RGB renkli görüntüleri gri tonlama içine dönüştürür, görüntüleri ortanca filtreyle düzelterek yapıları kaldırır, çekirdekleri ve sitoplazmayı tanımlar, her kanalın floresan yoğunluklarını ölçer ve bunları bir excel dosyasına aktarır. - Dosyaları dosyalistesine bırakın. Dosyaları kutucuklara göre gruplandırmak için meta verileri güncelleştirin.
NOT: Görüntüleri gruplandırmak için tüm talimatlar yazılımda belirtilir. Ad dosyaları NamesAndTypes modülünde ortaya çıktı ve dosyalar, örnek başına renk ve kanal sayısına göre gruplandırılır. - Çıktı ayarlarını görüntüle'yi tıklatın ve doğru varsayılan çıktı belirtin. Resimleri AnalizEt'e tıklayın. Measure_intensity parametrelerine karşılık gelen elektronik tablo dosyasını açın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk ön koşul doku kültürü için kirlenmemiş (enfeksiyöz ajaniçermeyen) CTC koleksiyonlarını elde etmek ve oluşturulan IF arka planından kaçınmaktı. Dekontaminasyon protokolü tüm boru ların ve pompaların temizlenmesine olanak sağladı ve bakteriyel kontaminasyon olmadan iyi bir geri kazanım oranı ile CTC'lerin toplanmasıyla sonuçlandı. Zenginleştirilmiş numuneler spiral mikroakışkan cihazın dekontaminasyon protokolü iş akışı olmadan ve bunlarla karşılaştırıldı. Dekontaminasyon protokolünü doğrulamak için, A549 hücre hattı tam kan yokluğunda kullanıldı ve spiral mikroakışkan cihaz kullanılarak doğrudan zenginleştirildi. Optimize edilmiş dekontaminasyon protokolü olmadan, zenginleştirilmiş A549 hücre hattının doku kültüründe sadece 24 saat sonra yüksek bakteriyel kontaminasyon gözlenmiştir ve bu da ökaryotik hücrelerde ölüm ve sitomorfolojik değişikliklere neden olur (Şekil1B).
Buna karşılık, temizlik protokolünden sonra, doku kültürü ve ortam çıkarma 10 saat sonra 2D kültürde büyüyen ve 3Boyutlu koşullarda (Şekil1B), hasta örnekleri (Şekil1C) yaşayan A549 hücreleri elde edildi. Potansiyel CTC bir kırmızı haç ile tanımlanır (Şekil 1C).
Şekil 2, tam kandan zenginleştirilmiş KTK'ların immünororesans fenotimi için tüm iş akışını yeniden özetler. Dört ana adımdan oluşur: tam kan örnekleme, CTC zenginleştirme, immünfloresans (IF) tahlil ve yazılım kullanarak görüntü analizi. Daha önce spiral mikroakışkan cihazın iyileşme hızı14'ehitap etmiştir. Floresan taklit CTCs (mCTC) kullanılarak, bu iyileşme oranı 1.3 CTCs/mL tam kan14olarak belirlenmiştir.
Bu çalışma, zenginleştirilmiş CTC'lerin IF analizi ve aşağı akış görselleştirmesi için en uygun koşulları niçin ayarlamaya odaklanmıştır (Şekil2). İlk olarak, PD-L1 antikor özgüllüğünü test etmek için iki hücre hattı kullanılmıştır: (1) PC3 yüksek pozitif-PD-L1 hücre hattı ve (2) SW620 düşük pozitif-PD-L1 hücre hattı. Hücreler daha sonra spiral mikroakışkan cihaz ile zenginleştirildi ve IF tarafından analiz edildi. Tüm hücreler tümör anti-PanCK belirteci, beyaz kan hücresi anti-CD45 belirteci, anti-PD-L1 (akciğer kanserinde yararlı) ve DAPI (nükleer boya) ile lekelendi. Beyaz kan hücreleri DAPI ve CD45 pozitif olarak tanımlanırken, kanser hücreleri DAPI ve PanCK pozitif, CD45 negatif olarak saptandı. PC3 yüksek PD-L1-pozitif hücre hattı PD-L1 için pozitif olarak lekelenmiş, SW620 düşük PD-L1-negatif hücre hattında daha düşük bir PD-L1 ekspresyonu saptanır.
Daha sonra, aşağıdakiler karşılaştırıldı: (i) sıvı IF boyama teşbiyeti, (ii) ctc'lerin doğrudan polilizin kaplı slaytlara yatırılması ve (iii) polilizin kaplı slaytlarda sitospin sonrası CTC'lerin boyanması. CtC'lerin iyileşme hızının kullanılan protokol türüne bağlı olduğu açıkça görülmüştür (Şekil3A). Sıvı IF boyama sataşa, ani mCTC sayısı için iyileşme oranı sadece% 10 en düşük oldu. Bu düşük iyileşme oranı metastatik NSCLC olan hastaların çoğu için bir sorun teşkil, önemli ölçüde birkaç CTCs izole etmek ve henotypik bilgi sağlamak için bu testlerin yeteneğini sınırlar gibi. Açıklanan ikinci ve üçüncü bölümlerde (mCTC veya CTC'nin sitopsin içermeyen ve sitopsinli polilizin kaplı slaytlara doğrudan birikmesi) sistematik olarak %60'ı aşan iyileşme oranları vardı (Şekil3A).
Şekil 3 B, aynı hastadan alınan tam kan örneklerini kullanarak bu IF testlerinin temsili görüntülerini gösterir, ya sıvı IF boyama tahlillerini kullanarak ya da sitospin li polilizin kaplı slaytlarda IF boyama tahlillerini kullanır. Çekirdeklerin numaralandırması iki tahlil arasında açıkça farklıydı (Şekil 3B). Nükleer DAPI boyama, numunedeki toplam hücrelerin numaralandırılmasını sağladı ve biyomarker boyama yeşil PanCK pozitif hücrelerin, PD-L1-pozitif hücrelerde turuncu ve CD45 artık beyaz hücrelerde kırmızının vurgulanmasına olanak sağladı (Şekil3 B).
Daha sonra, sitolojik olarak tümöral hücrelerden beyaz kan hücrelerini ayırt etmek için, çekirdek şekli görselleştirilmesi gerekir, hücre tipinin karakteristik olduğu için. Şekil 3 C, sitospin adımının yokluğunda alışılmadık bulanık ve morfoloji olan çekirdeklerin ana hatlarını gösterir. Böylece optimize edilmiş protokol, if boyama dan önce slaytların korunması için % 4 paraformaldehit (PFA) fiksasyonu nun ardından polilizin kaplı slaytlarda zenginleştirilmiş CtC'lerin sitospinningini içeriyordu. Bu optimize edilmiş protokol, çok az hücre eklendiğinde bile doğrudan polilizin kaplı slaytlara (Şekil3A)mCTC'nin birikintiolarak benzer kurtarma hızlarına sahipti. Bu ek adım nükleer morfolojinin korunmasına olanak sağladığından (Şekil3C), granülositler çok loblu çekirdekleri ile özdeşleşmiştir, ayrıca tümöral hücreler (çekirdekte kırmızı haç ile etiketlenmiş) anormallikler, malignite paternleri, ve beyaz kan hücrelerine göre daha büyük boyutu.
IF protokolünün optimizasyonundan sonra metastatik hastaların tam kanı kullanılarak bir kavram kanıtı yapılmıştır. Numuneler, Lyon Üniversitesi Hastanesi'ndeki CIRCAN rutin kohort çerçevesinde prospektif olarak toplanmıştır. Kan toplama genellikle hekimler tümör progresyonunun erken endikasyonu gözlendiğinde yapıldı. Tüm tümör olguları ilk tanı sırasında FFPE biyopsi sidris örneklerinde histolojik veya sitolojik olarak doğrulandı. Burada, klinik verilere erişimi veya ön bilgisi olmayan araştırmacılar tarafından progresyon da CTC analizleri yapılmıştır. Ayrıntılı analitik öncesi hususlar daha önce15yayınlanmıştır .
Şekil 4, Tablo 1ve Tablo 2'de hasta örneklerinden farklı bulgular sunulmuştur. CD45(+), PanCK(-), PD-L1(-) profili bağışıklık hücrelerini temsil eder. Beyaz kan hücrelerinin artık sayısı güçlü değişken ve tam kan örneğine bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu küçük pilot kohorttaki aralık 648-11.000 beyaz CD45(+) hücreydi (Şekil5A). Sonuç olarak, CTC zenginleştirme hemen sonra, toplanan hücrelerin bir numaralandırma 100.000 hücre / sitospin yoğunluğu (bkz. bölüm 6) sitospin alanında hücresel yoğunluğu ayarlamak için dahil edildi. Bu, hasta başına birkaç sitospin performansı ve manuel numaralandırma ve görüntü analizi yazılım boru hattı kullanımı için mikroskobik gözlem optimizasyonu sağladı.
Şekil 4A-C, Tablo 1ve Tablo 2'de, kalıntı beyaz kan hücresi sayılarının oldukça farklı olduğu tipik olgular bildirilmiştir:
(i) İlk profil Şekil 4A'da sunulan CD45(-), PanCK(+) ve PD-L1(+) dir. Genellikle hücrelerin büyüklüğü çapı 13 μm üstündür ve çekirdek morfolojisi düzensizdir, malignitenin sitomorfolojik paterni temsil eder. Bu popülasyon büyük olasılıkla CTC oluşur.
(ii) İkinci profil CD45(-), PanCK(-) ve PD-L1(+). Daha önce bildirildiği gibi, tüm CtCs PanCK biyomarker ifade (Şekil4A).
(iii) Üçüncü profil CD45(-), PanCK(+) ve PD-L1(-). Daha önce bildirildiği gibi, tüm CtCs PD-L1 biyomarker ifade.
(iv) Dördüncü profil Şekil 4B'de sunulan CD45(+), PanCK(+) ve PD-L1(+) dir. Hastanın tam kana atipik aktif bağışıklık hücrelerini temsil eder. Bu popülasyon çeşitli yayınlarda tanımlanmıştır16,17,18 ve zenginleştirme aşağıdaki toplam hücrelerin yaklaşık% 5 temsil eder. CD45 sinyalinin yoğunluğu çok düşükse ve çekirdeğin morfolojisi iyi korunmuyorsa, bu popülasyonun varlığı bir örnekteki yanlış pozitif KT'lerin oranını artırabilir. Bu, bu immünoresans tadında Vimentin ve/veya Epcam gibi tamamlayıcı tümöral biyomarker boyama nın gerçekleştirilmesi gereğini kuvvetle vurgulamaktadır.
(v) Son olarak, son profil, Şekil 4C'de vurgulanan CD45(-), PanCK(-) ve PD-L1(-) etiketli olmayan hücreleri içerir. Bu popülasyondaki çekirdek genellikle malignitenin sitomorfolojik paternlerini gösterir ve boyutu çapı 13 μm'nin üzerindedir. Örneklerdeki bu hücrelerin yüzdesi hastanın tam kanına göre oldukça değişkendir. Bu, bu hücre alt popülasyonunun tümöral paterni doğrulamak için tamamlayıcı tümöral biyobelirteçlerin kullanılması gereğini vurgular.
Tablo 1 ve Tablo 2'de ileri metastatik NSCLC hastalarından 16 örnek hücre sayısı bildirilmiştir. Hücreler biyobelirteçlerin ekspresyonuna göre sınıflandırıldı. Elde edilen alt popülasyonlarda yüksek değişkenlik gözlendi. Bağımsız çalışmalarda da bildirildiği gibi çoğu örnekte CD45(-), PanCK(+) ve PD-L1(+) profilleri bulunmuştur. Bununla birlikte, CTC popülasyonu son derece heterojen olduğundan, hasta örnekleri nde CD45(-), PanCK(-) ve PD-L1(+) alt popülasyonları, CD45(-), PanCK(+) ve PD-L1(-) alt popülasyonları ve CD45(-), PanCK(-) ve PD-L1(-) içeren cd-L1(-) hücreler de bulunur. alt popülasyonlar. Analiz edilen örnekler arasında artık beyaz kan hücrelerinin düzeyi oldukça değişkendi.
Hücre numaralandırmasını kolaylaştırmak için, immünoresans görüntülerinin otomatik analizi için görüntü analiz yazılımı kullanılarak bir pilot boru hattı kuruldu. İş akışı Şekil5'te açıklanmıştır. Bu durumda kontrast ve floresan yoğunluğu açısından yüksek kaliteli immünoresans görüntüleri elde etmek önemlidir. Donanımın küme hesaplama kapasitesine bağlı olarak, görüntü çözümleme ardışık lığı sitospinin tam birleştirilmiş görüntüsüne veya sitospinin temsili bir alanına uygulanabilir.
Burada, mikroskopa dayanarak, sitospinin yarı otomatik bir taraya teşbibi (X/Y; Z odağı dahil değildir) alanı 150-200 birleştirilmiş görüntü oluştursun. Bu görüntüler birleştirilebilir ve görüntü analizi ardışık alanı kullanılarak doğrudan analiz edilebilir. Bununla birlikte, bu prosedür zaman ve hesaplama küme kaynak tüketen, laboratuvarlarda rutin kullanımı için önemli bir sınırlamadır. Bu nedenle, hücresel hematoloji alanındaki önceki deneyimlere dayanarak, her bir numunenin temsili alanlarının mikroskop altında sitospinin tüm alanında homojen olduğunu doğruladıktan sonra analiz ine karar verildi. Daha sonra, situsun toplam alanının %25'i (yaklaşık 40 karo) floresan mikroskobu ile tarayarak 40 x 4 bağımsız görüntü elde etti. Birleştirilen dosya kanallara bölündü ve görüntü dosyaları mikroskop yazılımıyla otomatik olarak oluşturuldu (bkz. bölüm 7; Şekil 5 A). Bu dosyalar, açıklanan parametrelere göre analiz için görüntü analizi boru hattına aktarıldı (bkz. bölüm 8; Şekil 5 A).
Şekil 5B'de, 77 bağışıklık hücresi [CD45(+), PanCK(-) ve PD-L1(-)] arasında dört CTC [CD45(-), PanCK(+) ve PD-L1(+)] görüntüleyen temsili bir görüntü el ile tanımladık. Şekil 5 B, görüntü analizi yazılımının DAPI boyamaya dayalı hücre sayısını nasıl tanımladığını ve numaralandırmasını göstermektedir. Ayrıca, görüntü çözümleme yazılımının ikincil nesneleri nasıl saydığını da gösterir. Son olarak, görüntülerde bildirilen tüm nesneler için her floresan kanal için floresan yoğunlukları bildirilmiştir.
Arka plan, örnekte bulunan negatif hücreler tarafından hesaplandı ve temsil edildi. Örneğin, aktive olmayan bağışıklık hücreleri düşük floresan yoğunluğuna sahiptir ve PanCK ve PD-L1 boyama arka plan ölçüm etkin. Floresan sinyali, floresan yoğunluğu arka plandakinin kini iki kat aşarsa (dört bağımsız hasta örneğinin analizine göre) pozitif kabul edildi. CD45 boyama ile ilgili olarak, CD45 ifade düzeyi beyaz kan hücreleri alt popülasyonlarında son derece değişken olduğundan, pozitiflik eşiği mümkün olduğunca düşük olarak belirlenmiştir. Cd45 antikorile boyanmış 10 sağlıklı tam kanın görüntülerinin analizine dayanıyordu. Pilot analiz (n = 4) manuel numaralandırma ve görüntü analizi yazılımı numaralandırma sı (Tablo2)arasında uyum gösterdi. Situptaki her hücre görüntü analizi yazılımı tarafından tanımlanır ve biyologların hücreyi izlemelerine ve gerekirse sonuçları el ile onaylamalarına olanak tanır.
Şekil 1 : Dekontaminasyon için iş akışına genel bakış spiral mikroakışkan cihaz alet. (A) Dekontaminasyon işlemine dahil edilen üç ana adım (protokole bakınız), enstrümanın giriş ve çıktılarının yerelleştirilmesini gösteren. (B) A549 hücre hattı zenginleştirme sinden önce ve sonra cihazın dekontaminasyonundan önceki ve sonraki temsili görüntüler. Toplanan hücrelerin canlılığı ve morfolojisi üzerinde bulaşıcı bir ajanın varlığının etkisi gösterilmiştir. Bakteri varlığında hücre morfolojisi ve canlılık değiştirildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) akciğer, prostat ve meme kanseri zenginleştirilmiş hasta örneklerinin 3D hücre kültürü. Kırmızı haç atipik hücrelere karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Tam kan örneklemesinden floresan görüntülerinin analizine kadar immünfloresans analizinin iş akışına genel bakış. Önemli adımlar aşağıdaki gibi gösterilmiştir: tam kan için kan toplama, spiral mikroakışkan cihaz ile CTC toplama, immünoresans tahlil, ve görüntü analizi yazılımı. Biyomarker seçimi sitospin slayt (immün hücreler için CD45, Akciğer kanseri hücreleri için PanCK ve PD-L1) gözlemlenebilir hücrelerin çeşitli popülasyonlarının daha iyi belirlenmesi ile tahrik edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Üç bağımsız boyama protokolünün geri kazanım oranı. (A) Sıvı boyamadan mCTC'lerin geri kazanım oranının karşılaştırılması, polilizin kaplı slaytlara yatırılan hücrenin doğrudan boyanması ve polilizin kaplı slaytlarda sitospin sonrası hücre boyama. (B) Sıvı IF protokolü ve sitospinstep ile doğrudan immünboyama protokolü ile işlenen hasta örneklerinin temsili görüntüleri. Hücreler CD45 monoklonal antikor (klon HI30) Alexa Fluor 647 ile boyandı; PanCK monoklonal antikor (klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) Sitospin adımlı ve sitospin siz hücre zenginleştirme DAPI boyama temsili görüntüler. Çekirdeklerin morfolojisi ve büyüklüğü DAPI boyama kullanılarak gösterilmiştir. Kızıl haç, sağ daki görüntüde çekirdekteki anormallikleri olan hücreleri vurgular. Sol daki görüntüde, hücreler aynı düzeyde olmadığından (x-, y-ve z-eksenleri) görüntü bulanıktır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : Hücre profillerinin tanımlanması. (A) Farklı CTC profillerine sahip hastaların temsili görüntüleri. Floresan kanalları ayrı olarak sunulur. Birleştirilmiş görüntüler solda gösterilir. Onlar CD45 monoklonal antikor ile boyanmış (klon HI30) Alexa Fluor 647; PanCK monoklonal antikor (klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 monoklonal antikor (klon 29E2A3) phycoerythrin; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); oklar atipik hücreleri işaret eder. (B) Atipik beyaz kan hücresi profilleri ile iki hasta örneğinin immünboyamı temsili görüntüler. Hücreler CD45 monoklonal antikor (klon HI30) Alexa Fluor 647 ile boyandı; PanCK monoklonal antikor (klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 monoklonal antikor (klon 29E2A3) phycoerythrin; 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Görüntü, CD45(+), PanCK(+) ve PD-L1(+) ile boyanmış bağışıklık hücrelerinin varlığını vurgular. (C) Görüntü, etiketlenmemiş hücrelerin (CD45(-), PanCK(-) ve PD-L1(-) varlığını vurgular. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 : Floresan görüntülerin analizine genel bakış. (A) Ana adımlar açıklanmıştır: mikroskopi tarama, kanal floresan göre bölünmüş ve görüntü analizi yazılımı içine dosyaların içe aktarılıyor. (B) Görüntü analizi yazılımının iş akışı için üç farklı adımın açıklaması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Hasta hücre zenginleştirme manuel numaralandırma. DAPI boyama dayalı hücrelerin numaralandırma. FITC, PE ve CY5 boyama dayalı diğer nesnelerin numaralandırma.
Tablo 2: Görüntü analiz yazılımı hasta hücre zenginleştirme numaralandırma . DAPI boyama dayalı hücrelerin numaralandırma. FITC, PE ve CY5 boyama dayalı diğer nesnelerin numaralandırma. Manuel sayım ve görüntü analizi yazılımı numaralandırma karşılaştırması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, ilki klinik uygulamalara aktarılması için iş akışının performansı, ikincisi ise elde edilen floresan görüntülerinin analizinde öznellik azalması ile ilgili iki önemli nokta ortaya konmuştür.
CTC numaralandırma için bir performant ve optimize edilmiş iş akışı başlangıçta ctc etiketsiz mikroakışkan sistem (spiral mikroakışkan cihaz) ile hücre zenginleştirme sonrası özelleştirilebilir IF tahlili kullanılarak belirlendi. Bu iş akışını kullanarak, bir pilot çalışma metastatik NSCLC hastalarından alınan tüm örneklerin tüm CD45(-) atipik hücreler içerdiğini doğruladı. Bunlar alternatif olarak PanCK ve/veya PD-L1 biyobelirteçleri ile etiketlenebilir; ancak, s19 örneğinde (Tablo2)]' de gözlenen tüm test edilmiş biyobelirteçler [CD45(-), PanCK(-) ve PD-L1(-) için de tamamen negatif olabilir. Bu, btc alt popülasyonları için ek biyobelirteçihtiyacını kuvvetle vurgular. Sonuç olarak, EpCAM, Vimentin ve N-Kadherin gibi epitel-mezenkimal biyobelirteçler eklemek için önerilmiştir; CD44 ve CD133 dahil olmak üzere kanser kök hücrelerinin belirteçleri; akciğer adenokarsinomu için TTF1 dahil olmak üzere spesifik tümör belirteçleri.
Pilot çalışmada, atipik hücre aralığı [40; >400] tam kan 3.5 mL idi. Hasta örneklerinin %80'inde atipik hücre sayısı 50'nin üzerindeydi. Nitekim, sitolojik19,20,Endo Bronşiyal Ultra Sonic Guide Trans Bronşiyal İğne Aspirasyonu veya CT güdümlü trans-torasik ponksiyon2 11 1 adet örnek, PD-L1 analizi örneklerin çoğunda uygundur, ancak ≥100 tümör hücrelerinin eşiği genellikle değerin istatistiksel ve klinik yorumunu üretmek için kabul edilir. Ancak, kan BtC'lerinin özel bir durumda, bu mekansal tümör heterojenite sorunu küçük yerinde tümör örnekleri aksine atlanır unutulmamalıdır.
İkinci nokta immünoresans görüntülerinin analizi üzerinde işleyici etkisiönlemek oldu. Böylece hücre numaralandırmasını standartlaştırmak ve bu örnekler için istatistiksel veriler sağlamak için floresan görüntülerin görüntü analiz yazılımı kurulmuştur. Bu otomatik işlem, aynı örnekte bulunan tüm hücrelerin analizi için güçlü hesaplama kümelerine duyulan gereksinimi vurgulamıştır. Buna ek olarak, IF boyama kalitesi aynı düzlemde olmalıdır (konfokal sistemlerin kullanımını önlemek için) ve sitospin üzerindeki hücrelerin yoğunluğu görüntü analiz yazılımı slayt üzerinde ayrı ayrı tüm hücreleri tanımak sağlamak için kalibre edilmelidir. Son olarak, sonuçlar hastaların bir kohort klinik sonuçları ile ilgili doğrulanmadı, ancak bu nokta başka bir özel çalışmada ele alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jean-Philippe Aurel ve Kathryn Weiqi Li bu makalede kullanılan aletleri üreten Biolidics şirketin çalışanlarıdır. Diğer yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma AstraZeneca (Londra, Birleşik Krallık), Biolidics (Singapur) ve Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Fransa) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Yazarlar AstraZeneca ve Biolidics şirketlerine mali desteklerinden ötürü teşekkür ediyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
